RT—PCR法克隆广谱抗病基因TGA2及其植物表达载体构建

猪白细胞介素2基因的克隆及腺病毒表达载体的构建周庆丰;刘忠华;龚朋飞;周美华;苏润环;何津佳;毕英佐【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2009(30)1【摘要】根据GenBank中收录的猪白细胞介素2(pIL-2)基因序列,设计1对特异性引物.运用RT-PCR技术从刀豆素(Con A)诱导的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到pIL-2基因,并将其克隆至pGEM-T Easy栽体上.核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长493 bp,含465 bp的开放阅读框,编码154个氨基酸,与已知pIL-2核苷酸序列和氨基酸序列的同源性都高达100%.将克隆的pIL-2基因编码阅读框亚克隆至腺病毒穿梭栽体pShuttle-CMV,电转化含腺病毒基因组(pAdEasy-1)的大肠埃希茵细胞BJ5183-AD-1,成功获得了重组腺病毒DNA,将纯化后的重组腺病毒DNA转染AD-293细胞,经过病毒基因组的PCR鉴定和转录水平的RT-PCR鉴定,初步表明,获得了表达pIL-2的重组腺病毒.【总页数】6页(P17-22)【作者】周庆丰;刘忠华;龚朋飞;周美华;苏润环;何津佳;毕英佐【作者单位】广东省温氏集团研究院,广东,新兴,527400;广东省温氏集团研究院,广东,新兴,527400;广东省温氏集团研究院,广东,新兴,527400;广东省温氏集团研究院,广东,新兴,527400;广东省温氏集团研究院,广东,新兴,527400;广东省温氏集团研究院,广东,新兴,527400;华南农业大学动物科学学院,广东,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】Q785;S858.28【相关文献】1.猪繁殖与呼吸综合症病毒E基因克隆及重组腺病毒表达载体的构建 [J], 刘光瑞;李宝玉;柳纪省;胡永浩2.猪繁殖与呼吸综合征病毒E基因的克隆及其腺病毒表达载体的构建 [J], 邓碧亮;顾万军;黄毓茂3.猪γ干扰素的克隆与序列分析及腺病毒表达载体的构建 [J], 王声会;李中圣;黄毓茂4.绵羊白细胞介素2基因的克隆与表达载体构建 [J], 苗利光;刘艳环;王克坚;李理;刘波;姜晓坤5.猪促卵泡激素α和β亚基基因的克隆及其重组腺病毒表达载体的构建 [J], 李儒曙;汪涛;刘宇;伍时达因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

兰州百合病毒RT-PCR检测技术建立及应用作者：王红梅王立光刘新星李淑洁石有太李忠旺来源：《甘肃农业科技》2021年第03期摘要：病毒病是引起兰州百合产量下降、品种退化的主要原因，准确、高效的病毒检测技术在百合脱毒种球生产和推广应用中十分重要。

根据CMV、LSV和LMoV病毒外壳蛋白基因序列设计引物，以百合18S rRNA为内参照，建立兰州百合病毒RT-PCR、二重RT-PCR检测体系。

对兰州百合主栽区病毒病的抽样调查发现，CMV、LSV带毒率分别达到98%、100%，LMoV检出率在不同时期样品中存在较大差异。

关键词：兰州百合;病毒检测;反转录-聚合酶链式反应;病毒病调查Abstract：Virus disease is the main cause of yield decline and variety degradation of Lilium davidii Var. unicolor. It is very important to master efficient virus detection technologies in the production of virus-free bulb seedball and planting period. The PCR primers were designed according to the sequences of CMV， LSV and LMoV virus coat protein genes， and the virus detection system of RT-PCR and double RT-PCR was established with lily 18S rRNA as internal reference in this study. The results showed that sampling survey of Lilium davidii Var. unicolor. virus disease in mainplanting area， CMV and LSV were 98% and 100% respectively， and detection rates of LMoV were different in different periods samples.Key words：Lilium davidii Var. unicolor; Virus detection; RT-PCR; Virus survey兰州百合（Lilium davidii Var. unicolor）属百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）多年生球根类草本植物，是兰州市最具特色的名优特农产品之一，为中国国家地理标志保护产品[1 ]，2014年“兰州百合”被国家工商总局认定为“中国驰名商标”[2 ]。

植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。

通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。

PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。

PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。

其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。

限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。

通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。

限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。

限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。

连接是植物基因克隆的另一种重要方法。

连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。

连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。

连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。

最后，转化是植物基因克隆的最后一步。

转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。

转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。

其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。

总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。

通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。

植物抗逆生长相关基因的克隆与表达分析植物是具有高度适应性的生物，在自然环境中承受着许多逆境因素的影响，如干旱、盐碱、寒冷、病虫害等。

为了适应这些外界环境的不断变化，植物通过一系列生物化学反应来调节自身的生长发育及代谢活动，以维持其生存。

而在这一过程中，植物抗逆生长相关基因的克隆与表达分析便显得尤为重要。

植物抗逆生长相关基因的克隆一般采用PCR技术，该技术具有快速、灵敏度高、特异性好等优点，在植物分子生物学研究中得到广泛应用。

在PCR反应中，根据已知序列设计合适的引物，通过不断复制反应来扩增目标序列。

PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。

变性阶段使DNA解旋，使模板DNA的双链分离为两条，退火阶段使引物与模板DNA形成互补配对，最后通过延伸阶段在DNA合成酶的作用下扩增目标序列。

PCR反应扩增的产品可以通过测序、核酸电泳等方法进行分析。

植物抗逆生长相关基因的表达分析则可以采用RT-PCR技术。

RT-PCR技术是以RNA为模板，通过反转录和PCR的联合技术来扩增RNA中的目标基因序列。

RT-PCR技术的过程分为两个步骤：反转录和PCR。

反转录首先将RNA转化为一条单链的cDNA，再通过PCR扩增目标cDNA。

RT-PCR技术的优点在于其对RNA含量较少的样本、低丰度的基因表达进行检测时具有敏感性和特异性。

在植物抗逆生长相关基因克隆和表达分析的过程中，为了防止结果产生偏差，控制实验条件尤为重要。

根据不同的研究目的，常用的实验设计包括对照组、处理组和时间序列组等，而实验条件则主要包括样本的采集、保存、提取、反转录、PCR反应条件等。

另外，在实验数据分析过程中，常用的方法包括计算PCR扩增效率、标准化相对表达水平、聚类分析等。

综上，植物抗逆生长相关基因的克隆与表达分析是研究植物适应逆境环境的关键技术，具有重要的科学意义和应用价值。

其中包括对植物逆境响应机制的深入理解、对植物分子育种的支持、对农业生产的推广应用等。

StGAPC和AtGAPC2基因的克隆以及对马铃薯的转化的开题报告1. 研究背景和意义GAPC（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）是糖解途径中重要的酶之一，参与葡萄糖代谢过程，其编码基因GAPC也对植物的生长发育和环境应答具有重要作用。

目前已经在多种植物中进行了该基因的克隆和功能研究，但在马铃薯中仍未有详细报道。

因此，本研究旨在克隆马铃薯中的GAPC基因并进行转化，探究其在马铃薯中的生物学功能，对马铃薯的品质改良和抗逆性增强等方面有一定的参考价值。

2. 研究内容和目标本研究将分为以下两个方面进行：(1) 克隆StGAPC和AtGAPC2基因。

从马铃薯和拟南芥中分别进行基因组和转录组的测序分析，并进行基因克隆。

(2) 将StGAPC和AtGAPC2基因分别构建进植物表达载体，并将其分别转化到相应的植物中，验证其在植物生长发育和环境应答中的生物学功能。

本研究的主要目标是通过对马铃薯中GAPC基因的研究，揭示其在马铃薯生长发育和逆境应答中的生物学功能，为马铃薯的品质改良和抗逆性提高提供一定的理论基础和技术支持。

3. 研究方法和技术路线(1) 克隆StGAPC和AtGAPC2基因。

采用基因组测序和RT-PCR技术分别从马铃薯和拟南芥中克隆GAPC基因，并进行生物信息学分析和序列比对。

(2) 植物表达载体构建。

将StGAPC和AtGAPC2基因分别克隆至植物表达载体，如pCAMBIA1300和pBI121中，并进行序列验证和酶切分析。

(3) 植物转化。

利用农杆菌介导的遗传转化方法将构建好的表达载体分别转化到马铃薯和拟南芥中，筛选并鉴定转基因植株。

(4) 技术检测和表型分析。

通过生理生化和分子生物学方法对转基因植株进行功能和表型分析，如酶活性测定、RT-PCR、Western blot、SOD 和CAT等相关酶活性分析，以及植物的生长变化、叶片形态、干重、鲜重、根系结构等性状的比较分析。

第31卷第8期西南大学学报(自然科学版)2009年8月Vol131No18Journal of Southw est U niv ersity(N atural Science Edition)Aug12009文章编号:1673-9868(2009)08-0073-05青蒿CY P71AV1和CPR基因的克隆及其双元植物高效表达载体的构建¹任肃霞1,2,3,杨春贤1,2,3,陈敏4,廖志华1,2,311西南大学生命科学学院,重庆400715;21重庆市甘薯研究中心,重庆400715;31三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆400715;41西南大学药学院,重庆400716摘要:采用RT-P CR方法从青蒿中克隆紫槐二烯氧化酶基因和细胞色素P450还原酶基因编码区序列,正向插入经改造后获得的双元三价植物高效表达载体p1304*中,构建植物表达载体p1304*-CP R-C YP71A V1,并将该表达载体导入根癌农杆菌L BA4404,获得可直接用于遗传改良青蒿的工程菌p1304*-CPR-CYP71A V1-LBA4404,为利用植物基因工程技术提高青蒿素产量奠定了基础.关键词:青蒿素;紫槐二烯氧化酶;细胞色素P450还原酶;载体构建中图分类号:Q94312文献标识码:A青蒿素是从药用植物青蒿即黄花蒿[1](A r temisia annua L1)中提取的新型抗疟疾特效药,需求量很大,而野生青蒿植株中青蒿素的含量很低,只占其干质量的0101%~011%[2],在国际市场上供不应求.因此如何提高青蒿素产量成为研究热点,通过基因工程技术改造野生青蒿是最有潜力的途径之一.紫槐二烯氧化酶(am orpha-4,11-diene C-12o xidase,CYP71A V1)是一种新型的细胞色素p450单加氧酶,可以催化多种倍半萜内酯的生物合成前体物质的氧化反应[3-4].CYP71AV1在青蒿素生物合成过程中催化紫槐二烯的羟基化,同时还可能继续参与催化后续反应,使其依次生成青蒿醇、青蒿醛、青蒿酸[5-6],而青蒿酸则是生成青蒿素的直接前体[7].Dae-Ky rn Ro等成功克隆了青蒿CYP71A V1基因和细胞色素还原酶(Cytochr ome p450r eductase,CPR)基因,并在酵母中表达,通过GC-M S法检测发酵产物.结果发现,在只转化了CPR 基因的酵母中没有检测到青蒿酸,但在CYP71A V1基因和CPR基因共表达的酵母中,检测到的青蒿酸含量达(32?13)mg/L,青蒿醇的含量不及青蒿酸的5%,且完全不生成青蒿醛.证明CYP71AV1与它的氧化还原伴侣即CPR共表达时,能提高青蒿酸的产量[8].本研究旨在构建C YP71A V1基因和CPR基因的双元植物表达载体,并获得重组工程菌,为利用基因工程技术培育高产青蒿素的青蒿奠定基础.1材料与方法111材料红杆青蒿(重庆市中药研究院张明研究员提供)采自酉阳,栽培于西南大学生命科学学院.大肠杆菌DH5a感受态细胞、根癌农杆菌LBA4404、质粒pCAM BIA1304+均为本实验室保存.植物组织RNA提取试剂盒(北京天为时代公司),胶回收(小量)试剂盒、质粒提取(小量)试剂盒(上海华舜), DNA Lig ation试剂盒、pM D18-T Vector试剂盒、RNA PCR试剂盒(TAKARA公司),DNA分子量标准¹收稿日期:2008-09-25基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(30771238).作者简介:任肃霞(1984-),女,山西晋中人,硕士研究生,主要从事植物次生代谢产物研究.通讯作者:廖志华,教授.DL2000、荧光染料Goldv iew (上海生工),pfu DNA 聚合酶(T OYOBO 公司),氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福霉素(Rif)、链霉素(Str)(北京鼎国).112 青蒿总RNA 提取自青蒿幼苗各部位混合取样约100mg,在液氮中迅速研磨成细粉,用植物组织RNA 提取试剂盒提取青蒿总RNA.1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 质量(110V,80m A,15min,Goldv iew 染色),紫外分光光度法检测RNA 纯度和浓度.113 引物设计根据已报道的青蒿CYP 71A V1(登录号:DQ268763)和CPR (登录号:DQ318192)编码区序列设计特异性引物(表1).表1 CYP 71AV 1和CPR 基因编码区的克隆引物名称引物序列酶切位点F CYP71A V15-GCT CT A GA A T G A AG AG T A T A CT A A A AG CA -3X ba I R C YP71A V15-CCCGG A T CCCT A G AA A CT T G GA A CG A GT A -3Bam H I F aaCPR5-CCA CT A GT AT GCA AT CA A CA ACT T CCG -3Sp e I R aaCP R 5-GA CGA CCG GT T A CCT T ACCA T A CAT CA CGG AG A T A -3Bs tp I114 青蒿CY P 71AV 1和CPR 基因编码区的克隆用Olig o dT 通用引物反转青蒿总RNA ,得第一链cDNA,以此为模板,利用pfu DNA 聚合酶进行PCR 扩增.反应体系为:5L L 10@pfu buffer w ith M gCl 2,4L L 215mM dNTP,015L L pr im er,015L L 215单位的pfu DNA po lymerase,最后用ddH 2O 补足至50L L.C YP71A V1反应条件为:94e 预变性5m in,然后开始包括94e 变性45s,60e 退火45s,72e 延伸2min 的28个循环,最后72e 延伸10min.CPR 反应条件为:94e 预变性5m in 然后开始包括94e 变性45s,52e 退火45s,72e 延伸2m in 45s 的4个循环,再进行包括94e 变性45s,5915e 退火45s,72e 延伸2min 45s 的24个循环,最后72e 延伸10m in.PCR 产物经电泳检测后回收目的条带,并进行末端加A 反应,反应体系为:10@PCR buffer 2L L,Mg Cl 2112L L,dAT P 014L L,T aq DN A po lym erase 014L L,回收产物10L L,最后用ddH 2O 补足至20L L.反应条件:72e 反应30min.反应产物与pMD18-T 载体连接并转化大肠杆菌DH 5a 感受态细胞,用加有Amp(100mg /L)的LB 平板进行蓝白斑筛选.挑取阳性克隆进行PCR 检测后送上海英骏公司(in -v itro gen)测序,测序结果在NCBI(http://ww w 1ncbi 1nlm 1nih 1go v/)上进行生物信息学分析.115 p1304*的构建pCAM BIA1304+是选用pBI121和pCAMBIA1304为基本元件,由廖志华构建[9].p1304*是以pCAM -BIA1304+为基本骨架改造而来,是用一段含有X ba I 和Bam H I 酶切位点的序列取代pBI121表达盒上编码B -gulcuro nidase 的序列,并命名为p1304*(图1).LB:左边界;RB:右边界;35S P:CaM V35S 启动子;NOS T 、35S T:终止子;H ygr:潮霉素抗性标记基因.图1 载体p1304*示意图116 p1304*-CPR -CYP 71AV 1的构建将测序验证的分别携带有C YP71A V1和CPR 的菌落扩大培养之后抽提质粒,分别命名为CYP71A V1-T 和CP R -T.对p1304*和CPR -T 同时进行Sp e I/B stp I 双酶切,对p1304*和C YP71A V1-T 同时进行X ba I/Bam H I 双酶切,酶切完成后分别回收p1304*中的大片段和目的基因小片段,并分别连接74西南大学学报(自然科学版) 投稿网址http://x bg jxt 1sw u 1cn 第31卷转化大肠杆菌DH 5a,挑取单菌落进行PCR 验证,阳性克隆抽提质粒进行酶切验证,分别获得命名为p1304*-C YP 71A V1和p1304*-CPR 的质粒.再同时对p1304*-C YP71A V1和p1304*-CPR 进行Sp e I/B stp I 双酶切,酶切完成后回收p1304*-CYP71A V1中的大片段和p1304*-CPR 中的小片段,将两个回收片段连接转化,获得命名为p1304*-CP R -CYP71A V1的重组质粒.117 农杆菌工程菌的获得p1304*-CPR -C YP71A V1转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞,涂布在YEP 平板(YEP +Kan 50m g/L+Rif 40m g/L+Str 25m g/L)上,挑取单菌落分别进行PCR 检测.2 结 果M :DL2000;1:CP R 克隆;2:C YP71A V1克隆.图2 CY P 71AV 1和CPR 克隆的电泳图谱211 CY P 71AV 1和CPR 基因编码区克隆从青蒿中克隆了CYP71A V1基因编码区,长1488bp,编码496个氨基酸.CP R 基因编码区长2115bp,编码705个氨基酸(图2).根据该序列信息和载体酶切位点信息,带酶切位点黏性末端的引物插入到特异性序列中,因此扩增得到的CYP 71A V1和CP R 基因序列实际长度分别应为1510bp 和2137bp.将这两个序列插入到T 载体上测序验证,结果表明得到的序列与预计结果吻合.将所得序列与已知青蒿C YP 71A V1序列和CP R 序列在N CBI 中进行BLAST 比对,发现克隆得到的目的片段与已知序列同源性高达99%.212 p1304*-CPR -CYP 71AV 1双元表达载体构建首先构建p1304*-CP R 和p1304*-C YP71A V1单元载体,再将CPR 基因酶切,与p1304*-C YP71A V1骨架连接.最终使得CPR 基因正向插入到p1304*上Sp e I 位点和Bstp I 位点之间,C YP71A V1基因正向插入到p1304*上X ba I 位点和Bam H I 位点之间(图3).LB:左边界;RB:右边界;35S -Pro:CaM V35S 启动子;Nos:Nos -T er 终止子.图3 重组质粒p1304*-CPR -CYP 71A V 1示意图M :DL2000;1:重组质粒进行S pe I/B stp I 酶切;2:重组质粒进行X ba I/Bam H I 酶切.图4 重组质粒p1304*-CPR -CYP 71AV1的酶切验证图对质粒p1304*-CP R -C YP71A V1进行酶切验证时,首先进行Sp e I/B stp I 酶切,再对回收的载体骨架大片段进行X ba I/Bam H I 酶切(图4).结果显示CPR 和CYP71A V1都成功转入p1304*,证明双元载体p1304*-CPR -C YP71A V13构建成功.在进行X ba I/Bam H I 酶切时,其模板是线性片段,而Bam H I 在buffer K 缓冲液中酶切效率比X ba I 高,因此还切出一个约3123bp 的条带.213 获得重组工程菌双元载体p1304*-CP R -CYP71A V1转化农杆菌LBA4404后,进行目的基因的和潮霉素基因的PCR 检测,结果在所挑的4个单菌落中,CPR 、75第8期 任肃霞,等:青蒿CYP71A V1和CP R 基因的克隆及其双元植物高效表达载体的构建CYP71A V1和H ygr 均为阳性(图5).证明成功获得了可以编码CP R 和C YP71A V1的重组工程菌,命名为p1304*-CPR -C YP71A V1-LBA4404.M :DL2000;+:阳性对照-:阴性对照;1-4:单菌落检测.图5 重组工程菌p1304*-CPR -CYP 71AV 1-LBA 4404的PCR 检测3 讨 论青蒿素(artemisinin)是继氯喹、乙氨嘧啶、伯喹和磺胺后最热的抗疟特效药,尤其对脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点,已成为世界卫生组织推荐的药品[10],其生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径中的甲羟戊酸途径.该途径上从起始物质乙酰辅酶A 到法呢基焦磷酸(FPP)的反应过程已研究得比较清楚,但是对由FPP 到青蒿素的生物合成途径尚不明了.本研究选取青蒿素合成途径上的CYP71A V1和CPR 作为青蒿素代谢工程的靶点基因,是因为现在大多研究认为C YP71A V1和CPR 在从紫槐二烯(amorpha -4,11-diene)到青蒿酸的合成过程中起着举足轻重的作用[11].但是目前研究集中在该基因的酵母表达,并且只能检测到青蒿素的半合成产物青蒿酸,而从青蒿酸如何合成青蒿素更是一个难题.随着人们对青蒿素生物合成途径研究的不断深入和青蒿离体快速繁殖体系的建立[12],通过基因转化技术获得转基因高产株系已成为提高青蒿素产量的最有效途径之一[13].中国科学院北京植物研究所已建立了根癌农杆菌介导的青蒿转化体系,并于近年来获得了转单基因的青蒿再生植株[14].本研究以pBI121和pCAMBIA1304为基本元件,先构建pCAMBIA1304+,该载体可以携带两个外源目的基因,再用一段特异序列取代pBI121表达盒上的序列以利于装载C YP71A V1,构建的pCAM -BIA1304+和p1304*也可以用于携带其他目的基因,为开展植物次生代谢工程提供新的转化载体和策略.从青蒿中克隆到了C YP71A V1和CPR 的编码区,并构建了携带C YP71A V1和CP R 双基因的高效植物表达载体,为进一步研究青蒿素生物合成的分子机理和利用基因工程实现青蒿的次生代谢工程奠立基础.参考文献:[1]周宇杰,丁 伟,王春升.青蒿粗提物对朱砂叶螨生物活性的初步研究[J].西南农业大学学报(自然科学版),2006.28(2):305-308.[2] Duke M V ,Paul R N ,Elsohly H N ,et al.L ocalization o f A rt em isinin and A rtemisitene in F oliar T issues o f G landed andG landless Bioty pes o f A r temis ia annua L [J].Int J P lant Sci,1994,155(3):365-372.[3] T eo h K H ,P olichuk D R,Reed D W ,et a l.A r temisia nnua L 1(A steraceae)T r icho me -Specific cDN As RevealC YP 71A V1,a Cyto chr ome P450w ith a K ey Role in the Biosy nthesis of the A nt imalar ial Sesquiter pene L actone A r temis-i nin [J].F EBS L etters,2006,580(5):1411-1416.[4] Bo uw meester H J,W allaart T E,Janssen M H,et al.A mor pha -4,11-Diene Sy nt hase Cataly ses the F ir st P ro bable Stepin A rtemisinin Biosy nthesis [J].P hy tochemistry ,1999,52(5):843-854.[5] H elliw ell C A ,Chandler P M ,P oole A,et a l.T he CYP 88A Cyt ochrome P450,Ent -Kaur eno ic A cid Ox idase,Cata lyzesT hr ee Steps of the Gibberellin Biosynthesis Pathw ay [J].P roc N atl Acad Sci U S A ,2001,98(4):2065-2070.[6] H elliw ell C A ,Poo le A ,Peacock W J,et al.A r abido psis Ent -K aurene O xidase Catalyzes T hr ee Steps of Gibberellin Bio -synthesis [J].P lant Phy siol,1999,119(2):507-510.[7] Wallaar t T E,Van U W ,L ubberink H G ,et al.Iso lation and Identification of D ihydroar temisinic A cid fro m A rtemisia 76西南大学学报(自然科学版) 投稿网址http://x bg jxt 1sw u 1cn 第31卷A nnua and Its Po ssible Role in the Bio sy nthesis o f Ar temisinin [J].J Nat Pro d,1999,62(3):430-433.[8] Ro D K,Par adise E M ,Ouellet M ,et a l.Pro ductio n o f the A ntimalarial Dr ug precur sor A r temisinic Acid in Eng ineeredY east [J].Nature,2006,440(7086):940-943.[9] L iao Z H.M olecular Bio lo gy o f the Bio synthetic P athway s of T ax ol Precurso rs and M etabolic Eng ineer ing of A nt-i T umorT er penoid Indo le A lkaloids [D].F udan U niversity,2004:62-73.[10]K lay man D L.Qing haosu (artemisinin):an A nt imalar ial Drug f rom China [J].Science,1985,228(4703):1049-1055.[11]Bertea C M ,Fr eije J R ,van der Wo ude H ,et al.Ident ificatio n of Intermediates and Enzy mes Invo lved in the Ear ly Stepsof A r temisinin Biosynthesis in A r temisia annua [J].Plant a M ed,2005,71(1):40-47.[12]于飞飞,廖宇静,贾秀山.青蒿离体快繁技术研究[J].西南师范大学学报(自然科学版),2008,33(1):116-120.[13]Jung M ,L ee K,K im H,et al.Recent A dv ances in Ar temisinin and Its Der ivat ives as Antimalarial and A ntitumor A-gents [J].Cur rent M edical Chemist ry ,2004,11(10):1265-1284.[14]H an J L ,W ang H,Ye H C,et al.H ig h Efficiency o f Genet ic T ransfor mation and Reg ener ation of A r temisia annua L 1via Ag r obacter ium T umefaciens -M ediated Pro cedure [J].P lant Science,2005,168(1):73-80.Molecular Cloning of CYP 71AV 1and CPR fromArtemisia annua L 1and Construction ofTheir Binary Expression VectorREN Su -xia 1,2,3, YA N G Chun -xian 1,2,3, CH EN M in 4, LIA O Zh-i hua 1,2,311Schoo l of Life Scienc es ,Southw est University ,Chong qing 400715,China ;21Cho ng qing Swe etpo ta to Res earch Cente r ,Chong qing 400715,China ;31Ke y La bo ratory of E c o -environments in Three Gorge s Rese rvoir Reg ion (Ministry of Educa tion),Chong qing 400715,China ;41Schoo l of Pha ma ceutic al Scie nce s ,Southwe st Unive rsity ,Cho ngqing 400715,ChinaAbstract:T he coding sequences of CYP71AV1(am orpha -4,11-diene C -12ox idase)and CPR (cytochr ome P450reductase)of Ar temisia annua L 1w ere obtained w ith RT -PCR.T he tw ice sequences w er e subcloned into the reconstructed plant binar y ex pression vecto r p1304*to construct the recombinant v ecto r p1304*-CP R -C YP71A V1,w hich w as then intro duced into A grobacter ium tumef aciens strain LBA4404.The eng-i neer ed bacter ia,nam ed p1304*-CPR -C YP71A V1-LBA4404,can be used to genetically tr ansform A 1an -nua L.Key words:artemisinin;am orpha -4,11-diene C -12oxidase;cy to chrom e P450reductase;vector co nstr uc -tion责任编辑 胡 杨 77第8期 任肃霞,等:青蒿CYP71A V1和CP R 基因的克隆及其双元植物高效表达载体的构建。

NR4A1基因的克隆及真核表达载体的构建的开题报
告
NR4A1基因是核受体超家族的一员，具有多种调控细胞生长、分化和凋亡的功能。

因此，研究NR4A1基因的表达和调节机制对于理解细胞的生理过程和疾病发生发展具有重要意义。

本研究旨在对NR4A1基因进行克隆并构建真核表达载体，为后续研究提供良好的实验工具。

具体研究内容如下：
1. NR4A1基因的克隆。

首先，利用PCR技术从人体组织中提取NR4A1基因的编码序列。

然后，将编码序列与载体连接，并克隆到大肠杆菌中进行扩增。

2. 真核表达载体的构建。

将NR4A1基因的编码序列克隆到真核表达载体中，构建出pCMV-NR4A1质粒。

通过限制性酶切及PCR鉴定，确保pCMV-NR4A1质粒的准确构建。

3. 真核表达载体的验证。

将构建好的pCMV-NR4A1质粒转染到细胞中，利用Western blotting等技术检测NR4A1蛋白的表达情况，并分析其对细胞功能的影响。

总之，本研究旨在通过克隆和构建真核表达载体，为后续研究提供重要工具和技术，同时深入探究NR4A1基因的生物学功能和调控机制。

BioRT逆转录扩增(RT-PCR)试剂盒(两步法)说明书Cat No BSB05M1产品说明RT-PCR是指利用逆转录酶将RNA逆转录(RT)成cDNA(Complementary DNA)，然后以cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段的技术。

RT-PCR技术可用于检测细胞和组织中基因表达水平，克隆特定基因的cDNA序列和检测RNA病毒。

BioRT逆转录扩增(RT-PCR)试剂盒采用美国先进技术生产的高质量逆转录酶(AMV酶)和高保真的Taq mix DNA聚合酶，AMV逆转录酶可逆转录得到高产量的cDNA，并可逆转录长达12kb的cDNA，同时AMV逆转录酶有较高的热稳定性，其反应温度可高达60℃，可以逆转录具有复杂二级结构的RNA模板，高保真的Taq mix DNA聚合酶同时具有高保真，高灵敏，高延伸速度等特点，可合成长达6Kb的PCR产物，两种酶的配合使用保证了RT-PCR反应的顺利完成。

本试剂盒采用两步法进行，即RT和PCR分别在两管中进行，在同一次反应能同时检测多个基因，使得您有限的RNA能发挥最大的作用。

RT-PCR原理试剂盒组成(50次或100次使用量)AMV Reverse Transcriptase(5U/μl) 5 x RT BufferdNTP Mixture(10mM)RNase inhibitor(10U/μl)Oligo-dT(18)Random PrimerRNase free H2OTaq mix DNA polymerase(5U/μl) 10 x PCR BufferMgCl2(25mM)50 μl 500 μl 200 μl 50 μl 50 μl 50 μl 1 ml 25 μl 500 μl 200 μl保存-20℃RT-PCR实验必需用品1. 仪器和耗材离心机微量移液器RNase free 1.5ml离心管水浴装置或金属浴装置电泳及UV装置PCR管移液器吸头2. 试剂DEPC(焦碳酸二乙酯)ddH2O电泳缓冲液上样缓冲液DNA Marker使用提示1. RNA模板可以采用总RNA或mRNA，建议使用Biozol(BSC51M1)制备高质量RNA；2. RT实验应避免RNase污染，可采用以下措施：1）因人的皮肤表面和唾液都有RNase，因此实验中应戴一次性手套和口罩；2） RT实验应使用专门的仪器和耗材，建议在专门区域操作RNA；3） RT实验相关耗材应使用干热灭菌（180℃，60分钟）或用0.1％ DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时后在121℃高压灭菌30分钟；3. AMV逆转录酶，DNA聚合酶和RNase抑制剂在取用之前应离心后再吸取，吸取时动作要慢，使用后应尽快放回-20℃；4. dNTP应避免反复冻融以免失效；5. 引物的选择可根据具体情况，Oligo-dT适用于具有PolyA尾的RNA(一般是真核生物的mRNA)，Random Hexamer Primer适用于所有RNA(包括mRNA,rRNA,tRNA等)，尤其适用于有复杂二级结构的RNA，特异性引物适用于已知模板序列的RNA；6. PCR反应中MgCl2浓度可依据不同条件进行调整；7. PCR引物的设计的好坏直接影响到PC反应的结果，设计PCR引物考虑多种因素，如GC含量，引物长度，引物位置等因素，因此我们建议采用优秀的引物设计软件来设计，如Primer Premier 5.0等。

定用rt-pcr法获得目的基因的方法
RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是通过逆转录转录RNA为cDNA，然后使用聚合酶链反应（PCR）放大cDNA的方法，可以用于检测和定量特定的基因表达水平。

下面是使用RT-PCR法获得目的基因的步骤：
1. RNA提取：首先从感兴趣的样品中提取总RNA。

常用的提取方法包括酚/氯仿法、商业RNA提取试剂盒等。

2. 反转录：使用逆转录酶将RNA转录为cDNA。

反转录酶常用的有逆转录酶和随机引物，可以选择单链RNA依据所需。

3. PCR反应设置：准备PCR反应混合物，其中包括目的基因的特异性引物、逆转录生成的cDNA、核酸酶水、缓冲液和聚合酶。

4. PCR扩增：进行PCR扩增反应，其循环条件和程序根据所使用的引物和目的基因的特性而定。

在每个PCR周期内，DNA的数量会指数倍增。

5. 凝胶电泳：将扩增产物进行凝胶电泳分析，以检测目的基因是否存在。

扩增产物大小可以通过分子量标准品来确定。

6. 结果分析：观察凝胶电泳图像，检测目的基因是否存在，根据产物的强度可以初步定量目的基因的表达水平。

需要注意的是，RT-PCR方法能够检测目的基因的转录水平，
但不能直接反映目的基因的蛋白质水平。

若需要获得目的基因的蛋白质表达信息，需要使用其他蛋白质检测方法如Western blotting等。

此外，RT-PCR的结果应该通过其他方法进行验证，例如实时定量PCR（qPCR）或基因组测序方法。

三七病程相关蛋白PR102基因的克隆、表达及功能初步分析在转录组测序的基础上，采用逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）技术，从三七主根中分离到三七病程相关蛋白10 （pathogensis related protein 10，PR10）基因，命名为PnPR102，测序结果表明该序列长465 bp，编码154个氨基酸。

氨基酸序列同源性及系统发育树分析发现，PnPR102与人参的PR102蛋白同源性最高，具有典型的病程相关蛋白Bet v I 保守结构域。

构建了重组载体pET32a（+）PnPR102，在宿主菌Escherichia coli BL21中诱导表达融合蛋白，优化诱导条件，PnPR102融合蛋白在E coli BL21中以可溶性和包涵体蛋白2种形式大量表达。

纯化上清中的重组蛋白，运用纸片法分析纯化重组蛋白的体外抑菌活性，其对三七根腐病病菌腐皮镰刀菌Fusarium solani和坏损柱孢菌Cylindrocarpon destructans具有一定的抑制作用，猜测该基因可能参与了三七抗根腐病的防御反应。

标签：三七；根腐病；病程相关蛋白；原核表达Molecular cloning，bacterial expression analysis and functionalcharacterization of pathogenesisrelated PR102 gene in Panax notoginsengYANG Dan1，BAO Yi1，CHEN Limei1，CUI Xiuming1，2，LI Kunzhi1*（1Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China；2 Key Laboratory of sustainable utilization of Panax notoginseng Resources of Yunnan Province，Kunming 650500，China）[Abstract]Base on the transcriptome analysis and RTPCR techniques，a pathogenesisrelated protein 10 gene was isolated from Panax notoginseng root and named as PnPR102 Bioinformatics and phylogenetic trees analysis revealed that open reading frame （ORF）of PnPR102 was 465 bp in length，encoding 154 amino acids，containing one typical conserved domain of pathogenesis related protein Bet v I family，and showed high similarity with that from P ginseng The recombinant expressed plasmid pET32a（+）PnPR102 was expressed in Escherichia coli BL21 The expression conditions were optimized and it could be expressed well in soluble and inclusion body protein Purified PnPR102 recombinant protein from the supernatant of cells was used to analysis the pathogen resistance activity by paper method The purified recombinant protein could inhibit typical root rot disease pathogen （Fusarium solani and Cylindrocarpon destructans）growth evidently，we conjecture that PnPR102 may participated in defense response of P notoginseng resistance to root rot disease pathogen[Key words]Panax notoginseng；root rot disease；pathogenesisrelated protein；prokaryotic expression受到致病菌的侵染后，植物中的一系列基因响应而上调表达，其中的一些基因與防御反应相关，包括病程相关蛋白（PR）和抑菌基因，其通过增强其蛋白活性来提高抗病能力。

酵母双杂交表达载体pGADT7-AtTGA2的构建及酵母菌的转化何乐;肖牧;徐健;阮颖【摘要】[目的] 研究TGA2在植物系统获得抗性中所起的作用,阐明其作用机制.[方法] 通过PCR扩增获得拟南芥中TGA2基因全长CDS序列,克隆至pGADT7酵母表达载体,并转化至AH109酵母菌株中.[结果] 重组质粒通过大肠杆菌转化获得了阳性克隆,经过菌落PCR及单、双酶切验证重组质粒构建成功.将重组质粒又转化到AH109酵母菌中,并在相应筛选培养基上成功获得了转酵母菌成功的阳性克隆.[结论] 为进一步研究TGA2参与水杨酸诱导抗性基因表达的作用机制奠定了良好的基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(000)030【总页数】3页(P10467-10468,10505)【关键词】AtTGA2;CDS克隆;酵母转化【作者】何乐;肖牧;徐健;阮颖【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙410128【正文语种】中文【中图分类】S188TGA转录因子是一类含碱性DNA结合结构域和亮氨酸拉链结构域，可以结合到PR1基因启动子应答性的顺式作用元件。

它因含有TGACCG/as-1(Activation seguence1)元件而得名［1-2］。

该类启动子通过与NPR1基因协同作用参与植物对病害的防御作用。

具体作用方式为NPR1寡聚体中的半胱氨酸残基分子间二硫键被水解还原，形成NPR1单体，NPR1单体具完整的核定位序列，使其能够转移到细胞核内并与结合在PR1基因启动子区的TGA类转录因子相互作用，调控PR基因的表达和系统性抗性(SAR)的产生［3-6］。

不同TGA成员有2种方式与NPR1互作，第一种是TGA与NPR1直接结合，正向调控PR1基因的表达和抗性的产生，两者结合的强度、保持时间与PR基因表达和抗性产生的强度成正比。

檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲檲殘殘殘殘基础医学突变型人PRKAG2基因的克隆及其真核表达载体构建陈挺，张必利，何平，程平，郑兴［摘要］目的构建含有突变位点R302Q 的PRKAG2的真核表达载体。

方法首先通过RT-PCR 获得人PRKAG2的基因序列，然后采用PCR 定点突变获得含有R302Q 的PRKAG2基因序列，最后通过酶切连接至真核表达载体pIRES2-EGFP 中。

结果通过RT-PCR 获得的人PRKAG2的编码区序列1710bp ，经测序比对与NCBI 公布的序列完全一致，通过PCR 定点突变拼接900bp 和800bp 片段获得了含有R302Q 突变位点的PRKAG2，酶切连接至pIRES2-EGFP 载体中，经菌落PCR 筛选和酶切验证获得阳性克隆pR302Q-IRES2-EGFP ，经测序验证与预期完全一致。

结论构建含定点突变人PRKAG2基因重组载体pR302Q-IRES-EGFP 为进一步研究基因PRKAG2R302Q 突变体的功能奠定了基础。

［关键词］PRKAG2基因；RT-PCR ；定点突变；pIRES2-EGFP 载体［中图分类号］R392．11．2［文献标识码］A［DOI ］10．3969/j．issn．1009－0754．2013．02．008Cloning and the expression vector construction ofmutant human PRKAG2geneCHEN Ting ，ZHANG Bi-li ，HE Ping ，CHENG Ping ，ZHENG Xing（Department of Cardiology ，Changhai Hospital Affiliated to the Second Military Medical University ，Shanghai 200433，China ）［Abstract ］ObjectiveTo construct human PRKAG2gene expression vector containing site-directed mutagenesis．MethodsFirst ，gene sequence of human PRKAG2was obtained through the access of real-time polymerase chain reaction （RT-PCR ）from human whole blood mRNA ，then ，gene sequence of human PRKAG2containing R302Q was also obtained through PCR and site-directed muta-genesis of human PRKAG2．Finally ，the recombinant vector pR302Q-IRES2-EGFP was constructed by digested connection．Results The human cell mRNA was extracted with the Trizol method ，and the first strand cDNA was synthesized with specific primers ，the PRK-AG2gene fragment was amplified by RT-PCR ，and the target fragment bands were about 1710bp．The R302Q fragments obtained by segment cloned were about 800bp and 900bp．After the Top 10competent bacteria were transformed ，positive bacteria were screened by PCR ，further identified by restriction analysis．It was confirmed that the recombinant vector pR302Q-IRES2-EGFP was successfully constructed and was as fully consistent as predicted by sequencing．Conclusion The construction of recombinant vector pR302Q-IRES2-EGFP containing site-directed mutagenesis of human PRKAG2gene lays a good foundation for further research on the function ofthe mutant PRKAG2R302Q．［Key words ］PRKAG2gene ；RT-PCR ；Site-directed mutagenesis ；pIRES2-EGFP vector［基金项目］国家自然科学基金项目（HO202）［作者单位］200433上海，第二军医大学附属长海医院心内科［通讯作者］郑兴，电子信箱：zhengxing57530@163．com家族性心室预激、传导系统病变及心肌肥厚在2002年首次被归结为分子遗传学疾病，并被统称为PRKAG2心脏综合征。

RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建刘永光;刘克锋;孙向阳【摘要】[目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体.[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达栽体.[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了pMXB10-NPR1蛋白表达载体.[结论]成功构建了包含NPR1的蛋白表达载体.%[Objective] It is to clone broad-spectrum anti-disease gene NPRl and to construct its protein expression vector. [Method] First extract Arabidopsis thaliana total RNA and design relevant primers, and then the method of reverse transcription PCR is adopted. With the method of enzyme ligation, this gene will be directed into protein expression vector. [ Result] After relevant testing, NPRl will be inserted into vector pMXBlO to obtain pMXBlO-NPRl protein expression vector. [Conclusion] Protein expression vector with NPRl will be successfully constructed.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)021【总页数】3页(P12707-12709)【关键词】NPR1;广谱抗病;栽体构建【作者】刘永光;刘克锋;孙向阳【作者单位】北京林业大学水保学院,北京100083;北京农学院城乡发展学院,北京102206;北京农学院城乡发展学院,北京102206;北京林业大学水保学院,北京100083【正文语种】中文【中图分类】S432.4系统获得性抗性（Systematic acquired resistance，SAR）是植物抵御病原菌侵染的最有效手段，可利用SAR信号传导途径中的关键功能基因来启动园林植物自然防御系统，达到广谱抗病的目的。

载体构建操作流程载体构建操作流程一、载体准备1、质粒准备电泳检测载体质量好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环DNA和线性DNA。

超螺旋结构应至少占到90%。

测定质粒浓度用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。

2、质粒双酶切根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。

以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下：试剂体积质粒<1 μgEnzyme I 1μLEnzyme II 1μL10×X Buffer 2μL灭菌水to 20μL总体积20μL将上述体系置于37℃（不同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。

根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2 μl进行电泳检测。

3、回收质粒凝胶回收参照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书。

1)称量胶块重量，计算胶块体积。

计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计向胶块中加入胶块融化液Buffer GM，我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一般加入3个凝胶体积量。

2)均匀混合后室温15-25℃融化胶块。

此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约5～10分钟）。

3)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

将上述操作的溶液转移至Spin Column 中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。

滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。

4)将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。

5)重复操作步骤。

6)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm 离心1分钟。

7)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。