下载文档原格式
组织病理学技术组织病理学技术一. 实验综述组织病理学切片技术是融解剖学、组织胚胎学及技术、病理学及技术和临床于一体的综合性课程。
是一门新兴的学科。
在当今不断发展、变革的社会中，在学科相互融合，知识相互渗透，技术不断发展、概念不断更新的时代，在时代要求综合素质人才辈出的今天，组织病理学切片技术的兴起尤为必要和重要。
主要任务是：使学生获得和掌握学会观察人体重要器官的解剖学特征、组织学结构、病理学变化并联系相关功能，从而在形态上观察、机能上分析、综合上判断和科学上研究疾病。
同时联系病变器官的代谢和机能的改变，探讨疾病的病因、发病机制以及病理变化与临床表现的内在联系和相互的关系。
为由基础走向临床打下坚实的基础。
二. 实验目的1. 掌握病理组织切片的基本制作过程步骤2. 掌握病变器官的代谢和机能的改变3. 明白病理组织切片制作过程中的注意事项4. 了解病理切片的制作程序及仪器的操作和注意事项二.实验材料1. 实验材料：手术盘、镊子、手术刀、石蜡、小鼠病理组织、纱布、烧杯、脱水机、塑料包埋盒、水浴锅、切片机、染色机、载玻片、盖玻片、铅笔、标签2. 实验试剂：福尔马林、酒精（50% 55% 70% 75% 80% 85% 95% 无水浓度）、二甲苯、苏木素、盐酸酒精、伊红染液、树胶四.实验步骤（一）取材从尸体解剖材料或临床手术切除的待检材料上选取供作切片标本的病理组织切块，称为取材。
1. 取材要全面具有代表性，能显示病变的发展过程。
为此要选取病变显著的区域和可疑灶，在统一组织块中最好包括病灶及其周围的健康组织，并应包含该器官的主要结构部分。
较大而重要的病变可从病灶中心到外周的不同部位取材，以反映病变各阶段的形态学变化。
2. 取材时要尽量保持组织的自然状态与完整性，避免认为变化。
为此，切取组织块的剪刀要锋利，切取时勿使组织受挤压、拉扯胡揉搓。
3. 组织块的大小要适当，通常其长、宽、厚以 1.5 X1X 0.4cm为宜，必要时可增大到2X 1.5 x 0.5cm,以便于固定液迅速浸透。
酶组织细胞化学技术酶组织化学技术的基本原理及方法1、金属沉淀反应，如硫代胆碱铜法，可证明胆碱酯酶和酯酶；2、藕联偶氮色素法3、色素形成与染色法一碱性磷酸酶（AKP）AKP最适宜PH值为9.2-9.4，可被金属阳离子或某些氨基酸激活，多见于活跃的部位，如小动脉、肾小管上皮等。
⏹AKP染色方法:1、Gomri钙钴法：AKP为黑色注意事项：此法对含铁血黄素和钙盐也可形成棕黑色沉淀，必要时应予以鉴别。
并且用于透明的二甲苯为AR级别。
2、Gossrau偶氮吲哚酚法：酶活性部位呈暗褐色（坚牢蓝VB）、浅红色（坚牢蓝BB）、蓝色（坚牢紫B）二酸性磷酸酶（ACP）ACP前列腺活性最强，在肝脏内毛细胆管旁活性最强。
⏹ACP染色方法:1、Berry硝酸铅法：ACP为棕黑色，特异性抑制酶是氟化钠。
2、Leder-Stutt改良萘酚AS-TR磷酸酯法：ACP为红色。
三三磷酸腺苷酶（ATP）ATP分为三类：膜性ATP、肌球蛋白ATP、线粒体ATP，以上三种酶不可用甲醛固定，用冷冻法。
⏹ATP染色方法：1、Wachstein-Meisel镁激活酶法：ATP为棕黑色。
2、Dubowitz-Brooke钙激活酶法：A TP为棕黑色。
注意事项：镁激活的ATP正常肝定位于毛细胆管；钙激活ATP区分于红肌纤维和白肌纤维有意义，对于区分神经性肌萎缩和肌源性肌萎缩有价值。
四胆碱酯酶（CHE）广义胆碱酯酶分为胆碱酯酶和乙酰胆碱酯酶，胆碱酯酶的活性中心是丝氨酸，主要分布于血浆、胰腺和唾液腺；乙酰胆碱酯酶主要分布于神经肌肉接头等处。
CHE染色法1、Snell-Garrett胆碱铜法：CHE呈黄色或棕黄色。
2、Karnovsky-Roots铁氰化铜法：CHE呈红棕色或深棕色。
核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术：具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。
杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。
1.什么是病理学技术？病理学技术（组织标本切片和染色技术）是组织学、病理学等学科用于观察和研究组织与细胞的正常形态及病理变化的常用方法。
2.组织制片的目的。
生物学标本在生活状态下多为无色透明，而且组织一旦离开机体后很快就会死亡，其结构就会失去正常状态,必须对组织采取固定、切片和染色措施！3.何谓组织制片技术？组织经过固定、切片和染色后，光波通过被检组织成分时，波长和振幅发生改变，在显微镜下能清晰的观察其组织结构，称之为光镜标本的基本制作方法或称为组织制片技术。
4.组织制片种类及其各类方法的分类。
（一）组织非切片制作方法：组织分离标本组织活体标本组织涂片标本磨片标本整体封存（压片）标本组织铺片标本组织印片标本等（二）组织切片法：1.石蜡切片法 2.火棉胶切片法 3.冰冻切片法4.超薄切片法（电镜技术） 5.树脂切片 6.碳蜡切片5.组织制片的主要程序。
取材、固定----脱水-----透明、浸渍-----包埋、切片----贴片、染色---浸洗----脱水----透明----封固6.实验动物处死常用方法及优缺点。
1）挥发性麻醉剂（吸入麻醉）包括：乙醚、氯仿等。
优点：乙醚吸入麻醉适用于各种动物，安全度亦大，动物麻醉深度容易掌握。
缺点：是对局部刺激作用大，可引起上呼吸道粘膜液体分泌增多、肺部充血，再通过神经反射可影响呼吸、血压和心跳活动，并且容易引起窒息，故在乙醚吸入麻醚时必需有人照看，以防麻醉过深而致动物死亡。
2）非挥发性麻醉剂（注射麻醉）这类麻醉剂种类较多，包括10%苯巴比妥钠、4%戊巴比妥、5%硫喷妥钠等巴比妥类的衍生物，20%氨基甲酸乙脂（乌拉坦）和1%水合氯醛、氯胺酮等，可通过肌肉注射、静脉注射、腹腔注射。
优点：这些麻醉剂使用方便，一次给药可维持较长的麻醉时间，麻醉过程较平衡，动物无明显挣扎现象。
3）断髓（脱臼）法动物处死过程中动作要迅速，尽量避免其长时间处于痛苦或濒于死亡状态，以免机体内组织或细胞结构发生改变引起人工假象。
常用病理学技术操作规范总则引言病理学技术操作是病理学研究中的重要环节，其规范与科学性直接影响着病理学诊断的准确性和质量。
本文档旨在总结常用病理学技术操作的规范和要点，以指导病理学工作者正确进行病理学技术操作，并提高工作效率和结果可靠性。
一、标本采集与处理1.标本采集前应仔细了解病史及临床资料，选择合适的标本采集方式和部位。
2.采集标本时，应使用合适的采集工具，避免污染和破坏标本。
3.采集的组织标本应立即固定，避免标本变质和损伤。
4.标本固定时，应选择合适的固定液和固定时间，保证标本质量。
二、常用病理学技术操作规范1. 组织切片制备1.切片时要避免空气和切片机械对组织的伤害，保证组织完整性。
2.切片时应调节切片机的切片速度和切片角度，以得到理想的切片厚度和形状。
3.切片后应及时将切片转移到水中，避免干燥和切片断裂。
4.切片后的组织应分别置于不同的玻片上，避免混淆或丢失。
2. 染色技术操作1.组织切片上染色前，应对切片进行脱蜡处理，以去除蜡质。
2.将切片置于染色剂中时，应根据染色方法和要求，确定适当的染色时间。
3.染色后应将切片洗净，以去除多余的染色剂和降低背景染色。
4.染色后的切片应控制晾干时间，以确保切片上没有水分。
3. 免疫组化技术操作1.免疫组化前，应对切片进行抗原修复处理，以增强抗原的特异性。
2.选用适当的抗体和染色方法，确保准确的免疫反应结果。
3.免疫反应后，应对切片进行显色处理，并确定合适的显色时间。
4.洗净切片后，应进行脱水和封片操作，以保护切片和固定免疫结果。
4. 电镜技术操作1.电镜前，应对切片进行适当的去蜡和再固定处理，以保持细胞超微结构的完整性。
2.选择合适的电镜片和工作距离，以获得清晰的电镜图像。
3.对电镜图像进行拍摄时，应注意曝光时间和对焦准确度。
4.完成电镜操作后，应对切片进行处理，以使其适宜保存和观察。
三、实验室安全操作要点1.进入实验室前，进行个人防护装备的佩戴，并了解相关实验室安全规定。
病理学：病理学是研究疾病发生发展规律的学科，主要的研究范围是疾病发生发展过程中组织、细胞代谢、功能及结构的变化。
取材：组织标本的选择即取材，取材的目的是正确的获取所需要的标本或标本的某一部位。
组织的固定：将各种组织浸入某些化学试剂内，使细胞内的物质能尽量保持其生活状态的形态结构和位置，叫做固定。
Carnoy液：固定胞浆和胞核,对染色体固定佳,显示DNA和RNA效果好.也常用于糖原和尼氏体的固定.不能保存脂质有防止酒精的硬化收缩作用,穿透力强,适用于外膜致密的组织脱水：某些溶剂置换组织内水分的过程，能够使组织脱水的化学物质称为脱水剂。
透明：组织经酒精脱水后，还必须经过一个媒剂透明过程浸蜡：经过透明的组织块，进一步移入熔化的石蜡内浸渍，称为浸蜡。
用其他浸透剂（火棉胶，碳蜡，明胶等）渗入组织内部的过程称为浸透或透入包埋：使用包埋剂将处理过的组织包于其中，使组织达到一定韧度和硬度，有利于切片。
组织芯片：又称组织微列阵，是将数十个、数百个、乃至上千个小的组织片整齐的排列在某一载体上（通常是载波片）而成的微缩组织切片。
石蜡切片：组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程称为石蜡切片法。
HE染色（常规染色）：使用苏木精hematoxlin和伊红eosin染色，主要用以显示各种组织、细胞的一般形态结构以及疾病过程中病变的发生、发展及修复的过程。
封固剂：使染色后的组织封固于载玻片与盖玻片之间而不与空气直接接触，避免氧化褪色；折光率与玻片的折光率相似。
抗原修复：组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。
抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术：是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，通过机械的方法断开因福尔马林固定的导致的抗原表位和不相关蛋白间的交联键，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复，使抗体更好的渗透，与表位结合。
一.大纲要求掌握临床病理检查的种类及目的；掌握临床病理检查的的流程及注意事项；.熟悉病理学常用新技术的原理及应用二.基本内容（一）.基本概念1. 活体组织检查（biopsy）：简称“活检”，从活体身上的病变或可疑病变处采取小块组织作病理检查，以明确病变的性质。
2. 冰冻切片快速诊断(frozen sextion) ：用不经固定的新鲜标本，快速冷冻至-18度以下，进行切片、HE染色，一般在20～30min内完成定性诊断。
3. 细胞学检查（cytology）：通过对患者病变部位脱落、刮取和穿刺抽取的细胞进行病理形态学的观察，并作出定性诊断。
目前主要用于肿瘤的诊断，判断有无肿瘤细胞，是良性或恶性。
也用于某些内部器官炎症性疾病的诊断和激素水平的判定等。
4. 苏木素－伊红染色（HE染色）：被称为常规染色方法，能较好地显示组织结构和细胞形态，可用于观察、描述正常和病变组织的形态学。
而且HE切片可较长时间保存，因而是生物学和医学领域中最基本也是应用最广泛的染色方法。
染色结果：细胞核呈蓝色，胞质、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色。
钙盐和微生物也可染成蓝色或蓝紫色5. 组织化学技术（histochemistry technique）：又称特殊染色，其基本原理是利用病变组织内某些物质的化学特性，用特殊染料将它们显示出来，从而协助鉴别HE染片内不易区别的病变或物质。
6. 免疫组织化学(immunohistochemistry)：根据抗原抗体特异性结合的免疫学原理，将预先制备的特异性抗体加在组织切片上，使之与相应的抗原结合。
特异性抗体通过某种方式连结辣根过氧化酶或碱性磷酸酶。
显色剂在酶的作用下氧化沉淀，将抗体所检测的抗原在组织切片上显示出来。
7. 生物芯片技术(biochip technique)：是将大量具有生物识别功能的分子或生物样品有序的点阵排列在支持物上并与标记的检测分子同时反应或杂交，通过放射自显影、荧光扫描、化学发光或酶标显示可获得大量有用的生物信息的新技术。
