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细胞培养系列方法【实验前准备】（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。
（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。
细胞的冻存与复苏【实验用品】（1）材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞（2）试剂： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗（3）设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作酒精灯、水浴锅、CO2台。
试剂配制：（1）完全培养基含90%DMEM培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。
（2）冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混匀，置于4℃冰箱中备用。
细胞的冻存(1)依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。
(2)收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min离心5min。
(3)弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5*106-1*107个/ml。
(4)每个冻存管分装细胞悬液1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。
(5)在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。
(6)将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过夜→转入液氮灌中。
细胞的复苏（1）准备水浴锅，调温度至37℃。
打开离心机。
（2）用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38℃水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。
（3）用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。
（4）将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。
（5） 1000r/min离心5min，弃上清液。
（6）加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。
大鼠原代心肌成纤维细胞冻存与解冻桂林赛奥生物技术有限公司鼠原代心肌成纤维细胞（Primary cardiac fibroblasts）是一种源于新生S-D大鼠心脏组织的亚克隆原代成纤维细胞，保有成纤维细胞原有的多种生物学性质，包括弹性蛋白和AT1受体的表达以及少量肌球蛋白的表达，可增殖传代数次。
成品使用冻存管储存于-190℃液氮罐中。
一般，每个冻存管所含细胞数 >5 x 105 。
1、使用前应分步解冻，操作步骤如下：z预先将解冻培养基置于37℃ 水浴中加热；z将细胞冻存管从液氮罐中取出并迅速（数分钟内）将其置入37℃水浴中；z把解冻培养液加到培养瓶或培养皿内；z缓慢地（不得少于1分钟）把细胞接种到培养瓶或培养皿；z将已经接种细胞的培养瓶或培养皿置于二氧化碳培养箱内，不要过度振摇。
当细胞贴壁时（通常需要数小时），更换新鲜生长培养基并继续培养。
在细胞长满之前作次（传）代培养。
2、次代培养z将培养瓶或培养皿中的培养液吸弃；z用2 ml 的0.25% (w/v) Trypsin-0.53 mM EDTA溶液简单清洗细胞层；z加3 ml的Trypsin-EDTA溶液，置37℃二氧化碳培养箱中, 在倒置显微镜下观察细胞层脱落；z加入7.0 ml完全生长培养基，用吸液管轻轻抽吸细胞使细胞分散；z按照1:4～6的比例将细胞再次接种于新的培养瓶或培养皿中， 置37℃二氧化碳培养箱中培养；z每2～3天更换一次新鲜培养基。
3、解冻培养液：17ml去离子水+3ml胎牛血清（FBS）混合而成4、生长培养基：Dulbecco’s改良任格氏培养基（DMEM），含10% FBS以及1000U/L 青霉素、1mg/L链霉素。
5、培养条件：95%空气；5%CO2；温度37.0℃。
6、细胞储存需要冷冻液，方法: 生长培养基添加DMSO，浓度为 7.5% (v/v) 。
细胞储存应分步进行，步骤：从 -20℃ 降到 -80℃ ( -80℃ 冰箱或液氮气) ，放置数小时，然后转入-190℃ 液氮(罐)中。
小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体方法及步骤将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
2. 试剂无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。
3. 器械眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml 和15 ml离心管和手术刀片。
以上物品均需要高压灭菌消毒处理。
二、具体操作1. 处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
2. 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。
3. 用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。
4. 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。
5. 细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。
6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。
2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。
3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。
4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。
5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。
6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。
7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。
8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。
9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。
10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。
11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。
12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。
13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。
14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。
15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。
人眼Tenon's囊成纤维细胞原代培养的研究陈珺;李宁;廖荣丰【摘要】目的探讨体外培养原代人眼Tenon's囊成纤维细胞的方法及其生长特性,为抗纤维化研究提供靶细胞模型.方法取翼状胬肉及斜视手术患者的Tenon's囊组织,用组织块法培养原代成纤维细胞.用免疫荧光方法鉴定细胞.对细胞进行传代、冻存和复苏的观察.对复苏后的细胞行MTT法检测其活力并绘制生长曲线.结果入眼Tenon's囊成纤维细胞可以在体外用组织块方法培养出来,呈典型的长梭形.免疫荧光鉴定细胞波形蛋白染色阳性.细胞多次传代后依然生长迅速,3d即可长满瓶底.复苏后细胞2～6d处生长对数期,增殖能力良好.结论人眼Tenon's囊成纤维细胞体外生长状态良好,可以液氮冻存,复苏后细胞活力较强,可以用于抗纤维化增生的基础研究.【期刊名称】《临床眼科杂志》【年(卷),期】2016(024)001【总页数】4页(P1-4)【关键词】人Tenon囊;成纤维细胞;细胞培养技术【作者】陈珺;李宁;廖荣丰【作者单位】230022 合肥,安徽医科大学第一附属医院眼科;230022 合肥,安徽医科大学第一附属医院眼科;230022 合肥,安徽医科大学第一附属医院眼科【正文语种】中文纤维增生性疾病在多个医学领域(包括眼部、皮肤、整形和肿瘤等)中尚属治疗难点，对其发生发展和机制还有待进一步研究[1，2]。
瘢痕化的形成是其共同的表现，瘢痕化的产生主要是与多种细胞因子的产生、细胞及细胞外基质活动有关的生物学过程[3-7]。
其中人眼Tenon's囊成纤维细胞(human Tenon's capsule fibroblasts,HTFs)的过度增殖是纤维瘢痕化的主要原因，所以探索简单快速地培养出大量HTFs，观察其生长特性，研究细胞经过数次传代、液氮冻存及复苏后的活力如何，为抗瘢痕化的研究提供理想细胞模型。
一、取材本实验已经安徽医科大学第一附属医院伦理委员会审核批准，人眼Tenon's囊组织均取材于本院斜视及翼状胬肉手术患者，患者均签署知情同意书，无既往眼部手术史，术中打开结膜囊暴露Tenon's组织，取材约5 mm×5 mm大小并放入含DMEM培养液的无菌离心管中，装入无菌冰盒带回实验室。
培养细胞的冷冻保存与复苏⏹概述✧冻存过程⏹冷冻保存与复苏的原理✧冻存结果♦冷冻速率✧讨论♦冷冻保存温度⏹冻存细胞的复苏♦复温速率♦非玻璃化冻存细胞的复苏♦冷冻保护剂✧主要材料⏹冷冻保存方法✧复苏过程♦非玻璃化冻存方法✧结果✧主要材料✧讨论✧冻存过程♦玻璃化冻存细胞的复苏✧冻存结果✧主要材料✧讨论✧复苏过程♦玻璃化冻存方法✧结果✧主要材料✧讨论⏹Polge等人（1949)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于—790C下精子的存活率。
接下来的重大进展是Luyet（1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。
他们的结论是,电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。
冷冻理论后来得到Merryman（1956)、Rey(1957）以及Smith （1961）等学者的继续和发展。
1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂.Lovelock(1959）等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜(DMSO）。
而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。
目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。
返回页首冷冻保存与复苏原理在低于—700C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。
水在低于零度的条件下会结冰.如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。
这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤.如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。
如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏,细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡.这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤.当温度进一步下降，细胞内外都结冰,产生冰晶损伤.但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤.因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点,减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存.在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间,从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。
人皮肤成纤维细胞库的构建试剂: 胶原酶(Sigma)，优质胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Sigma)，中性蛋白酶(Sigma)，DMEM培养基(Sigma)，二甲基亚砜(Merck)。
配液 :成纤维细胞培养基配制:DMEM10g，NaHCO3 3．7g，HEPES 2．4g，优质胎牛血清100ml，青霉素100 000U，链霉素100 000U，超纯水加至1 000ml，用1N NaOH 调pH值至7-2～7．4，0．22pan孑L滤膜过滤除菌，9Om】／瓶分装，一2O℃贮存备用。
D—Hanks 平衡盐液：NaC1 8．0g，KC1 0．4g，Na2HPO4·12H：0 134．4mg，KH~PO4 0．06g，NaHCO3 0．35g，酚红O．O2g，青霉素100000U，链霉素100000U，超纯水加至1 o0Ornl，用1N NaOH调pH值至7．2-7A，0．22tun孔滤膜过滤除菌，90ml／瓶分装，一2O℃贮存备用。
方法:乙醇棉球将标本用力擦拭3遍；标本移至培养皿中，用D—Hanks平衡盐液反复用力彻底冲洗标本5遍，直至标本发白，轻度发胀；在培养皿中修剪皮下筋膜组织及多余的皮下脂肪，将标本剪成0．3cmx2．0em大小的皮条，置于培养皿中，加0．25％胰蛋白酶浸没组织，4℃冰箱中消化14~16h，以用眼科镊能轻轻揭下表皮为度；消化后的标本置于超净工作台上。
吸出胰蛋白酶，用DMEM漂洗2遍，中止胰蛋白酶消化作用；用眼科镊轻轻揭下表皮，置于另一培养皿中(用于培养角质形成细胞)，真皮置于培养皿中，用眼科剪将真皮成分剪成糊状(组织大小约为0．1cmx0．1cmx0．1cm)，加入0．2％胶原酶浸没组织，37℃孵箱中消化1~4h，以将组织基本上消化散开，看不到组织块为度；加D-Hanks平衡盐液1 500#min离心5min，5遍，以洗去胶原酶，沉淀即为成纤维细胞，弃上清，加DMEM制成细胞混悬液，接种至50ml培养瓶中，置37℃、5％CO：、湿度95％的CO 孵箱中培养131。
人皮肤成纤维细胞库的构建试剂：胶原酶(Sigma),优质胎牛血清(GibCo),胰蛋白酶(Sigma),中性蛋白酶(Sigma),DMEM培养基(Sigma),二甲基亚碉(MerCk)O配液:成纤维细胞培养基配制:DMEM1.Og,NaHC033.7g,HEPES2.4g,优质胎牛血清IOOn1.1,青霉素IOoOoOU,链霉素IOoOOOU,超纯水加至IoOOm1,用INNaOH调PH值至7-2〜7.4,0.22Pan孑1.滤膜过滤除菌，90m]/瓶分装，一20℃贮存备用。
D-Hanks平衡盐液：NaC1.8.0g,KC1.0.4g,Na2HPO4∙12H：0134.4mg,KH~P040.06g,NaHC030.35g,酚红0.02g,青霉素IO(X)OOU,链霉素IooooOU,超纯水加至1OOorn1,用INNaoH调PH值至7.2-7A,0.22tun孔滤膜过滤除菌，90m1./瓶分装，一20C贮存备用。
方法:乙醇棉球将标本用力擦拭3遍；标本移至培养皿中，用D-Hanks平衡盐液反复用力彻底冲洗标本5遍，直至标本发白，轻度发胀；在培养皿中修剪皮下筋膜组织及多余的皮下脂肪，将标本剪成0∙3cmx2.Oem大小的皮条，置于培养皿中，加0.25%胰蛋白酶浸没组织，4°C冰箱中消化14~16h,以用眼科镣能轻轻揭下表皮为度；消化后的标本置于超净工作台上。
吸出胰蛋白酶，用DMEM漂洗2遍，中止胰蛋白酶消化作用；用眼科镜轻轻揭下表皮，置于另一培养皿中(用于培养角质形成细胞)，真皮置于培养皿中，用眼科剪将真皮成分剪成糊状(组织大小约为0.1CmXo.1CmX0.1cm),加入0.2%胶原酶浸没组织，37。
C孵箱中消化1.~4h,以将组织基本上消化散开，看不到组织块为度；力IW-HankS平衡盐液1500#Inin离心5min,5遍，以洗去胶原酶，沉淀即为成纤维细胞，弃上清，力口DMEM制成细胞混悬液，接种至50In1.培养瓶中，置37°C、5%C0：、湿度95%的CO孵箱中培养131。
细胞生物学实验实验报告nThis XXX。
cytochemistry。
XXX。
cell culture and analysis。
cell cycle analysis。
cell n and analysis。
XXX to study the structure。
n。
and us laws of life of animal and plant cells.Chapter 1 Overview1.1 XXXXXX and structure of cells。
study cell logical processes。
conduct cell culture and analysis。
and study cell XXX.Chapter 2 Experimental PrinciplesIn this experiment。
XXX cells。
XXX。
cytochemistry。
XXX。
cell culture and analysis。
cell cycle analysis。
cell n and analysis。
XXX processes。
cell culture and analysis。
and cell XXX.2.1 实验流程和应用实验方法在本研究中，我们使用了多种实验方法来研究细胞的生理和遗传学特性。
其中，细胞器活体染色和显微观察是我们最常用的方法之一。
我们使用荧光染料来标记不同的细胞器，如线粒体、内质网和高尔基体，并使用显微镜观察它们在细胞中的位置和分布。
此外，我们还观察了细胞骨架的形态和组成，并使用冷冻保存技术来保存细胞的样本。
2.2 细胞器活体染色与显微观察为了观察细胞器在活体细胞中的分布和位置，我们使用了多种荧光染料。
例如，我们使用MitoTracker Red来标记线粒体，使用ER-Tracker Green来标记内质网，使用BODIPY FL C5-ceramide来标记高尔基体。
1. 掌握动物细胞培养的基本技术，特别是细胞贴壁生长的过程。
2. 观察细胞在体外培养中的生长和形态变化。
3. 学习细胞传代培养的方法和注意事项。
二、实验原理细胞贴壁生长是指动物细胞在体外培养过程中，细胞会附着在培养皿或瓶壁上，形成单层细胞层。
这一过程依赖于细胞表面的粘附分子与培养皿表面的相互作用。
细胞贴壁生长是动物细胞培养的基础，也是进行细胞生物学研究、药物筛选和基因治疗等实验的前提。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 小鼠成纤维细胞（或其它动物细胞）- 培养基（DMEM或RPMI-1640）- 10%胎牛血清- 0.25%胰蛋白酶- 灭菌的细胞培养皿- 灭菌的移液器- 灭菌的移液管- 培养箱- 显微镜2. 仪器：- 超净工作台- 离心机- 恒温水浴锅1. 细胞复苏：将冻存的细胞取出，在37℃水浴中快速解冻，然后加入适量的培养基，用移液器吹打均匀，使细胞分散。
2. 制备细胞悬液：将细胞悬液用移液器吹打均匀，确保细胞均匀分布。
3. 接种细胞：将制备好的细胞悬液加入培养皿中，每皿约1×10^5个细胞。
4. 培养：将培养皿放入37℃、5%CO2的培养箱中培养，每隔24小时更换一次培养基。
5. 观察细胞生长：在显微镜下观察细胞的生长和形态变化，记录细胞贴壁、生长和分裂情况。
6. 细胞传代：当细胞长满培养皿底部时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，按照1:10的比例进行传代培养。
五、实验结果1. 细胞在培养皿中迅速贴壁，形成单层细胞层。
2. 细胞呈梭形、多边形或不规则形，细胞之间紧密连接。
3. 细胞不断增殖，形成致密的细胞层。
4. 经过多次传代培养，细胞生长状况良好。
六、实验讨论1. 细胞贴壁生长是动物细胞培养的基础，对于细胞生物学研究、药物筛选和基因治疗等实验具有重要意义。
2. 细胞贴壁生长过程受到多种因素的影响，如细胞种类、培养基成分、温度、CO2浓度等。
3. 在实验过程中，应严格控制实验条件，确保细胞正常生长。
