黄冈师范学院生物科学专业人体解剖生理学实验教案——人体组织学与解剖学授课年级：2005级授课教师：吴中华授课时间：2006年秋实验一：小鼠内脏器官的石蜡切片的制备[目的要求]1．熟悉石蜡切片的制作过程。
2．掌握HE染色的基本原理和染色方法。
[实验原理]显微标本的制作技术是组织学，胚胎学，生理学及细胞学等学科研究观察细胞。
组织的生理，病理形态变化的一种主要方法。
大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显微观察的，因为材料较厚，光线不易透过，以致不易看清其结构，另外细胞内的各个结构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过，也难以辩明。
但在经过固定，脱水，透明，包埋等手续后就可把材料切成较薄的片子，再用不同的染色方法以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成份含量的变化，就可以在显微镜下清楚的看到其中不同的区域组分状态，切片也便于保存，所以是教学和科研中常用的方法。
苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。
这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。
经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。
[实验方法]一、取材根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜，准确，材料要避免挤压，挫伤，干枯。
所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时间，地点，名称，组织部位，取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。
一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。
二、固定动、植物的任何组织部位，要制成切片，首先用化学试剂将其固定，固定的作用在于通过固定剂，在尽量短的时间内使原生质体停止生命活动，并如同生前一样精细的保存其细胞结构，同时易于后步骤的染色所以良好的固定剂应该具备以下条件：①迅速渗入组织杀死原生质体，在短时间内，组织内外完全固定；②尽可能避免使组织膨胀或收缩，并且软硬合适于切片；③增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别，同时增加媒染作用和染色能力；④固定液同时是防腐液，使材料不致变质腐败。
三、脱水脱水是用一种即能与水又能与透明液混合的液体来逐渐置换样品中游离的水。
现采用的脱水剂一般是丙酮或乙醇来进行梯度脱水，脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。
脱水的过程：一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100%→100%脱水应逐步而不应跨越太大的进行，否则将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理时，应保证试剂的纯度。
四、透明透明是用一种即能与酒精又能与包埋介质混合的液体来置换样品中的酒精，从而为最终的包埋创造一个有利的条件。
现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。
其过程为：1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。
五、渗蜡将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换了组织块中的透明剂，便于今后的包理与切片。
石蜡有液态与固态二种，渗蜡要在恒定温箱（60°c）中进行，以保证石蜡处于液态中。
六、包理组织块经石蜡渗透后，其内部间隙已完全被石蜡占据，此时还需要用同种硬度的石蜡包理成蜡块以利于后边的切片，包理可用相同的器具，也可折叠一牛皮纸盒。
将液态石蜡缓缓倒入纸盒中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入纸盒，浅埋在石蜡内，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。
至此，一块组织已完成前处理过程，可以切片，前边的步骤表明看来既无高深的理论，又无复杂的技术，一切看似简单，但一步做不到都会造成整个制片的前功尽弃。
我们可以看到：①水和酒精可以相溶。
②酒精和二甲苯相溶。
③二甲苯和石蜡可以相溶。
因为以上相邻步骤所使用的液体均可以互溶，所以保证每一步骤液体能置换完全。
④我们看到水和二甲苯不能相溶，酒精和石蜡不能相溶，所以如果有一个步骤的处理不彻底，残留的液体带到下一个步骤将不能互溶，最终带到渗蜡步骤中，成为细小的空洞，以至不能成为质地致密的石蜡块，也就切不成良好的切片。
七、切片修块：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，并将这组织周围的石蜡切除，将组织修成一小块蜡块并粘在大小适宜的硬木块上，以便于固定在切片机上。
贴片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带切下的蜡带放在一干净黑纸上，用小刀根据需要切成数段，分别贴在干净载玻片上。
在恒温展片台上展平，烘干。
八、染色切片可用不同方法，使其干燥，然后进行染色。
因为每一张载片上粘贴的是蜡带，因此必须先用二甲苯去除石蜡再用酒精去除二甲苯，再进入水中，才能染色，染色的方法很多，要根据每张标本要求显示的目的选择不同的染剂，最常用的是苏木精，伊红染色（简称H·E染色）苏木精使细胞核是深紫色，伊红使细胞质显粉红色，以此显示清晰的细胞形态和核的大小，位置，染色后再根据制片的基本原理，使带水的载片经历脱水→透明步骤最后用树胶封片。
其步骤如下：二甲苯→二甲苯→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→100%乙醇→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→30%乙醇→苏木精染液→0.01%盐酸→0.01%氢氧化钠→蒸馏水→30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→85%乙醇→伊红染液→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→二甲苯→二甲苯→封片[思考题]1．简述石蜡切片的主要过程。
2．分析影响HE染色的主要因素。
实验二：基本组织[目的和内容]1．联系机能了解被覆上皮组织的结构特点及分布。
2．观察疏松结缔组织、致密结缔组织、网状结缔组织、脂肪组织、软骨组织，了解结缔组织的共同特征，并联系机能比较各种结缔组织的结构特点。
3．重点观察、了解疏松结缔组织的纤维及各种细胞成分。
4．比较观察平滑肌、骨骼肌及心肌三种肌纤维纵切和横切的结构特点。
5．观察神经元的结构和特点及尼氏体在胞体内的形式与分布。
6．观察神经原纤维的形态及分布。
7．观察有髓鞘神经纤维及神经。
8．示范观察触觉小体、运动终板及环层小体的形态结构。
示范神经胶质细胞、大脑锥体细胞及小脑蒲肯野氏细胞的形态。
[观察]一、单层扁平上皮肠系膜的间皮平铺片（度银法）。
二、单层立方上皮猫甲状腺切片（H·E.染色）观察。
三、单层柱状上皮用猫胆囊切片（H·E.染色）观察。
四、假复层纤毛柱状上皮取兔气管切片（H·E.染色）观察。
五、复层扁平上皮取人食管切片（H·E.染色）观察。
六、疏松结缔组织取经台盼蓝或活体染色及地衣红染色的兔的皮下结缔组织平铺片观察。
七、软骨用兔气管切片（H.E.染色）观察，可了解透明软骨的结构特点。
八、骨组织取人骨的横磨片观察。
这种磨片是腐胔的股骨的骨密质部分锯成薄片，再用磨石磨成。
骨组织内的软组织（神经、血管、淋巴管，结缔组织）及细胞都已腐烂，仅留下空腔和管道。
因光线折射关系，这些空腔和管道均呈现为黑色，观察时可缩小光圈使光线稍暗些，更为清晰。
九、平滑肌取猫结肠切片（H·E.染色）观察。
十、骨骼肌取猫舌切片（H·E.染色）观察。
掌骨骼肌纤维的一般形态（核的位置及明暗相间的横纹）。
十一、心肌取猴或刺猬心肌切片（铁矾苏木精染色）观察。
十二、神经元（一）取猫的脊髓横切片（苯胺蓝染色）观察尼氏体的特点及分布。
（一）取猫的脊髓横切片（Ｃajal氏镀银法）观察，观察到神经原纤维及突触的形态。
十三、有髓鞘神经纤维及神经取兔的坐骨神经纵切片及横切片（H.E.）观察。
十四、幻灯示范：细胞的光镜下形态结构特点和四种基本组织中各种组织的光镜下的结构特点。
[思考题]1．举例说明上皮组织的结构与机能的统一性。
2．比较三种肌肉组织在结构上有什么不同？3．光镜下观察疏松结缔组织可见哪些细胞和纤维？有何作用？实验三：几种脊椎动物的血涂片制备及血细胞形态的观察［目的与内容］1．学会三种不同动物的采血、血液涂片制备和染色的方法。
2．学习掌握测量细胞大小的基本方法。
3．认识并比较观察各种血细胞的形态特征及其染色反应。
4．理解不同动物的红细胞大小、核质比和形态差异以及血细胞的类型随动物进化而发生变化。
[实验原理]瑞氏（Wright）染料是碱性美蓝（亚甲蓝）与酸性伊红钠盐混合而成的染色粉。
染料溶于甲醇，分解为酸性和碱性染料。
细胞中的嗜酸性物质与酸性染料伊红结合而染成红色；嗜碱性物质与碱性美蓝结合而染成蓝色；、嗜中性物质同时结合酸碱两种，而成为红、蓝混合的紫红色。
姬姆萨染料是天青色素、伊红、亚甲蓝等混合而成染色粉末。
最适于血液涂抹标本，染色效果优于瑞氏（Wright）染料。
脊椎动物的血液分有形成成分即细胞部分和血浆两部分。
细胞部分根据形态和功能主要分成红细胞和白细胞两大类，而且不同类群动物的血液细胞的种类、大小、形态和功能存在明显的差异。
脊椎动物的白细胞依据其形状、染色颗粒、细胞质和细胞核的形状大小可以进行分类。
通常的分类方法是根据细胞浆中有无特殊的嗜色颗粒，将其分成颗粒细胞和无颗粒细胞。
颗粒细胞又依据所含颗粒对染色剂反应特性，被区分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；无颗粒细胞则分成单核细胞和淋巴细胞。
中性粒细胞有较强的吞噬能力，能将侵入机体的微生物消灭掉，并可参与免疫复合物和坏死组织的清除工作。
嗜酸性粒细胞的细胞内含有过氧化物酶和酸性磷酸酶，吞噬能力与中性粒细胞相当或稍弱，能吞噬抗原-抗体复合物，此外，嗜酸性粒细胞具有抗炎作用。
嗜碱性粒细胞含有多种化学物质，如组织胺、肝素和5-羟色胺等，当抗原-抗体发生反应时，或机体在寒冷环境中时，都能引起嗜碱性粒细胞释放组织胺和肝素。
血液中的单核细胞穿出血管壁进入组织，变成巨噬细胞，可对抗组织内的致病物，各种细菌和病毒。
淋巴细胞有免疫功能，对异己构型的物质具有杀灭和消除作用。
[实验对象]青蛙、鸡和家兔。
[试剂与器材]一、试剂：染色液的配制：1．姬姆萨（Giemsa）染液的配制（1）原液配制Giemsa粉剂0.8g甘油（医用）50ml甲醇50ml将Giemsa粉剂溶于甲醇中，在乳钵中充分研磨，溶解后再加甘油，混合均匀，置于37～40℃温箱内8～12h，过滤，装入棕色试剂瓶内，密封保存备用。
（2）稀释液临用时取Giemsa原液5ml，加磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8）50ml，即为Giemsa稀释液。
（3）pH6.4~6.8磷酸盐缓冲液取磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g，加少量蒸馏水溶解，调整pH至6.4~6.8，加水至1000ml。
