免疫染色一抗稀释液

北京雷根生物技术有限公司
Western 一抗稀释液
简介：
Western 一抗稀释液(Primary Antibody Dilution Buffer)可以用于免疫印迹中的一抗的稀释和配制。

使用Leagene Western 一抗稀释液配制的一抗，可以在4℃保存6个月，并且可以反复多次使用。

组成：
操作步骤(仅供参考）：
1、 根据一抗的使用说明，以及样品中目的蛋白含量，按照适当比例(例1:1000、1:500等
比例)稀释一抗。

2、 直接用于Western 孵育膜。

一次Western 结束后，可以回收稀释的一抗4℃保存，用
于下次Western 实验。

注意事项：
1、 为了能使抗体可以反复多次使用，建议尽量在4℃条件下进行一抗和蛋白膜的结合反
应，以减缓一抗的衰减速度。

2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

编号 名称 PW0040 PW0040 Storage Primary Antibody Dilution Buffer 50ml 100ml 4℃ 使用说明书
1份。

北京雷根生物技术有限公司
Western 一抗稀释液
简介：
Western 一抗稀释液(Primary Antibody Dilution Buffer)可以用于免疫印迹中的一抗的稀释和配制。

使用Leagene Western 一抗稀释液配制的一抗，可以在4℃保存6个月，并且可以反复多次使用。

组成：
操作步骤(仅供参考）：
1、 根据一抗的使用说明，以及样品中目的蛋白含量，按照适当比例稀释一抗。

2、 直接用于Western 孵育膜。

一次Western 结束后，可以回收稀释的一抗4℃保存，用于下次Western 实验。

注意事项：
1、 为了能使抗体可以反复多次使用，建议尽量在4℃条件下进行一抗和蛋白膜的结合反应，以减缓一抗的衰减速度。

2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：12个月有效。

相关：
编号 名称 PW0040 PW0040 Storage Primary Antibody Dilution Buffer 50ml 100ml 4℃ 使用说明书
1份 编号
名称 DC0032
Masson 三色染色液 PE0103
Acr-Bis (30%,29:1) PT0001
BCA 蛋白定量试剂盒 PW0041
Western blot 二抗稀释液 PW0046
Western 封闭液 TO1013 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA 比色法)。

1.接蒸馏水1L2.PBST配置：PBS ：Tween20=1000：1 （PBS 2000mL-其中用1000mL配PBST）3.30%的过氧化氢配成3%的过氧化氢(200ml）4.配DAB 第二天配(1滴:1000ul)5.一抗稀释（当天用当天配）第一天1．烤片：石蜡切片，烘烤箱内60度，3到5小时（目的使组织与玻片牢固结合）2．脱蜡：二甲苯(10min×3)3．复水：无水乙醇5min×3，然后95%，75%，50%乙醇各5min。

(目的是利用乙醇的双溶性，使得切片跟后续的水溶性实验体系相容）4．自来水冲洗5min，蒸馏水浸泡5min5．抗原修复：热修复（目的是将抗原表位暴露，使得后续的一抗可以结合上去）。

①配置修复液：修复液主要有柠檬酸钠缓冲液（pH=6.0），EDTA（pH=8.0）和TE（pH=9.0）三种，其酸碱度不同，不同抗体的要求不同，要根据抗体和试剂的说明书来配；②高压锅：半锅抗原修复液，蒸汽鸣笛开始算时间，进行3min，5mim，10min，15min进行摸索时间（如果是电热锅从沸腾开始算时间，修复时间要久一些）。

煮完自然冷却。

6.洗涤：①蒸馏水5min，②PBST：3min × 2 ③ PBS：3min× 17.免疫组化笔画圈：切片置于湿润操作盒上。

（若要破膜的话，移液枪滴0.3%Triton溶液于标本上45min）8.淬灭（阻断）:（目的去除内源性过氧化物酶），30%过氧化氢加蒸馏水配成3%溶液，切片浸泡15min。

9.洗涤：①PBST：3min × 2 ② PBS：3min× 110.生物素阻断，依次滴A，B剂切片浸泡，各10min，依次洗涤：①PBST：5min × 2 ，②PBS：5min× 111．封闭（目的为了减少二抗与组织的非特异蛋白结合，需用二抗来源的血清进行封闭）。

羊血清，移液枪。

免疫荧光染色稀释抗体免疫荧光染色是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定细胞或组织中的特定蛋白质。

这种技术利用免疫学原理，结合荧光染料，使特定抗原以荧光信号的形式显现出来。

稀释抗体在免疫荧光染色中起着非常重要的作用，是实现染色成功的关键。

稀释抗体是指在染色过程中需要将所用的抗体进行适当的稀释，以达到较高的特异性和敏感性。

稀释抗体的关键是确定合适的稀释倍数，使得抗体能够充分结合目标抗原，同时阻断非特异性结合。

本文将从稀释抗体的选取和稀释倍数的确定两个方面来探讨免疫荧光染色中稀释抗体的重要性。

首先，稀释抗体的选取非常关键。

在选择稀释抗体时，需要考虑到抗体的来源、纯度以及特异性等因素。

一般来说，购买商业化的抗体更加方便，但需要确保其从可靠的供应商购买，并验证其在其他实验中的可靠性。

此外，可以选择在实验室内进行抗体制备，通过免疫小鼠或小动物获得抗体。

抗体的纯度也是选择稀释抗体的重要指标之一。

纯度越高的抗体在稀释过程中的非特异性结合风险越低。

常见的抗体纯度检测方法包括SDS-PAGE凝胶电泳、Western Blot等。

若所用的抗体具有较高的非特异性结合，可能会导致染色结果的假阳性，从而影响实验的准确性。

其次，稀释倍数的确定是稀释抗体的另一个关键环节。

一般来说，稀释倍数的确定需要先进行初步的优化实验，以找到最佳的抗体稀释倍数。

常用的稀释倍数从1:50到1:200不等，具体需要根据实验中的情况来确定。

在初步的稀释实验中，可以设置不同的抗体稀释倍数，将其分别加入已固定的细胞或组织样本中，观察染色结果的强度和特异性。

一般来说，若抗体过度稀释，可能导致信号强度过弱，难以观察到目标抗原的区域；而若抗体过度浓缩，则可能出现非特异性结合和背景信号过高的问题。

通过逐步调整稀释倍数，最终选择出最佳的抗体稀释倍数。

这个倍数能够既保证抗体与目标抗原的高特异性结合，又使背景信号尽量降低，从而得到清晰可辨的染色结果。

不同细胞或组织类型对抗体的表达和结合情况有所不同，因此需要在不同样品中进行优化。

抗体稀释液和ELISA相关溶液的配制1、抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/L pH7.2PBSNaH2PO4·2H2O 0.39克Na2HPO4 1.27克NaCl 0.85克NaN3 200mg H2O（蒸馏水）至1000ml2、ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液p H7.4，PBSTNaCl 2.0克KH2PO4 0.2克Na2HPO4·12H2O 2.9克KCl 0.2克NaN3 0.2克H2O 至1000ml 吐温（Tween）20 0.5ml3、包被液（简称CB）pH9.6Na2CO3 1.59克NaHCO3 2.93克NaN3 0.2克H2O 至1000ml 4、ELISA底物液（可溶性底物）磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.00.1mol/L柠檬酸（21.014克/100ml) 24.3ml0.2mol/L Na2 HPO4（28.4克/1000ml) 25.7mlH2O 50ml5、DAB底物液（不溶性底物，组化病理等）0.05mol/L pH7.6 Tris-HCLTris 6.05克HCL(36%) 3.15克（约2.7ml浓HCL）H2O 至1000mlDAB为3´，3´二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色6、DAB溶液配制：（组化及Western blot 显色）称DAB30mg，用0.05mol/L pH7.6Trs-HCL缓冲液100ml溶解,如有沉淀，过滤后使用，一般新鲜配制使用。

用前加入1%H2O2 1-1.5ml,H2O2浓度为0.01%，混均后使用。

7、3´，3´，5´，5´，-四甲基联苯胺（TMB）溶液配制：用二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF)或无水乙醇，将TMB配成1%浓度，4°C保存半年以内使用。

使用前，用pH5.0磷酸-柠檬酸底物液9.9ml加入0.1ml(1mg/TMB)1%TMB液，再按每毫升TMB加入30%的H2O2 1ul，混匀后立即使用。

二十四、HE染色：1›伊红染液配方：称取伊红2 g，溶于5 ml 蒸馏水，逐滴加入冰醋酸，边加边搅拌至糊状，再加入数毫升蒸馏水，继续滴加冰醋酸至沉淀不再增加，过滤，将沉淀和滤纸一起置于50-60℃温箱中烘干，溶于400 ml 95%的酒精中。

2›苏木精染液配方：A液：苏木精2 g ；无水乙醇250 ml 。

B液：钾矾（硫酸铝钾）17.6 g；水750mL 。

具体步骤：分别按以上配方配好A液和B液，并混合后加入碘酸钠0.2g，冰醋酸20mL染液配好后，将瓶口用裹着棉花的纱布塞紧，放在暗处通风的地方，并经常摇动以促进它的成熟。

成熟时间约1个月。

此染液需要提前1个月配置好，备用，如果想要促进它的成熟，可在染液里加入0.2 g碘酸钠。

此染液染核效果良好，染色均匀，不会发生沉淀，而且可以长期稳定保存。

此染液可同时与伊红等进行细胞的染色。

整个染色过程包括五个内容：脱蜡复水、染色、脱水、透明和封片。

1›脱蜡复水：a. 65℃温箱烤片30min后, 石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min,b. 石蜡切片依次各级浓度酒精复水：经100%酒精→100%酒精→95%酒精→80%酒精→70%酒精→50%酒精→蒸馏水，各1-2 min。

2›染色：a. 苏木精染色约4min。

染色时间主要根据染色剂的成熟度以及室温高低，可以适当缩短或延长（现在的成熟度4min左右）。

b. 水洗5-10minc. 脱水Ⅰ切片经50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇，各1-2 min。

d. 复染伊红染色10s-20s ，着色以较浅为宜。

3›脱水Ⅱ：用95%乙醇洗去切片多余的红色，然后放入100%无水乙醇两次各1.5 min，共3min。

4›透明：切片依次经乙醇-二甲苯等量混合液1.5min、纯二甲苯Ⅰ5min、Ⅱ5min。

二甲苯要定期更换，切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。

5›封片滴加中性树胶，注意组织不能有气泡。

对于石蜡切片：1、烤片：60℃ 60分钟2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。

3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。

修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。

2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H2O22(2ml H2O22加入18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。

（也可不用去除内源性酶）。

3. 封闭(Blocking)加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。

如果背景较高，可以4℃封闭过夜。

不用洗，用滤纸吸干周边水分。

从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。

4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。

立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。

PBS洗3次，每次5分钟。

5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

PBS洗涤3次。

每次5分钟。

如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

6. 蛋白检测(Detection of proteins)对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。

7. 复染用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS冲洗5分钟×3次，封片（封片剂或分析纯的甘油与0.5molpH9.5碳酸缓冲液1：1混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。

碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线：400-168-3301或800-8283301订货e-mail：******************技术咨询：*****************网址：碧云天网站微信公众号MuERVL-Gag Rabbit Polyclonal Antibody产品编号产品名称包装AF0240 MuERVL-Gag Rabbit Polyclonal Antibody 50μl产品简介：来源用途交叉反应性分子量Rabbit ICC, IF M 67KDa WB, Western blot; IP, Immunoprecipitation; IF, Immunofluorescence; IHC, Immunohistochemistry; ICC, Immunocytochemistry;FC, Flow Cytometry; ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent Assay; ChIP, Chromatin Immunoprecipitation Assay.H, Human;M, Mouse; R, Rat; C, Chicken; Cw, Cow; Dg, Dog; Gp, Guinea pig; Hm, Hamster; Hr, Horse; Mk, Monkey; Pg, Pig;Rb, Rabbit; S, Sheep; Z, Zebrafish; All, all species expected.配套提供了Western一抗稀释液，可以用于Western检测或其它适当用途时的一抗稀释。

建议抗体使用时的稀释比例如下(实际使用时需根据抗原水平的高低作适当调整)：WB IP IF IHC ICC FC ELISA ChIP- - 1:200 - 1:200 - - -抗体详细信息如下:About this AntibodyName MuERVL-Gag Rabbit Polyclonal AntibodyCategory Polyclonal antibody(pAb); Primary antibodyIsotype IgGPurification Peptide affinity purifiedAbout the ImmunogenImmunogen This antibody is produced by immunizing rabbits with a synthetic peptide (KLH-coupled) corresponding to MuERVL-Gag.Gene ID - SwissProt - Synonyms - CategoryBackground A large number of retrotransposons are expressed when the zygotic genome is first transcribed, including the endogenous retroviruses (ERVs), LINE-1 elements, and the non-autonomous SINE elements. At the 2C stage, MuERV-L/MERVL retrovirus-like elements are transiently de-repressed and produce 3% of the transcribed mRNAs. Following the 2C stage, MERVL-retroelement expression is silenced. The newly study discovered that this regulated pattern of MERVL expression overlapped with greater than one hundred 2C-specific genes that have co-opted regulatory elements from these foreign retroviruses to initiate their transcription.包装清单：产品编号产品名称包装AF0240 MuERVL-Gag Rabbit Polyclonal Antibody 50μlAZ050 Western一抗稀释液50ml－说明书1份保存条件：MuERVL-Gag Rabbit Polyclonal Antibody -20ºC保存，Western一抗稀释液-20ºC或4ºC保存，一年有效。

免疫荧光染色技术标签: 荧光免疫染色技术2009-04-07 22:28最近看了几篇文章，文中都涉及一项技术叫：免疫荧光染色。

感觉这项技术不错，实验的图片经过染色很漂亮，再一merge，更加说明问题，今日网上搜来有关介绍，恶补一下。

竟觉也不是和特别，所谓难者不会，会者不难，大概也就是如此了。

将该项技术介绍如下：（转载）荧光免疫染色和DAPI染色实验1．实验原理免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。

实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。

利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。

二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。

另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。

DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。

结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。

Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。

后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。