酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵吴英玲 10197020 10生物创新班摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。
将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4 ℃下保存。
用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。
并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。
采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。
关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentationability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。
前言酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。
一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。
酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。
酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。
此作用即酒精发酵。
C6H12O6(葡萄糖)→2 C2H5OH(酒精)+2 CO2↑在酿酒酵母酒精发酵的生产和应用中，由于细胞破碎和酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。
而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。
微生物细胞固定化方法主要有三种：载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是目前比较理想的方法。
包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。
目前，利用聚乙烯醇（PVA）—海藻酸盐是包埋法中比较高效的一种，这种方法以PVA-海藻酸钠作为混合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。
1.材料与方法1.1 材料1.1.1材料与试剂成熟葡萄皮、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、豆芽、去离子水、PVA 、海藻酸钠、CaCl2、红糖、异丙醇、乙醇、液氮、Taq酶、dNTPs、引物、酵母膏，葡萄糖，(NH4)2SO4，K2HPO4•3H2O，MgSO4•7H2O、H2SO4 ，1% K2Cr2O7 ，10% NaOH等1.1.2培养基乳酸豆芽葡萄糖培养液：豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g）, pH 值4.5 。
YPG培养基（500 ml）：酵母膏（5 g）、蛋白胨（10 g）、葡萄糖（10 g）、琼脂（10 g）、pH值6.5～6.8。
TTC上层培养基：TTC 0.05 g、葡萄糖0.5 g、琼脂1.5 g、水l00 ml。
酒精发酵培养液：红糖100 g， (NH4)2SO4 2.0 g，KH2PO4 1.0 g，pH自然，去离子水定容至1000 ml。
1.1.3 实验器材酒精计、试管、杜氏小管、移液枪、滴管、显微镜、三角瓶、烘箱、烧杯、PCR仪，电泳仪、、接种环、电磁炉、报纸、橡皮筋等、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、纱布、瓷缸、刮铲、载玻片、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片1.2 实验方法1.2.1 酵母菌的分离与培养取葡萄皮于90 ml无菌水，放置于摇床150 rpm，摇晃5 min，取出后稍静置。
用无菌枪头吸取上清液1 ml接入9 ml的乳酸豆芽葡萄糖培养液中，置28～30℃烘箱中培养48小时。
富集后用碘液染色后镜检。
然后用接种环在事先灭菌的YPG固体划线并置于28～30 ℃再培养48 h，得到酵母初筛单菌落，观察菌落，用碘液简单染色镜检。
1.2.2 发酵菌株的筛选向划线分离的YPG培养基上倒入TTC上层培养基，30 ℃下保温(阴暗处)2～3 h。
比较各菌株间的颜色深浅，颜色深的菌株呼吸酶活力强，有较强的产酒精能力。
选取平板中对应的颜色较深的10株菌，作为二级筛的出发菌株。
选取上述显色较深的酵母菌落，挑取一接种环接入乳酸豆芽葡萄糖培养液中，同时试管内倒置一杜氏小管，培养24 h后，观察杜氏管中产气情况。
打开棉塞，嗅闻是否有酒精气味。
记录产气及酒精气味情况，并与显色情况进行比较。
1.2.3 发酵菌株的鉴定进行形态学鉴定：A．菌落形态观察，按普通微生物实验指导书观察所分离的真菌菌落特征。
B. 细胞形态学观察，按普通微生物实验指导书简单制片法观察，先低倍镜，后高倍镜观察。
分子生物学鉴定：主要对核糖体小亚基16SrRNA进行PCR扩增鉴定，挑取形态学观察符合酵母特征的菌落作为扩增模版进行PCR，PCR体系(25ul)为：表一 PCR反应体系ddH2O10×PCR buffer（without MgCl2）MgCl2 (25 mM)dNTP(10 mM)5’primer(10 mM)3’primer(10 mM)Template（50 -500 ng/μl）Taq DNA polymerase(5U/μl)34.6 μl5 μl4 μl1 μl2 μl2 μl1 μl0.4 μlTotal 50 μl94℃预变性 5 min94℃变性 30 sec52℃退火 30 sec 40个循环72℃延伸 60 sec72℃延伸 5 min4℃保温（到达此温度时停止PCR扩增，将PCR管取出）将符合要求的样品，按公司测序订单要求填写。
测序结果登陆NCBI网站，进行在线比对分析。
1.2.4酿酒酵母细胞PVA-海藻酸钠固定化技术菌种活化：挑取酵母菌斜面菌种一环，接1环斜面菌苔于装有20mL培养基的150mL三角瓶中活化，置于恒温摇床内，150r/min培养24 h，25 ℃培养30 h。
再将其用0.85%生理盐水制成菌悬液，酵母数控制在108个/ml。
固定化：聚乙烯醇PVA-海藻酸钠混合胶于无菌烧杯中加热融化，冷却至45 ℃左右。
酵母菌液（预热至35 ℃左右）与聚乙烯醇PVA-海藻酸钠按1: 4比例（v/v）混合均匀后，制备固定化细胞。
用注射头直径为2 ml注射器以恒定速度滴到250 ml三角中，瓶中预先盛有50 ml的含2 % CaCl2溶液使形成凝胶珠。
然后取60粒凝胶珠加入150 ml无菌葡萄糖培养液中，置25 ℃下发酵4d，测定其酒精含量。
2.结果与分析2.1 发酵菌株初筛结果将葡萄皮中的酵母菌进行富集培养后酵母菌生长迅速，在液体培养基中比霉菌生长得快。
不同组材料来源不同，结果显示葡萄皮中的酵母菌数量较多。
故而在酒精发酵中，酵母菌选择的来源非常重要。
在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌，48h后观察菌落。
图一菌落呈乳白色，表面湿润、粘稠，易被挑起。
图二为高倍镜下观察到的酵母菌，箭头处明显观察到酵母菌的出芽生殖方式，几乎呈链状。
图三为平板划线后分离单菌落。
图发酵菌株初筛结果2.2 TTC法筛选酵母及酵母产气情况TTC(2，3，5一氯化苯基四氮哇)是一种显色剂，它对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母中呼吸酶活力的大小，在YPG培养基上覆盖TTC上层培养基培养后出现深红色菌落，说明该菌株产酒精能力较强。
酵母进行酒精发酵过程会产生CO2，根据杜氏小管中产气多少可以间接判断酵母发酵能力的强弱。
再进一步挑取红色较深的菌落进行产气检验发现杜氏小关中气体较多，进一步说明所筛选的菌株具有较强的发酵能力，可以进行后续操作。
图四TTC法筛选正面图，图五为TTC法筛选反面，图六产气检验结果。
由第四管看出，CO2仍在不断产生气体，故而在后续操作中用此管中的酵母菌进行操作。
图 TTC法筛选酵母及酵母产气情况表二酵母菌落显色深浅与杜氏小管中产气多少之间的关系管号颜色产气量1号粉红++2号红+++3号粉红+4号深红++++2.3 分子生物学鉴定挑取发酵能力较强的菌落进行菌落PCR，电泳结果如图七，条带约为450bp，可以进行测序。
测序结果登陆NCBI网站，进行在线比对分析。
该序列与编码Irpex lacteus isolate T2b（Han,G., Feng,X. and Tian,X）的18S rRNA基因的部分序列有57%的相似度。
图八和图九为序列比对结果。
(此处仅展示分子生物学鉴定方法)图菌落PCR结果图序列比对结果2.4酿酒酵母细胞PVA-海藻酸钠固定化打开固定化细胞发酵的三角瓶，与未加凝胶珠的瓶子对比，嗅闻有酒香气，上层溶液有浑浊，凝胶珠形状是完好无损。
与其他组实验结果进行比较，从而选出酒精浓度最高一组，进行旋转蒸发获得高浓度酒精。
3.讨论与反思（1）本实验采用平板分离酵母菌时，培养时间不应该过长，因为长时间培养增加了染霉菌的可能性（图三），并且若需得到纯度较高的酵母菌则需进一步进行平板划线分离酵母菌菌株。
因此控制霉菌生长很重要，可采取多步平板划线的方式克服此难关。
（2）富集培养后需对溶液中酵母进行死活统计，从而初步判断此次富集的酵母菌的生存能力是否满足工业酵母生存能力。
死活统计的方法有0.l%美蓝染色液染色法，活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色。
（3）表一中总结出TTC染色后，菌落颜色深浅和产气量的关系，颜色越深，产气量越多，故在后期酒精发酵时应挑取菌落颜色深的，提高酒精产量。
