免疫荧光染色试剂盒-抗兔

细胞表面间接免疫荧光染色细胞表面间接免疫荧光染色是一种常用的细胞学实验技术，用于研究细胞表面蛋白的分布和表达。

该技术通过标记特定抗体，利用荧光染料对其进行可视化，从而在显微镜下观察和定位特定抗原在细胞表面的分布情况。

本文将详细介绍细胞表面间接免疫荧光染色的原理、步骤和应用。

一、原理细胞表面间接免疫荧光染色的原理基于免疫反应。

首先，需要选择与目标抗原特异性结合的一对抗体，其中一种抗体被称为一抗，另一种抗体被称为二抗。

一抗是直接与目标抗原结合的抗体，而二抗则与一抗结合。

一般情况下，一抗是小鼠或兔子产生的，而二抗是针对小鼠或兔子IgG的抗体。

二、步骤1. 细胞固定：将待染色的细胞固定在载玻片上，常用的固定剂包括甲醛、乙醛和冰乙酸。

2. 渗透：为了提高染色抗体的进入细胞的能力，需要对固定的细胞进行渗透处理。

一般使用0.1% Triton X-100或0.5% Tween 20进行渗透。

3. 阻断：为了防止非特异性结合，需要对细胞进行阻断处理。

常用的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）和羊血清。

4. 一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到载玻片上，与细胞孵育。

一抗与目标抗原结合后，可以利用荧光标记的二抗进行可视化。

5. 二抗孵育：将荧光标记的二抗溶液加到载玻片上，与一抗结合。

常用的荧光标记物有荧光素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）和碳氰菲（Cy5）等。

6. 洗涤：将载玻片进行洗涤，去除未结合的抗体。

7. 封片：将载玻片倒置在抗褪色剂中，然后用封片胶封住玻片边缘，使样品不受空气氧化。

三、应用细胞表面间接免疫荧光染色广泛应用于生命科学领域，尤其在细胞生物学和免疫学研究中发挥重要作用。

具体应用包括：1. 细胞表面蛋白定位：通过荧光染色，可以观察和定位特定蛋白在细胞表面的分布情况，如受体、通道蛋白等。

2. 细胞凋亡检测：细胞表面间接免疫荧光染色可以用于检测细胞凋亡相关标志物，如细胞色素C和半胱天冬酶-3等。

3. 免疫细胞分型：通过特定抗体的染色，可以对免疫细胞进行分型，如T细胞、B细胞、巨噬细胞等。

多色免疫荧光染色试剂盒使用说明多色免疫荧光染色试剂盒使用说明酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采纳HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤(HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。

之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-hrp二抗来其次轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

TSA具体原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与四周的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增加。

简洁来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP(而不是直接偶联荧光素)，来催化后续添加入体系的非活性荧光素。

荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟接近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。

然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。

再换个一抗来其次轮孵育，周而复始。

等到全部抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最终去检测结果。

由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担忧抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大削减了试验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。

也就是说，假如用TSA技术，同一张片子上全部的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。

搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行试验，而且信号放大的倍数大大增加。

茹创生物开发的试剂盒详细酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。

组织免疫荧光步骤：
1）取出切片，用 M PBS冲洗5min×3次；
2）滴加10%正常山羊血清37℃封闭45 min；
3）吸去多余液体，加入抗TSHR的一抗（1：100），放入湿盒中，37℃孵育1h后置于4℃冰箱中过夜（保持在湿盒中）；
4） M PBS冲洗5min×3次；
（至下一步开始要适度避光操作，防荧光淬灭！）
5）在黑暗条件下加入山羊抗兔IgG-FITC（1：200），37℃温育45 min；6）在黑暗条件下吸弃二抗 (注：不再冲洗)，加入DAPI染液（μg/ml），室温作用20 min；
7）在黑暗条件下 PBS冲洗5min×6次；
8）在黑暗条件下防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察，用合适波段激发，照相保存实验结果。

核实好下边的问题你就可以操作了：
1、准备 M PBS 500 ml，冲洗时动作既要轻柔防脱片，又要保证冲洗
彻底；
2、抗TSHR的一抗用1：100，用抗体稀释液稀释；
3、实验室有没有山羊抗兔IgG-FITC，使用浓度是1：200；
4、DAPI染液（μg/ml）实验室有吗
5、防荧光淬灭剂封片实验室有吗。

Polymer HRP * Goat Anti Rabbit IgG(H+L)【产品货号】RS0010【产品名称】1、通用名称：Polymer HRP羊抗兔二抗即用型（免疫组织化学）2、英文名称：Polymer HRP * Goat Anti Rabbit IgG(H+L)【包装规格】类别规格工作液10mL/瓶、100mL/瓶【预期用途】免疫组织化学染色，配合Immunoway常规兔来源的浓缩型或即用型一抗使用。

【作用原理】数个过氧化物酶分子和数个二抗分子结合在同一多聚体上构成了一种简单而灵敏的显色系统【主要组成成份】磷酸盐缓冲液0.01mol/LGoat anti Rabbit HRP 大于0.05mg/L【储存条件及有效期】1、储存要求：2℃～8℃密封保存。

2、有效期：一年。

【样本要求】新鲜活检或外科样本组织，甲醛固定，固定时间8-24小时要求取材、脱水、石蜡包埋并制成蜡块。

配合Immunoway常规浓缩型或即用型一抗使用。

【检验方法】1、人体组织样本先经甲醛固定。

2、固定后的组织经过脱水等一系列操作制备成蜡块。

3、用切片机把组织蜡块切成切片。

4、手工操作免疫组化实验。

常规推荐步骤如下：4.1. 将需要进行实验的组织切片取出，插入玻片架上后放入60-65℃的烤箱中，烤片1-1.5h。

4.2. 将切片置于以下染色缸中梯度反应：二甲苯10分钟×2次二甲苯5分钟无水乙醇5分钟×2次95%乙醇5分钟85%乙醇5分钟PBS清洗3分钟×3次4.3. 抗原修复（方法见一抗供应商，或采用常规高压、微波、酶修复等）4.4.根据组织大小直接滴加内源性过氧化物酶阻断剂到组织上，通常为100uL, 直至完全覆盖组织。

室温10分钟，PBS清洗3分钟×3次。

此步骤通常在水浴法、酶法等温和抗原修复后加入。

或者组织本身含有较多内源性过氧化物酶中加入。

4.5. 根据组织大小滴加一抗到组织上，通常为100uL,直至完全覆盖组织。

免疫荧光实验所需试剂1、PBS和PBST（0.05% Tween 20 in PBS：2000mlPBS+1ml吐温）2、4％多聚甲醛/PBS(4g多聚甲醛+50-80mlPBS+加热至60℃并搅拌+滴加少量1mol/L 的NaOH溶液使其变清亮，定容至100ml)3、0.1％ triton X-100/PBS配制（999mlPBS+1ml Triton X-100/曲拉通X-100（碧云天ST795），因为Triton X-100很粘稠，需减掉枪头尖慢吸）4、2％二抗同源血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致(中杉金桥封闭用正常羊血清工作液 ZLI9022)5、二抗（中杉金桥 594标记山羊抗兔IgG ZF0616）（中杉金桥 488标记山羊抗小鼠IgG ZF0512）细胞爬片的免疫荧光染色步骤：1）实验前一天，将细胞接入铺有22×22mm（或24×24mm）盖玻片[悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片]的六孔板或十二孔板中。

2）第二天，待细胞汇合度达到70％左右开始进行染色步骤。

3）用新鲜配制4％多聚甲醛[4℃]固定细胞10分钟。

4）PBS洗三遍，每次5分钟。

5）用0.1％ triton X-100[PBS配制]对细胞透化处理10分钟。

6）加PBS，使液面覆盖玻片。

如果细胞贴壁好，PBS洗时可轻摇孔板洗三遍，每次5分钟[不必一直摇]。

如果细胞贴壁不好就不必了，可以考虑多加点PBS，或者每次浸泡时间稍延长1-2分钟。

7）2％二抗同源血清[购买的纯的羊或牛血清用PBS稀释至2%，当前用的是羊血清]封闭30分钟-60分钟，PBS简单冲洗两遍或者不洗。

8）染色前根据公司说明书建议的浓度配好1抗（1抗稀释液购自中杉金桥）[建议先测试抗体浓度，可依据公司推荐的浓度增加和减低浓度进行测试；如公司推荐1：200，可将抗体配成1：50、1：100、1：200、1：400、1：600，以不同浓度进行孵育，如果抗体有效，应当在有效染色的抗体浓度范围内都可染色，只是颜色深浅不同]，加入1抗，4℃冰箱孵育，一般要大于18小时[有的抗体可能需要多达50小时]。

荧光免疫染色和DAPI染色实验1．实验原理免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。

实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。

利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。

二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。

另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。

DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA 的双链紧密结合。

结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV （紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。

Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。

后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。

本实验就是利用DAPI染色标记细胞核的位置。

免疫染色实验方法和步骤免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。

⼆步法抗兔、⿏通⽤型免疫组化检测试剂盒FOR RESEARCH USE ONLY.Code No:GK500705Storage: Store vial at 2-8.℃Intended UseChemMate? EnVision? Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, is intended for use inimmunocytochemistry together with the TechMate? and Autostainer Instruments. The kit is employed in atwo-step procedure where the first step is incubation of the tissue with an optimally diluted primary rabbit ormouse antibody, and the second step is incubation with the ChemMate? EnVision?/HRP , Rabbit/Mouse(ENV) reagent of the kit. This reagent is a peroxidase-conjugated polymer, which also carries antibodies torabbit and mouse immunoglobulins. The reaction is visualized by the ChemMate? DAB+ Chromogen alsoincluded in the kit.Reagents Materials providedBottle A ChemMate? DAKO EnVision?/HRP , Rabbit/Mouse (ENV)5 mL, ready-to-useDextran coupled with peroxidase molecules and goat secondary antibody molecules against rabbit andmouse immunoglobulins. In buffered solution containing stabilizing protein and preservative.Bottle B ChemMate? Substrate Buffer2*6.25 mLBuffered solution containing hydrogen peroxide and preservative.Bottle C ChemMate? DAB+ Chromogen1*0.25mL, 50 x concentrated3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride in organic solvent. The colour of this reagent may vary from strongviolet to colourless without having any influence on the performance of the kit.Precautions ：1. Bottle A , ChemMate? EnVision?/HRP , Rabbit/Mouse (ENV), contains material of animal origin and it cannot be excluded that trace amounts of human material could be present due to manufacturing procedures. As with any product derived from biological sources, proper handling should be used.2. Do not expose Bottle C , ChemMate? DAB+ Chromogen or the Substrate Working Solution (CHROM) to strong light.3. Bottle C , ChemMate? DAB+ Chromogen contains 1.5% 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride, and is labelled: Harmful.Storage ：Store the kit at 2-8 . The prepared Subs ℃trate Working Solution (CHROM) should be stored at 2-8 and used℃within 5 days.Quality Control ： Each staining run should include a known positive control specimen to ascertain a proper performance of all the applied reagents. If the positive control specimen fails to demonstrate positive staining, labelling of test specimens should be considered invalid. A negative control reagent should be used with each specimen to identify any non-specific staining. If non-specific staining cannot be clearly differentiated from the specific staining, the labelling of the test specimen should be considered invalid.Please contact us for more information about this product.EnVision? Detection Kit,Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse⼆步法抗兔/⿏通⽤型免疫组化检测试剂盒剂型：⼯作液编号：GK500705适⽤：⼀抗为兔抗或⼩⿏抗的免疫组化检测储存：2-8℃该试剂盒是⼀个特别敏感的⼆步法免疫组化试剂盒，适合与兔抗抗体或⼩⿏抗抗体配⽤。

免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：补体法原理和操作指南一、原理与意义免疫荧光组织（细胞）化学染色方法——补体法，是一种荧光抗体染色法。

本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。

二、操作指南1、材料（1）免疫血清60℃灭活20min，用Kolmers盐水作2倍稀释成1：2，1：4，1：8……。

补体用 1：10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。

免疫血清补体结合的效价，如为1：32则免疫血清应作1：8稀释。

（2）补体用新鲜豚鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2单位的比例，用 Kolmers盐水稀释备用。

Kolmers盐水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中，溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。

（3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。

2、操作步骤（1）涂片或切片固定。

（2）吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片上，37℃作用 30min，置于保持一定湿度的染色盒内。

（3）用缓冲盐水洗2次，搅拌，每次5min，吸干标本周围水液。

（4）滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体30min，37℃，水洗同（3）。

（5）蒸馏水洗1min，缓冲甘油封固。

3．对照染色（1）抗原对照。

（2）抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。

（3）灭活补体对照：将补体经56℃ 30min处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。

Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG (H+L)产品简介：本Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG (H+L) (Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG (H+L))为进口分装，用于免疫荧光染色。

Alexa Fluor 488是一种常用的非常明亮的绿色荧光探针。

它比绝大部分常用的绿色荧光探针更加明亮，更加不容易淬灭，IgG和大鼠IgG吸附纯化的优质二抗。

对人IgG、小鼠IgG和大鼠IgG几乎没有结合能力。

特别适合于对于二抗种属特异性要求比较高的荧光染色实验。

本Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG (H+L)用于免疫荧光染色时的推荐稀释比例为1:500。

实际实验操作过程中需根据抗原和抗体的具体情况适当调节荧光标记二抗的稀释比例，推荐的调节范围为1:200-1000。

本抗体如果用于常规的免疫染色，以每次检测需1毫升1:500稀释的荧光标记二抗计，至少可以检测50次。

如果适当重复使用已经使用过的荧光标记二抗，至少可以多检测150-250次。

保存条件：-20℃避光保存，一年有效。

注意事项：为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：1.免疫荧光染色请参考相关实验步骤进行。

起始稀释浓度按照产品简介中推荐的稀释比例进行稀释。

2.如果希望重复使用稀释的荧光标记二抗，稀释的荧光标记二抗4℃保存。

使用本产品的文献：1. Lu X, Zhang N, Meng B, Dong S, Hu Y.Involvement of GPR12 in the regulation of cell proliferation and survival.Mol Cell Biochem. 2012 Jul;366(1-2):101-10.2. Lu X, Zhang N, Dong S, Hu Y.Involvement of GPR12 in he induction of neurite outgrowth in PC12 cells.Brain Res Bull. 2012 Jan 4;87(1):30-6.3. Su J, Wang Y, Li R, Peng H, Hua S, Li Q, Quan F, Guo Z, Zhang Y.Oocytes selected using BCB staining enhance nuclear reprogramming and the in vivo development of SCNTembryos in cattle.PLoS One. 2012;7(4):e36181. doi: 10.1371/journal.pone.0036181. Epub 2012 Apr 27.4. Qiu M, Quan F, Han C, Wu B, Liu J, Yang Z, Su F, Zhang Y.Effects of granulosa cells on steroidogenesis, proliferation and apoptosis of stromal cells and theca cells derivedfrom the goat ovary.J Steroid Biochem Mol Biol. 2013 Jun 28. pii: S0960-0760(13)00120-9. doi: 10.1016/j.jsbmb.2013.06.005.5. Yang Z, Liu J, Liu H, Qiu M, Liu Q, Zheng L, Pang M, Quan F, Zhang Y.Isolation and Characterization of SSEA3(+) Stem Cells Derived from Goat Skin Fibroblasts.Cell Reprogram. 2013 Jun;15(3):195-205. doi: 10.1089/cell.2012.0080. Epub 2013 May 13.6. Liu J, Yang Z, Qiu M, Luo Y, Pang M, Wu Y, Zhang Y.Developmental potential of cloned goat embryos from an SSEA3(+) subpopulation of skin fibroblasts.Cell Reprogram. 2013 Apr;15(2):159-65. doi: 10.1089/cell.2012.0073. Epub 2013 Feb 26.7. Deng Z, Yan F, Jin Q, Li F, Wu J, Liu X, Zheng H.Reversal of multidrug resistance phenotype in human breast cancer cells using doxorubicin-liposome-microbubble complexes assisted by ultrasound.J Control Release. 2014 Jan 28;174:109-16. doi: 10.1016/j.jconrel.2013.11.018. Epub 2013 Nov 25.8. Miao SH, Sun HB, Ye Y, Yang JJ, Shi YW, Lu M, Hu G, Zhou JW.Astrocytic JWA Expression is Essential to Dopaminergic Neuron Survival in the Pathogenesis of Parkinson's Disease.CNS Neurosci Ther. 2014 Aug;20(8):754-62. doi: 10.1111/cns.12249. Epub 2014 Mar 17.9. Su J, Hu G, Wang Y, Liang D, Gao M, Sun H, Zhang Y.Recombinant human growth differentiation factor-9 improves oocyte reprogramming competence and subsequent development of bovine cloned embryos. Cell Reprogram. 2014 Aug;16(4):281-9. doi: 10.1089/cell.2014.0001. Epub 2014 May 19.10.Zhao ZW, Pan DD, Wu Z, Sun YY, Guo YX, Zeng XQ.Antialcoholic liver activity of whey fermented by Lactobacillus casei isolated from koumiss.J Dairy Sci. 2014 Jul;97(7):4062-71. doi: 10.3168/jds.2014-7954. Epub 2014 Apr 24.11.Jin Y, Sun C, Feng L, Li P, Xiao L, Ren Y, Wang D, Li C, Chen L.Regulation of SIV antigen-specific CD4+ T cellular immunity via autophagosome-mediated MHC II molecule-targeting antigen presentation in mice. PLoS One. 2014 Mar 26;9(3):e93143. doi: 10.1371/journal.pone.0093143. eCollection 2014.12.Zhang H, Xiao Y, Wang X, Riaz H, Li W, Fu S, Xin Y, Shi L, Ma F, Li X, Yang L.Effects of histone deacetylase inhibitors on the early development of bovine androgenetic embryos.Cell Reprogram. 2014 Feb;16(1):54-64. doi: 10.1089/cell.2013.0027. Epub 2014 Jan 4.13.Gao W, Gu Y, Li Z, Cai H, Peng Q, Tu M, Kondo Y, Shinjo K, Zhu Y, Zhang J, Sekido Y, Han B, Qian Z, Miao Y.miR-615-5p is epigenetically inactivated and functions as a tumor suppressor in pancreatic ductal adenocarcinoma.Oncogene. 2014 Apr 28;0. doi: 10.1038/onc.2014.101.14.Cheng J, Sun Y, Zhang X, Zhang F, Zhang S, Yu S, Qiu X, Tan L, Song C, Gao S, Wu Y, Ding C.Toll-like receptor 3 inhibits Newcastle disease virus replication through activation of pro-inflammatory cytokines and the type-1 interferon pathway. Arch Virol. 2014 Jun 17.15.Su J, Wang Y, Zhang L, Wang B, Liu J, Luo Y, Guo Z, Quan F, Zhang Y.Oocyte-secreted factors in oocyte maturation media enhance subsequent development of bovine cloned embryos.Mol Reprod Dev. 2014 Apr;81(4):341-9. doi: 10.1002/mrd.22302. Epub 2014 Feb 18.16.Ge XY, Yang LQ, Jiang Y, Yang WW, Fu J, Li SL.Reactive oxygen species and autophagy associated apoptosis and limitation of clonogenic survival induced by zoledronic acid in salivary adenoid cystic carcinoma cell line SACC-83.PLoS One. 2014 Jun 25;9(6):e101207. doi: 10.1371/journal.pone.0101207. eCollection 2014.17.Su J, Wang Y, Li W, Gao M, Ma Y, Hua S, Quan F, Zhang Y.Effects of 3-hydroxyflavone on the cellular and molecular characteristics of bovine embryos produced by somatic-cell nuclear transfer.Mol Reprod Dev. 2014 Mar;81(3):257-69. doi: 10.1002/mrd.22293. Epub 2014 Jan 10.。

人心肌成纤维细胞的培养及免疫荧光鉴定摘要】目的:探讨和建立适用于人心肌成纤维细胞体外培养及鉴定的技术方法。

方法：从将进行心脏手术患者体内取右心耳组织，用胰蛋白酶消化法消化分离细胞，再通过差速贴壁分离法收集心肌成纤维细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养并传代，光学显微镜下观察心肌成纤维细胞基本形态特征的变化，波形蛋白(Vimentin)，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，Ⅷ因子(VWF) 抗体对细胞进行免疫荧光鉴定。

结果：形态学观察和免疫荧光鉴定显示，成功培养心肌成纤维细胞，纯度达95%以上。

结论：胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法及免疫荧光鉴定是一种简单有效的人心肌成纤维细胞培养方法。

建立了一种纯度较高且保存了成纤维细胞自身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养模型。

【关键词】心肌成纤维细胞原代培养胰蛋白酶消化法差速贴壁分离法免疫荧光【中图分类号】R39 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）30-0052-03心肌纤维化是各种心血管疾病发生、发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重构的主要表现之一，而心肌成纤维细胞在这一过程中发挥着极其重要的作用。

当前，心肌成纤维细胞体外实验研究模型主要集中建立在动物的心肌，人的心肌成纤维细胞体外实验研究模型鲜有文献报道。

我们参照Neuss等学者差速贴壁分离和培养人心脏成纤维细胞的方法[1]，采用胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法，成功分离培养出人心肌成纤维细胞，摸索出一种纯度较高且保存了成纤维细胞自身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养方法，为人心肌纤维化研究及人心肌成纤维细胞增殖模型的建立提供了一种方法，现作报道。

一、材料与方法（一）、材料:取福建省立医院建立体外循环将进行心脏手术患者心脏停跳前的右心耳组织约30mg，放入置于冰面上盛有PBS的无菌培养皿并立即送入实验室进行下一步细胞分离培养。

（二）、主要试剂及配制胰蛋白酶（美国Amersco公司），DMEM高糖培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Hyclone），免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠cy3（碧云天生物技术研究所），免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC（碧云天生物技术研究所），V2258小鼠波形蛋白单克隆抗体（美国Sigma公司），A2547小鼠α-SMA单克隆抗体（美国Sigma公司），F3520兔VWF抗体（美国Sigma公司）。

细胞免疫荧光实验步骤细胞免疫荧光实验步骤简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟3.PBS洗净:3min＊34.1%Triton: 30min. 配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗净:2＊5min6.羊血清封闭：３７度，２０分钟７.一抗，his1；400 ４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时８.４度PBS洗净，３min＊５次９.二抗３７度小于一小时加入5ug/ml的FITC-鬼笔环肽（100ug/ml储存液）室温染色30-60分钟１０.３７度PBS洗净，３＊５minDAPI 1：200凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）我的实验检测X射线照射鼻炎癌细胞后γH2AX的数量变化预实验步骤：1）辐照结束后，弃去旧培养液，4%多聚甲醛4℃固定15分钟。

2）PBS洗涤，5分钟×3次。

3）体积分数为0.2%Triton-X 100 4℃破膜15分钟。

4）PBS洗涤，5分钟×3次。

5）羊血清工作液室温封闭2小时。

6）PBS洗涤，5分钟×3次。

7）0.21µg/ml一抗（梯度1:500 1:750 1：1000）37℃孵育细胞2小时。

8）PBS洗涤，5分钟×3次。

9）2.1µg/ml 二抗（1：200）37℃避光孵育细胞1小时。

10）PBS洗涤，5分钟×3次。

11）1µg/ml DAPI染色15分钟，使用时避光。

12）PBS 洗涤，5分钟×3次。

13）以及分数90%甘油封片，盖玻片细胞面朝下。

14）荧光显微镜下观察。

活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)（二）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。

对于石蜡切片：1、烤片：60℃ 60分钟2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。

3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。

修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。

2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H2O22(2ml H2O22加入18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。

（也可不用去除内源性酶）。

3. 封闭(Blocking)加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。

如果背景较高，可以4℃封闭过夜。

不用洗，用滤纸吸干周边水分。

从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。

4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。

立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。

PBS洗3次，每次5分钟。

5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

PBS洗涤3次。

每次5分钟。

如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

6. 蛋白检测(Detection of proteins)对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。

7. 复染用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS冲洗5分钟×3次，封片（封片剂或分析纯的甘油与0.5molpH9.5碳酸缓冲液1：1混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。

免疫荧光中二抗种属和封闭抗体种属一、概述免疫荧光技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的方法，它利用免疫荧光染色可以快速准确地检测细胞或组织中特定的蛋白质分布和表达情况。

而其中二抗和封闭抗体的种属对于免疫荧光技术的成功应用至关重要。

二、免疫荧光中二抗种属1. 源自不同种属的抗体在免疫荧光技术中，二抗是指与待检测抗体相互作用的第二个抗体。

为了避免原发抗体与被检测物种属的冲突，二抗和原发抗体应来自不同的物种。

常用的二抗种属包括兔抗小鼠、小鼠抗兔等。

2. 减少假阳性结果使用源自不同种属的二抗有助于减少假阳性结果的发生，提高检测结果的准确性和可靠性。

在选择二抗种属时，应充分考虑原发抗体的种属，以确保实验结果的准确性。

三、封闭抗体种属1. 封闭抗体的种属选择在免疫荧光技术中，封闭抗体是指用于阻断非特异性结合的抗体，在免疫组织化学和免疫细胞化学应用中，封闭抗体能够有效地提高检测的特异性。

封闭抗体的种属选择应根据待检测标记物的来源和原发抗体的种属进行选择，以确保封闭抗体与原发抗体不发生交叉反应。

2. 提高检测结果的特异性封闭抗体的种属选择直接影响着检测结果的特异性，正确选择种属可有效降低背景信号，提高检测结果的清晰度和可读性。

封闭抗体的种属选择是免疫荧光技术中至关重要的一环。

四、总结免疫荧光技术在生物医学研究和临床诊断中具有重要的应用价值，而其中二抗和封闭抗体的种属选择对于免疫荧光技术的成功应用至关重要。

正确选择二抗种属和封闭抗体种属可以有效减少假阳性结果，提高检测结果的准确性和特异性，为科研工作者和临床医生提供可靠的实验结果和诊断依据。

在进行免疫荧光实验时，科研工作者和临床医生应该充分考虑二抗和封闭抗体的种属选择，确保实验结果的准确和可靠。

五、实验设计中的考虑在进行免疫荧光实验设计时，正确选择二抗和封闭抗体的种属至关重要。

在实验设计中，应充分考虑以下几个方面：1. 样本来源不同样本来源可能含有不同种类的抗原和受体，因此在实验设计中，需要根据样本来源选择合适的二抗和封闭抗体的种属，以确保实验结果的准确性和特异性。

医疗器械产品技术要求编号：1.产品型号/规格通用包装规格为5人份/盒、25人份/盒、40人份/盒和100人份/盒。

2. 性能指标2.1 外观检查外观应平整，材料附着应牢固，各组份应齐全，卡固定紧密。

2.2 物理检查膜条宽应不小于2.0mm；液体移行速度应不低于10mm/min。

2.3 线性范围取同一批号的试剂分别对五个浓度的N末端B型钠尿肽原参考品进行检测，其检测范围为0pg/mL～22000.0pg/mL，每份参考品重复检测3次，计算相关系数r，其中r值应≥0.99。

2.4 精密度2.4.1 批内精密度随机抽取同一批号的试剂10份，分别对同一浓度的N末端B型钠尿肽原参考品进行检测，其变异系数CV（%）值应≤15%。

2.4.2 批间精密度随机抽取连续三个批号的试剂，每个批号取3份分别对同一浓度的N末端B型钠尿肽原参考品进行检测，其变异系数CV（%）值应≤15%。

2.5 准确度用同一批号试剂分别测定三个水平浓度的N末端B型钠尿肽原参考品，计算样本测定结果均值和相对偏差，其中相对偏差（Bias%）应在±15%内。

2.6 最低检出限取同一批号的试剂10份，对配制参考品基质进行检测，计算样本测定结果均值X 和标准偏差SD ，其中（X +2SD ）≤18pg/mL 。

2.7 分析特异性选择同一浓度的N 末端B 型钠尿肽原参考品分别加入胆固醇、甘油三酯、胆红素，使干扰物最终浓度胆固醇60mg/mL 、甘油三酯40mg/mL 、胆红素2mg/mL ，各干扰样本重复检测3次，计算样本检测结果的均值和相对偏差，其中相对偏差（Bias%）应在±15%内。

3. 检验方法 3.1 外观检查取出试剂，用目测方式观察，结果应符合2.1的规定。

3.2 物理检查用游标卡尺检查测试条宽度或观察窗口宽度，以缓冲液作为待测样品，水平放置，用秒表记录液体移行至测试条吸水纸前端或通过观察窗口所需的时间，结果应符合2.2的规定。

免疫荧光染色技术标签: 荧光免疫染色技术2009-04-07 22:28最近看了几篇文章，文中都涉及一项技术叫：免疫荧光染色。

感觉这项技术不错，实验的图片经过染色很漂亮，再一merge，更加说明问题，今日网上搜来有关介绍，恶补一下。

竟觉也不是和特别，所谓难者不会，会者不难，大概也就是如此了。

将该项技术介绍如下：（转载）荧光免疫染色和DAPI染色实验1．实验原理免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。

实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。

利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。

二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。

另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。

DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。

结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。

Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。

后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。

1、一抗选择要点(1)选择单克隆还是多克隆抗体。

由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。

另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。

在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等有所避免)。

(2)种属来源。

一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。

这条主要要与后面的二抗来源相匹配。

(3)实验目的是检测什么种属的抗原，即speciesreactivity。

这一点很重要，一般说明书上都有注明，如小鼠Ms、大鼠Rat、人Hum等等。

(4)能否做免疫组化。

一般一抗说明书都会注明做WB、IHC、ICC、IF等，建议最好选择注明的抗体，因为一般都是经过文章证明。

(5)检测标本类型。

用于检测石蜡切片还是冰冻切片，一般能做石蜡切片的抗体，可能都可以用来检测冰冻切片，但能做冰冻切片的抗体，不一定能检测石蜡切片中的抗原。

(6)生产厂家。

国外著名抗体生产商原装抗体质量一般没问题，尤其是美国Lifespan公司生产的IHCPlusAntibodies系列抗体，全部经过病理组织切片检测验证，100%质量保证，国内北京西美杰科技有限公司有售，就是价格有点贵；而国内分装厂家用的一抗工作液，价格便宜，但有时结果的稳定性和重复性稍差，不同批次重复性较差。

(7)价格与质量的矛盾。

我个人认为一抗原装质量可能会好点，因为许多一抗避免反复冻融，且在稀释液中稳定性较差(若时间长)，但价格较贵。

2、二抗选择要点(1)种属来源。

主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可(羊、兔等均可)。

(2)标记物的选择。

有HRP、Biotin、荧光素等标记物。

免疫荧光染色技术标签: 荧光免疫染色技术2009-04-07 22:28最近看了几篇文章，文中都涉及一项技术叫：免疫荧光染色。

感觉这项技术不错，实验的图片经过染色很漂亮，再一merge，更加说明问题，今日网上搜来有关介绍，恶补一下。

竟觉也不是和特别，所谓难者不会，会者不难，大概也就是如此了。

将该项技术介绍如下：（转载）荧光免疫染色和DAPI染色实验1．实验原理免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。

实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。

利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。

二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。

另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。

DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。

结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。

Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。

后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。