抗病毒基因MxA真核表达载体的构建及在鸡细胞中的表达

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Mx蛋白的真核表达及其抗PRRSV的研究的开题报告

Mx蛋白的真核表达及其抗PRRSV的研究的开题报
告
题目：Mx蛋白的真核表达及其抗PRRSV的研究
摘要：
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是全球猪业面临的重要疫病之一，严重影响了畜牧业的发展。

Mx蛋白是一种具有抗病毒活性的结构域，对PRRSV具有一定的抗病毒作用。

然而，目前还没有报导Mx蛋白真核
表达及其抗PRRSV的研究。

本研究旨在构建Mx真核表达体系，并进一
步探究其抗病毒的作用机制。

本研究将应用PCR克隆技术，构建Mx基因真核表达载体，并通过HEK293细胞系统进行Mx蛋白的真核表达。

接下来，利用免疫荧光和Western blot技术鉴定所表达的Mx蛋白的纯度和活性。

利用细胞病毒学技术，并采用PRRSV进行感染实验，探究Mx蛋白对PRRSV的抑制作用。

最后，应用蛋白质组学技术，对Mx蛋白与PRRSV抗病毒作用的机制进
行解析。

本研究有望为研究Mx蛋白的抗病毒机制提供新的实验基础，为探究PRRSV的致病机制提供新的参考，促进畜牧业科技的进步。

关键词：Mx蛋白；PRRSV；真核表达；抗病毒；作用机制。

基因表达载体的构建3.7

目的基因启动子终止子标记基因
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是 RNA聚合酶的结合位点，驱动基因转录出mRNA。
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
例3、【2019年江苏33题】下图是某基因工程中构建重组质粒的过
程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。
为了筛选出转入了重组质粒的菌落，应在筛选平板培养基中添加氨苄青霉素。
1 2 √3 4 √5 6 7 √8 9
平板影印培养法
添加氨苄青霉素的培养基
添加四环素的培养基
基因表达载体的构建概念图
目的使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，
基
使目的基因能够表达和发挥作用。
因
目的基因
表达载
基因表达载体的组成
启动子终止子
作用
RNA聚合酶识别和结合部位
作用
终止转录
体的构
复制原点标记基因
作用
DNA复制起点
作鉴别和筛选导入目的基因用的受体细胞
限制酶的选择：一种限制酶切割结果分析
下图箭头表示EcoRⅠ的酶切位点，EcoRⅠ识别序列及切点为
G↓AATTC。
EcoRⅠ
难 EcoRⅠ
EcoRⅠ目的基因 Nhomakorabea点
外源DNA
突
质粒
质粒
抗生素抗性基因
破
思考讨论：
使用EcoRⅠ一种限制酶切割外源DNA和质粒，构建基因表
达载体时，可以形成哪些连接产物？

人MxA基因重组真核载体的构建及鉴定

ＣｏｓｒｃｉｎｎｉｅｔｉａｉｎｏｈｅｏｎｔｕｔａｄｄｎｉｃｔｆｔｅｒｃｍｂｎｎｏｆｏｉａｔｅｃｒｏｉｌｓｄＰｃｕａｙｔｐａｍｉＤＮＡ３１Ｍｘｃ．一Ａ
ＨＵＮＧＱｎｅａＡｉ，ｔｌ
Ｊ０Ｍ１９中扩增前期已构建的含有目的基因ＭｘＡ的Ｐｄｒｃ — Ａ和真核载体ＰＤＡ．，使用两者共同的限制性内切酶口ＡｔｋＭｘａｃＮ３１Ｉ、ｏＩＮｔ进行双酶切，并连接以构建重组真核载体ＰＤＡ．一ｘ，ｃＮ３１ＭＡ然后通过氨苄青霉素抗性筛选，双酶切及ＰＲ鉴定，Ｃ选取鉴定正确的克隆测序，并应用ＤＡｓｔ２Ｎｓｓ．ｉ０软件对序列与前期获得的基因序列以及已知Ｇｎａｋ中ＭＡ基因序列进行同源性ｅＢｎｘ分析。结果：经限制性内切酶、ＣＰＲ鉴定重组真核载体ＰＤＡ．一ｘｃＮ３１ＭＡ构建成功。测序结果表明本实验所克隆片段长２１ｂ，０２ｐ包含人ＭＡ基因序列，ｘ核苷酸序列分析表明与前期获得的目的基因序列完全相同，而与Ｇｎａｋ中人ＭＡ基因序列同源性也达ｅＢｎｘ９．５仅有５个碱基不同，所编码的氨基酸仅１９７％，且个发生改变，此氨基酸位于ＭＡ蛋白的非功能区。结论：ｘ重组真核载体
ｈｍｏｏｙａａｙｅｃｏｌｇ－ｎｌｓｄｏｍｐｒｄａｅｗｉｔｅｅｅｃｏｘｈｔｈｓｑｕｎｅｆＭＡｇｅｎｅｎｉＰＡｄａ－ＭｘｎｄｈｅｅｕｃｏｘＴｒｃｋＡａｔｓｑｅｎｅｆＭＡｇｎｐｕｌｓｅｉｅｅｂｉｈｄｎ

禽类抗病毒蛋白质_Mx蛋白

收稿日期：２００７－０６－２５作者简介：尹春光（１９７１－），女，博士生，副教授，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｎｙｃｇ＠１２６．ｃｏｍ；杜立新（１９５６－），博士生导师，教授，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｘｄｕ＠２６３．ｎｅｔ
蛋白能够维持机体的抗病毒状态，抵抗病毒的感染。１９６２年，Ｌｉｎｄｅｎｍａｎｎ［１］首次发现小鼠Ａ２Ｇ１６号染
摘要：Ｍｘ蛋白是在干扰素（ＩＦＮ）诱导下产生的具有抗病毒功能的蛋白质，Ｍｘ蛋白具有ＧＴＰａｓｅ活性，其Ｃ末端的区域是进行亚细胞定位及与病毒直接作用的区域。人类ＩＦＮ诱导的ＭｘＡ蛋白能够维持机体的抗病毒状态，抵抗病毒的感染。禽类的Ｍｘ蛋白抗病毒活性与ＧＥＤ区单核苷酸多态性有关，其中６３１位氨基酸Ｎ与Ｓ的变化可以改变其抗病毒的作用。据此，Ｍｘ基因单核苷酸多态性（ＳＮＰ）标记可指导人类疾病的临床治疗和应用于禽类的抗病育种。关键词：Ｍｘ蛋白；ＧＴＰａｓｅ活性；ＧＥＤ区中图分类号：Ｓ８
色体上有一个显性基因能抵抗正黏液毒科的病毒（流感病毒），并将该基因命名为ｍｙｘｏｖｉｒｕｓｒｅｓｉｓｔａｎｔ，即Ｍｘ基因，该基因表达使得Ａ２Ｇ对流感病毒ＮＷＳ株不敏感，能抵抗致死剂量的流感病毒。Ｍｘ蛋白在真核生物中普遍存在并行使着重要的功能。１．禽类Ｍｘ蛋白
１９９３年，Ｂａｚｚｉｇｈｅｒ等［２］首次利用人的Ｍｘ基因作探针，与鸭的基因组进行分析没有检测分离到Ｍｘ基因相关序列。进一步利用小鼠Ｍｘ１外显子３基因设
● 小综述
《生命的化学》２００７年２７卷６期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹＯＦＬＩＦＥ２００７，２７（６）

抗病毒基因MxA在鸡体内的表达

抗病毒基因MxA在鸡体内的表达*何湃1，刘莉2，3**，张焕相1，采克俊2，3，张易祥2，3，董顺利2（1.苏州大学生命科学学院，江苏苏州215006；2.湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州313000；3.湖州师范学院细胞工程研究所，浙江湖州313000）摘要：大量提取人抗病毒基因MxA的重组质粒pEGFP-C1-MxA，肌肉多点注射未成年广西土鸡，RT-PCR及免疫组化方法检测MxA基因在鸡体内各组织的分布表达。

采用RT-PCR方法于注射后5d、10d在呼吸道上皮、脾脏、肌肉组织中均可检出MxA基因的转录；采用免疫组化方法检测到GFP和MxA基因均能在肌肉组织中得到表达，且注射5d后的表达量高于注射10d后。

结果表明重组质粒肌肉多点注射可介导MxA在鸡体内多种组织中转录、表达，为进一步探讨MxA的生物学活性以及禽类抗病毒免疫制剂的研发奠定了基础。

关键词：体内表达；MxA基因；肌肉多点注射Expression of Anti-virus Gene MxA in Chicken in Vivo*HE Pai1，LIU Li2，3**，ZHANG Huanxiang1，CAI Kejun2，3，ZHANG Yixiang2，3，DONG Shunli2（1.School of Life Science and Technology，Suzhou University，Suzhou，Jiangsu215006；2.School of Life Sciences，Huzhou Teachers College，Huzhou，Zhejiang313000；3.Cell Engineering Institute，Huzhou Teachers College，Huzhou，Zhejiang313000）Abstract：Recombinant plasmid pEGFP-C1-MxA which contains the human anti-virus gene MxA was firstly large scale extracted and subsequently multi-point injected into the femoral muscle of Guangxi indigenous chicken.After injection，RT-PCR and immunohistochemistry was performed to detect the expression and distribution of MxA gene in different tissues.The transcription of MxA gene could be detected in the tissues of spleen，respiratory tract epithelium and muscle at5and10days after injection by the method of RT-PCR.Immunohistochemistry results also indicated the expression of both report gene GFP and target gene MxA，and the expression level in muscle tissue of5d after injection was relatively higher than that of10d after injection.The results that the transcription and expression of MxA gene mediated by the muscle multi-point injection of recombinant plasmid will establish the foundation for the further understanding bioactivity of the MxA gene and anti-virus immune preparation in avian.Key words：In vivo expression；MxA gene；muscle multi-point injection收稿日期：2007-12-11修回日期：2008-04-15*基金项目：国家自然科学基金项目（30500270），浙江省科技计划重点项目（2005C22052），浙江省自然科学基金项目（Y304194）**通讯作者，E-mail：liuli6655@Mx蛋白由Ⅰ型干扰素诱导并能表达特异的抗病毒活性，目前已证明多数哺乳动物的Mx蛋白具有抗病毒活性［1，2］，其中人的MxA蛋白能够抑制多种DNA及RNA病毒［3，4］，而鸡的Mx蛋白仅在少数几种品系中表达出抗病毒活性，且抗病毒活性受特定位点的氨基酸的影响。

ANXA2 真核表达载体的构建

收稿日期：2019-07-02 作者简介：刘容秀（1998-），女，本科生，生物工程专业。通讯作者：李琼毅（1980-），女，博士，副教授，主要从事分子病原学与免疫学研究。基金项目：西北民族大学 2019 年国家级大学生创新创业训练计划项目（201910742092）；西北民族大学 2018 年本科生科研创新项目（Y18071）；国家自然科学基金项目（31702234）。
2019 年第 8 期
modern jou刘rn容al秀o：fANaXnAi2ma真l核hu表sb达an载dr体y的an构d建veterinary medicine
17
ANXA2 真核表达载体的构建
刘容秀，凌莹，喜琴琴，李琼毅*
（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730030）
摘要：以膜联蛋白 A2（Annexin A2，ANXA2）真核表达载体的构建过程为基础，介绍一种易于成功构建真核
表达载体的方法。以 Hela 细胞来源的 cDNA 为模板，半套式 PCR 为基础，通过两次 PCR 的方法，可获得 5’端添加
Kozak 序列并融合表达 HA 标签基因和 ANXA2 的基因片段 Kozak-HA-ANXA2，回收后克隆到 pMD-18T 克隆载
体，获得合适的酶切位点，再采用双粘端连接法将其克隆入慢病毒真核表达载体 pTRIP 中。结果显示，经双酶切和9 年第 8 期
购于北京全式金生物公司。载体由西北农林科技大学杜恩岐教授提供。 1.2 主要试剂 M-MLV 反转录酶和总 RNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，DNA 聚合酶、 BamH Ⅰ和 Xba Ⅰ限制性内切酶、T4 连接酶及 Pre‐ mixTaq 酶购自宝生物（大连）有限责任公司；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒购自北京全式金生物公司。 1.3 载体的构建 1.3.1 模板 cDNA 的获得取一定量对数生长期（1.0×106 个）的 Hela 细胞，按试剂盒操作步骤提取细胞 RNA，并以 mRNA 为模板，以 Oligo（dT）为反转录引物、M-MLV 为反转录酶进行反转录，获得 ANXA2 的 cDNA[5]。 1.3.2 第一次添加标签及连接转化培养第一次 PCR 以 HelacDNA 为模板，通过 PCR 的方法在 cDNA 的 5’ 端上加入标签蛋白 HA 的基因和 Xba I 的酶切位点。 PCR 反应体系： cDNA 5 μL， 10 × Buffer 5 μL， ExTaq 0.5 μL，FP1 1 μL，RP 1 μL，dNTP 4 μL， ddH2O 35 μL。 PCR 反应条件： 94 ℃ 5 min， 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸 2 min，25 个循环，72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。此步结果标记为 PCR1。

MxA抗病毒蛋白的研究进展

MxA抗病毒蛋白的研究进展
杨吉成
【期刊名称】《苏州大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2000(020)006
【摘要】@@ MxA是新发现的由Ⅰ型干扰素(IFNα/β)诱导人细胞所产生的78kd 的新型抗病毒蛋白.开展MxA蛋白研究很有医学价值,现综述如下.rn1 Mx基因及其蛋白的发现与命名rn1964年,Lindenmann发现A2G小鼠能耐受对其它小鼠致死剂量的流感病毒感染.这种特性是从小鼠16号染色体上单一显性等位基因遗传获得的,因能抵抗粘液病毒(流感)而命名为Mx基因.体内外研究表明,这种抗流感病毒作用是受IFNα/β调节,而不受IFN-γ调节.Horisberger等发现,Mx+细胞经IFNα诱导后与Mx-细胞的差别是多出一条75kd的多肽,而且这种多肽也只有在IFNα/β诱导后产生,IFNγ不能产生,将这种多肽统一命名为Mx蛋白[1].
【总页数】6页(P499-504)
【作者】杨吉成
【作者单位】苏州医学院基因工程研究室,苏州,215007
【正文语种】中文
【中图分类】R3;Q51
【相关文献】
1.干扰素抗病毒蛋白MxA和2',5'-OAS在肝胚瘤细胞株中的差异表达 [J], 管世鹤;杨东亮;陆蒙吉;Michael Roggendorf;Joerg F. Schlaak
2.MxA蛋白研究进展 [J], 毛国强;许红梅;朱朝敏
3.MxA抗病毒蛋白的研究进展 [J], 冼盈;张扣兴
4.MxA抗病毒蛋白的研究概况 [J], 尹彦涛;夏平安;崔保安;赵云航;王建举;党占国;柴春霞
5.关于MxA蛋白抗病毒作用及其机制的研究进展 [J], 黄琴;许红梅
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【浙江省自然科学基金】_抗病基因_期刊发文热词逐年推荐_20140812

2012年序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
科研热词载体构建草鱼肝炎病毒,乙型突变病毒诱导的基因沉默泛素融合降解蛋白本氏烟替比夫定抗逆性抗药性抗病性序列分析基因型克隆 mx基因
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2009年序Biblioteka 1 2 3 4 5 6 7 8科研热词转基因表达载体蔓枯病突变体番茄甜瓜根特异启动子抗性机制
推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
科研热词霜霉病遗传距离表达特征白叶枯病水稻抗病基因家蚕大白菜基因结构分子标记几丁质脱乙酰基酶 mrna选择性剪接 dna分子标记
2013年序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
科研热词水稻黄化曲叶病毒高通量测序转基因水稻超敏反应诱导系统抗性茉莉酸系统获得性抗性类病变番茄活性氧水杨酸抗白叶枯病抗病机理抗性基因差异表达基因差异表达信号传递 xa7基因 spl5 cyp81a6 cdna-aflp
2008年序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
科研热词推荐指数 mxa基因 2 鸡细胞 1 载脂蛋白bmrna编辑酶催化多肽样蛋白3g 1 转染 1 表达 1 肌肉多点注射 1 病毒感染因子 1 激发标签 1 植物功能基因组 1 抗病性/易感性 1 基因 1 可传播海绵状脑病(tse) 1 变异 1 功能获得突变 1 体内表达 1 人免疫缺陷病毒 1 乙型肝炎病毒 1 prp 1 prnp多样性 1

MxA蛋白抗病毒机制及其应用前景

万方数据　万方数据药性筛选工作中的应用情况表明，分析感染病毒基因的多态性与病毒一宿主细胞系统病毒基因与细胞基因的表达改变，有助于人们了解病毒的感染发病机制与抗药性机制ｉ利用细菌基因组与抗药性基因、致病岛基因等重要基因的基因芯片通过单一的杂交试验就可以完成感染细菌或分离菌株的基因分型与菌种鉴定，快速诊断、鉴定致病细菌与非致病菌，指导临床治疗；对细菌基因组多个基因表达同时进行定量分析，为研究细菌对环境信号或药物的反应、研究细菌侵袭力的发生提供了一种直接、高效的检测方法。

目前，基因芯片技术在医学、分子生物学领域应用已经越来越广泛，受到人们的普遍重视，但研究成本相对较高，待测定的靶探针标记方法也比较繁琐，国内研究还只是处予起步阶段。

但这项研究是一种实力的较量，要想在基因功能分析领域取得更新、更高、更有价值的成绩。

必须集中人力、物力来研制适合我们国情的基因芯片技术。

相信不暇时日，经过努力，在一些领域我们会迎头赶上，让希望变为现实。

参考文献［１ＧｒａｖｅｓＤＪ．ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ—ｇＹ，１９９９；１７（３）：１２７～１３４［２３ＫｚａｌＭＪｅｔａ１．ＮａｔｕｒｅＭｅｄ，１９９６；２（７）：７５３～７５９［３３ＨｕａＺｅｔａ１．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９８；９５（２４）：１４４７０＂－＇－－１４４７５［４］ＧｉｎｇｅｒａｓＴＲｅｔａ１．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９８；８（５）：４３５～４４８Ｅ５ＪＴｒｏｅｓｃｈＡｅｔａ１．ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９；３７（１）：４９～５５１６］ＣｈａｍｂｅｒｓＪｅｔａ１．ＪＶｉｒｏｌ，１９９９；７３（７）：５７５７～５７６６［７］ＨｅａｄＳＲｅｔａ１．ＭｏｌＣｅｌｌＰｒｏｂｅｓ，１９９９；１３（２）：８１～８７［８］ＡｎｔｏｉｎｅＤＳｅｔａ１．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８；１６（１）：４５～４８（１９９９年１０月２２日收稿）（上接第７页）ＥＩ。

鸡RORα真核表达载体的构建及其在MSB1细胞中的表达

中国畜牧兽医2018,45(7) :179!1797China Animal Husbandry &Veterinary Medicined o i：10. 16431/ki. 1671-7236. 2018. 07. 008鸡RORa真核表达载体的构建及其在MSB1细胞中的表达尤钊1，左珂朦1，余祖华h，丁柯1!，王垚垚、刘彤1，张梦珂1，邱静静1!(1.河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室，洛阳）71003&2.河南科技大学宏翔生物饲料实验室，洛阳471003)摘要：为构建鸡维甲酸相关孤核受体a(retinoidacid receptorrelatedorphan receptor #，R O R#)的真核表达载体，并检测其在M S B1细胞中的表达效果，本研究参照G e n B a n k中鸡尺O R#基因序列（登录号：N M+001289887. 1)设计特异性引物，从鸡肝脏组织中提取总R N A，经反转录合成c D N A，以此为模板进行P C R扩增，将扩增的特异性R O R#基因片段连接P M D18-T载体，构建克隆载体p M D18-T-R O R#，再用Sal I和£%m H I双酶切克隆载体P M D18-T-R O R#和真核表达载体p E G F P-N1，将酶切回收的R O R#与p E G F P-N1片段进行连接，构建重组真核表达载体P E G F P-N1-R O R#，经P C R、酶切和测序验证准确性后，将其转染M S B1细胞，于转染后）8h荧光显微镜下观察E G F P的表达情况，并采用实时荧光定量P C R检测鸡R O R#在M S B1细胞中的表达水平（结果显示，从构建的重组质粒p E G F P-N1-R O R#中可扩增出大小约1 600 b p的特异性片段，用Sal I和B a m H I可切出大小约)700和1 600 b p的两条带。

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细胞生物学杂志ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ２００８，３０：２０ｏｒｇ
抗病毒基因ＭｘＡ真核表达载体的构建及在
鸡细胞中的表达
刘莉采克俊张易祥何湃１丁志丽张念慈＊
（湖州师范学院生命科学学院，湖州３１３０００；１苏州大学生命科学学院，苏州２１５００６）
鸡睾丸组织原代细胞取自１８日龄鸡胚。将其剪开腹部，取出睾丸（有两个白色的性腺者为雄性），剥离睾丸白膜和血管，剪碎，用胶原酶消化（于３７ ℃温育１５￣３０ｍｉｎ），离心收集细胞混合液，再用胰蛋白酶消化５ｍｉｎ，然后加含血清的培养基终止消化。过滤后细胞计数，以５×１０５个／ｍｌ的密度接种于２４孔培养板中，于３８．５ ℃、５％ＣＯ２、饱和湿度条件下培养。待汇片至７０％￣８０％时用于细胞转染。１．２．３重组质粒的制备及体外转染鸡细胞将小量提取并纯化的重组质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－ＭｘＡ和对照质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１的ＤＮＡ调整浓度为１ µg／µl 备用。采用脂质体转染试剂Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ进行转染，方法参照说明书进行。１．２．４荧光显微镜观察ＥＧＦＰ在细胞内的表达和分布将上述培养的鸡胚成纤维细胞和鸡睾丸组织细胞转染４８ｈ后，在荧光倒置显微镜下观察自发绿色荧光的被转染细胞，照相记录。１．２．５ＲＴ－ＰＣＲ检测基因的转录采用ＴＲＩＺＯＬ法提取转染后细胞的总ＲＮＡ。利用ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒检测ＥＧＦＰ和ＭｘＡ基因的转录。参照说明书进行。１．２．６免疫组化检测基因的表达将转染４８ｈ后的细胞，经４％多聚甲醛固定后，用单克隆抗体ＧＦＰ（Ｂ－２）进行常规的细胞免疫组化检测。
摘要将人抗病毒蛋白基因ＭｘＡ与携带增强型绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）基因的真核表达质粒重组后构建ＭｘＡ基因真核表达载体ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－ＭｘＡ。经ＰＣＲ和酶切方法鉴定后，重组质粒在脂质体介导下转染鸡成纤维细胞和睾丸组织原代细胞，通过荧光观察，ＲＴ－ＰＣＲ及细胞免疫组化检测目的基因的表达。结果表明，ＭｘＡ基因片段已经被克隆到ｐＥＧＦＰ－Ｃ１表达载体，成功构建了ＭｘＡ基因真核表达载体ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－ＭｘＡ。经该重组质粒转染后的鸡细胞的胞质中呈现颗粒状分布的绿色荧光，ＲＴ－ＰＣＲ扩增出ＥＧＦＰ和ＭｘＡ基因的特异性片断，免疫组化结果显示ＥＧＦＰ报告基因在细胞内的阳性表达，并表现出ＭｘＡ的表达特征，间接证明了ＭｘＡ可在鸡细胞中表达。ＭｘＡ基因真核表达载体的成功构建以及在鸡细胞中的表达为进一步研究ＭｘＡ基因在抗禽病毒性疾病中的应用打下了基础。
２结果
２．１重组质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－ＭｘＡ的构建与鉴定体外连接转化获得的重组质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－ＭｘＡ
经ＰＣＲ和酶切进行鉴定。酶切鉴定的结果表明，ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－ＭｘＡ质粒经过ＥｃｏＲＩ单酶切后，可获得单一的６．７ｋｂ条带；经ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ双酶切后，电泳结果显示有两条分别约为４．７ｋｂ和２ｋｂ的条带，与ｐＥＧＦＰ－Ｃ１载体和ＭｘＡ全基因片段的长度相符（图１）。以ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－ＭｘＡ质粒为模板，采用ＥＧＦＰ和ＭｘＡ两对特异性引物进行双重ＰＣＲ扩增，结果显示扩增出４６０ｂｐ左右和８１０ｂｐ左右的特异性条带（图２）。上述结果证实ＭｘＡ基因已正确插入了ｐＥＧＦＰ－Ｃ１载体，成功获得了重组质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－ＭｘＡ。２．２重组质粒转染细胞后的荧光检测
重组质粒转染到ＣＥＦ４８ｈ后，用荧光倒置显微
图１重组质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－ＭｘＡ酶切鉴定Ｍ： λ-ＨｉｎｄＩＩＩｄｉｇｅｓｔＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１：ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ双酶切质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１；２：ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ双酶切重组质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－ＭＸＡ；３：ＢａｍＨＩ单酶切重组质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－ＭＸＡ。
图２重组质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－ＭｘＡ的ＰＣＲ鉴定Ｍ１：１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ；１、２：以重组质粒为模板扩增ＥＧＦＰ和ＭｘＡ目的片段；３：以质粒ｐＣＤＮＡ３．１（＋）－ＭｘＡ为模板扩增ＭｘＡ目的片段；４：以质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１为模板扩增ＥＧＦＰ目的片段；５：阴性对照；Ｍ２： λ-ＨｉｎｄＩＩＩｄｉｇｅｓｔＤＮＡｍａｒｋｅｒ。
刘莉等：抗病毒基因ＭｘＡ真核表达载体的构建及在鸡细胞中的表达
203
镜观察到ＣＥＦ中绿色荧光蛋白的表达，且呈现出胞浆中颗粒状表达，胞核中无表达的特征现象（图３Ａ），而空载体质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１转染ＣＥＦ，镜下可见绿色荧光分布在细胞质和细胞核内，细胞质内的荧光强度较均匀，细胞核的绿色荧光强度强于细胞质（图３Ｂ），阴性对照组的细胞未见绿色荧光。
关键词ＭｘＡ基因；转染；表达；鸡细胞
随着家禽高密度集约化生产的发展，家禽爆发的疾病越来越多，特别是人畜共患病－禽流感有不断爆发蔓延的趋势，给人类的健康和禽业的发展构成了巨大的威胁［１］。迄今为止，病毒性疾病的治疗仍是难题。干扰素（ＩＦＮ）具有很强的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节的生物学活性，作为ＩＦＮ抗病毒重要的机制之一是通过诱导抗病毒蛋白的表达而发挥作用。人ＭｘＡ是由Ⅰ型干扰素诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白家族的成员之一，具有ＧＴＰ酶活性，ＭｘＡ的广谱抗病毒的作用已被证实［２～４］。家禽中鸭的Ｍｘ无抗病毒活性［５］，鸡的Ｍｘ的抗病毒活性受６３１位氨基酸的影响：当６３１位氨基酸为天冬酰胺时有抗病毒活性，为丝氨酸时则无抗病毒活性［６～７］。本研究采用基因工程重组技术，构建携带绿荧光蛋白和ＭｘＡ融合基因的真核表达质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－ＭｘＡ，再经脂质体介导转染鸡细胞，使ＭｘＡ基因在鸡细胞中表达，旨在为进一步开展ＭｘＡ在抗鸡病毒性疾病中的应用打下基础。
１材料与方法
１．１材料１．１．１质粒与菌株质粒ｐＣＤＮＡ３．１（＋）－ＭｘＡ和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１，以及大肠杆菌ＤＨ５α 均由湖州师范学院细胞工程研究所实验室提供。
１．１．２试剂ＤＮＡｍａｒｋｅｒ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、限制性内切酶、Ｔａｑ酶、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒均为ＴａＫａＲａ宝生物工程（大连）有限公司产品。单克隆抗体ＧＦＰ（Ｂ－２）及免疫组化染色试剂购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ生物技术有限公司。１．１．３鸡胚及其孵化受精蛋来源于广州温氏青山种鸡场，品种为广西土鸡（Ｇｕａｎｇｘｉｎａｔｉｖｅｂｒｏｉｌｅｒｓ），孵化温度为３７．５ ℃，相对湿度为６０％，采用德国ＧｒｕｍｂａｃｈＢＳＳ－４２０自动孵化器孵蛋。１．１．４引物设计与合成根据ＭｘＡ基因序列和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１载体序列设计３对引物用于检测，分别为：检测ＭｘＡ基因的上游引物５＇-ＡＣＧＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡ－ＡＴＧＴＴＣ－３＇, 下游引物５＇-ＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧ－ＡＡＧＣＴ－３＇, 预计扩增靶序列大小为４６２ｂｐ；检测ＥＧＦＰ基因的上游引物５＇ -ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡ－ＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ-3＇, 下游引物５＇-ＧＣＣＴＣＧＡＧＧＡＴＴ－ＡＴＧＡＴＣＡＧＴＴＡＴＣＴＡＧ-3＇, 预计扩增靶序列大小为８１２ｂｐ；检测ＥＧＦＰ－ＭｘＡ融合基因的上游引物５＇ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ3＇, 下游引物５＇-ＧＣＣＴＣＧＡＧＴＡＴＴＡＴＴＣＴＧＡＧＴＣＣ－
将重组质粒及对照质粒转染后的ＣＥＦ及鸡睾丸组织细胞和未转染的阴性对照细胞提取总ＲＮＡ进行
图３重组表达载体在ＣＥＦ中表达Ａ：ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－ＭｘＡ转染ＣＥＦ；Ｂ：ｐＥＧＦＰ－Ｃ１转染ＣＥＦ。
图４重组表达载体在鸡睾丸组织细胞中表达 A: pEGFP-C1- MxA 转染鸡睾丸细胞; B: pEGFP-C1 转染鸡睾丸细胞。
收稿日期：２００７－１０－２５接受日期：２００７－１２－０７国家自然科学基金项目（Ｎｏ．３０５００２７０），浙江省科技计划重点项目（Ｎｏ．２００５Ｃ２２０５２），浙江省自然科学基金项目（Ｎｏ．Ｙ３０４１９４）资助＊通讯作者。Ｔｅｌ：０５７２－２３２２０５３，Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｃｚｈａｎｇ＠ｈｕｔｃ．ｚｊ．ｃｎ
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·研究论文·
ＧＧＡＣＴＴＧＴＡＣ-3＇, 预计扩增靶序列大小为２７６５ｂｐ。引物由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成。１．２方法１．２．１重组质粒的构建、转化及鉴定提取质粒ｐＣＤＮＡ３．１（＋）－ＭｘＡ和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１，采用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＡｐａＩ分别对两种质粒双酶切，并用胶回收试剂盒回收ＭｘＡ目的基因片段和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１载体片段，然后利用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，连接产物转化至ＤＨ５α 感受态细胞。转化子经ＰＣＲ筛选后，提取质粒，采用酶切和双重ＰＣＲ鉴定重组质粒。１．２．２转染细胞的制备［８］鸡胚成纤维细胞（ｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＣＥＦ）取自９￣１０日龄的鸡胚。将其除去头部、翅膀及内脏；用ＥＤＴＡ－胰蛋白酶消化后，细胞悬液经３００目网筛过滤，离心去上清液，重悬细胞沉淀并计数。以５×1０５个／ｍｌ的密度接种到培养瓶中，于３８．５ ℃、５％ＣＯ２、饱和湿度条件下培养，待细胞铺满培养瓶底部时，进行常规消化传代，以５×１０５个／ｍｌ的密度接种于２４孔培养板中，于３８．５ ℃、５％ＣＯ２浓度、饱和湿度条件下培养。待汇片至７０％￣８０％时用于细胞转染。