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滇重楼辣椒轻斑驳病毒分离物的鉴定及全基因组序列分析作者：杨林毅陈潞陈泽历来源：《湖北农业科学》2020年第13期摘要：滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）是多年生草本植物，其药用部位为地下根茎，是一种重要的中药材。
为明确侵染滇重楼的病毒病原，对采自云南省曲靖市的滇重楼进行透射电镜观察、DAS-ELISA和RT-PCR技术检测。
在透射电镜下观察到杆状病毒粒子，大小为（200～300） nm×（20～36） nm。
对采集到的7份病样进行DAS-ELISA检测，结果表明，其中5份病样呈阳性。
通过RT-PCR技术扩增、克隆获得1个全长为6 357 bp的曲靖分离物PMMoV-QJ的全基因组序列。
将PMMoV-QJ的全基因组序列与国内外已经报道的10个PMMoV分离物进行同源性分析比对，其同源性为99.42%～99.81%。
基于全基因序列的系统发育分析表明，PMMoV-QJ与韩国分离物亲缘关系密切。
本研究明确了该分离物的亲缘关系，从分子水平鉴定该分离物，为后续滇重楼病毒病的预防提供理论依据。
关键词：滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）;辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）;鉴定;序列分析Abstract： Paris polyphylla var. yunnanensis is a perennial herb， and its medicinal part is underground rhizomes. It is an important chinese medicinal material. In order to clarify the viral pathogens infecting the Paris polyphylla， the transmission electron microscopy， DAS-ELISA and RT-PCR techniques were performed on the Paris polyphylla collected from Qujing， Yunnan province. Baculovirus particles were observed under transmission electron microscopy and were （200～300）nm ×（20～36）nm in size. The results of DAS-ELISA on 7 samples collected showed that 5 of them were positive. A whole genome sequence of a 6 357 bp Qujing isolate （PMMoV-QJ， accession number MK784568） was cloned by RT-PCR amplification. The homologous sequence of PMMoV-QJ were analyzed by homology with 10 PMMoV isolates reported at home and abroad， and the homology was between 99.42% and 99.81%. Phylogenetic analysis based on the whole gene sequence showed that PMMoV-QJ was closely related to Korean isolates.This study clarifies the genetic relationship of the isolate， and identifies the isolate from the molecular level， which provides a theoretical basis for the prevention of the subsequent viral disease.Key words： Paris polyphylla var. yunnanensis; pepper mild mottle virus（PMMoV）; identification; sequence analysis滇重樓（Paris polyphylla var.yunnanensis）又称独角莲，属延龄草科重楼属（Paris）多年生草本植物，其药用部位为地下根状茎，分布于亚欧大陆温带和热带地区，在中国主要集中在西南地区，其中以云南省滇中、滇东和滇东北、滇西和滇西北为主[1]。
中国农业科学 2008,41(7):1975-1982Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.07.013 黄瓜花叶病毒辣椒分离物侵染性克隆构建廖乾生，杜志游，张华荣，吴 鹏，朱丽萍，陈集双（浙江理工大学生物工程研究所，杭州 310018）摘要：【目的】鉴定引起辣椒产生褪绿黄化症状的病原物，构建侵染性克隆。
【方法】大田辣椒样品通过ELISA 检测，结合病毒外壳蛋白SDS-PAGE及病毒RNA分析，初步确定辣椒中病原物为黄瓜花叶病毒（CMV）Phy株系。
以辣椒病毒粒子RNA为模板，采用含T7启动子的不同正向引物通过RT-PCR扩增CMV-Phy全长基因组RNA1、RNA2和RNA3。
PCR产物经过双酶切后连接到pUC118载体，并分别比较5种（DH5α、HB101、JM109、LE392和NM522）感受态细胞的转化效率。
体外转录CMV-Phy的基因组cDNA克隆（pUC-P1、pUC-P2和pUC-P3）成RNA分子（P1P2P3），分析其转录效率和侵染活性。
P1P2P3与CMV的卫星RNA进行假重组，进一步确定CMV-Phy侵染性克隆的成功构建。
【结果】引起辣椒产生褪绿黄化症状病原物为CMV，携带卫星RNA；心叶烟接种辣椒病毒粒子后同样产生褪绿黄化症状。
HB101感受态细胞最适合CMV-Phy基因组转化。
CMV-Phy基因组及其卫星RNA的大小如下：RNA1为3 356 nt、RNA2为3 048 nt和RNA3为2 220 nt，卫星RNA Pz-satRNA为384 nt（序列登陆号分别为：DQ402477，DQ412731 ，DQ412732 EF363688）。
CMV-Phy的cDNA克隆体外转录在5′端添加G有利于提高转录效率，但影响其侵染活性；P1P2P3在苋色藜和心叶烟产生的症状与其病毒粒子产生的症状相一致。
一种适宜于RT-PCR检测的辣椒病毒RNA微量提取方法姚明华;王飞
【期刊名称】《辣椒杂志》
【年(卷),期】2008(006)004
【摘要】以感染病毒病的辣椒叶片为材料,分别用改进的Trizol试剂提取法、异硫氰酸胍提取法、改进的酚-SDS提取法提取总RNA,经过RT-PCR,利用CMV和TMV的病毒外壳蛋白设计特异引物检测.结果表明:改进的Tfizol试剂提取法能获得较高质量和产量的总RNA,可以单人大批次提取,并在辣椒病毒病检测中能稳定而准确地进行规模化RT-PCR检测.
【总页数】3页(P30-32)
【作者】姚明华;王飞
【作者单位】湖北省农业科学院经济作物研究所,武汉,430064;湖北省农业科学院经济作物研究所,武汉,430064
【正文语种】中文
【中图分类】S6
【相关文献】
1.RT-PCR检测甜菜坏死黄脉病毒及总RNA提取方法研究 [J], 牛素清;白晨;张惠忠;李晓东;付增娟;赵尚敏;斯琴巴特尔;轩继雨;李树生
2.辣椒黄瓜花叶病毒RNA提取及RT-PCR体系建立 [J], 王飞;姚明华
3.一种适用于RT-PCR的石榴籽粒总RNA提取方法 [J], 黄有凯;曹丹琴;彭媛媛;龚凌燕;张水明
4.一种无RNA纯化步骤TaqMan RT-PCR方法用于快速检测登革病毒 [J], 郑夔;洪烨;李小波;黄吉城;师永霞;幸芦琴;相大鹏;郭波旋;胡龙飞
5.一种适于PCR检测病毒诱导基因沉默番茄植株的微量DNA提取方法 [J], 何秀霞;于源华;果鸿宇;张淑华
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![检测辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR引物及其方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/29bbc98c48d7c1c709a145cc.png)
专利名称：检测辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR引物及其方法专利类型：发明专利
发明人：唐前君,戴良英,刘茂炎,刘湘宁,李迅,刘双清,李魏申请号：CN201610049511.1
申请日：20160125
公开号：CN105695626A
公开日：
20160622
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种检测辣椒叶脉黄化病毒(Pepper vein yellows virus，PeVYV)的RT-PCR引物及其方法，该方法根据PeVYV核苷酸序列的高保守区所设计出如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的特异性引物，以提取的待测样品总RNA为模板，利用上述引物进行RT-PCR扩增，然后对扩增产物进行电泳检测，根据电泳结果的扩增条带是否为504bp，能准确判断待测样品是否感染了辣椒叶脉黄化病毒，检测结果更加准确，且检测时不需加辅助引物，更加方便。
本发明的检测方法适用于大批量辣椒作物叶子中PeVYV的直接检测，在降低了检测成本，减少了工作量的同时，保留了快速、准确，以及灵敏度高等优势。
申请人：湖南农业大学
地址：410128 湖南省长沙市芙蓉区东湖湖南农业大学
国籍：CN
代理机构：长沙正奇专利事务所有限责任公司
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采用mRNA差异显示技术分离辣椒抗黄瓜花叶病毒病相关基因片断刁卫平;杨学玲;王述彬;刘金兵;潘宝贵;戈伟【摘要】为探索辣椒黄瓜花叶病毒(CMV)的抗性相关基因,采用mRNA差异显示技术探讨抗、感辣椒在接种CMV前后基因表达的差异.对获得的87个差异片断进行回收、重扩增和克隆后共获得26个阳性克隆.数据库比对分析结果表明,仅有7个cDNA克隆在GenBank中找到了相似的功能,与能量代谢、转录因子和代谢酶有关,其余cDNA片断在数据库中未发现匹配信息；抗、感病辣椒材料均具有诱导表达特点,抗病材料(Vcl6a)差异表达条带的数目比感病材料( SS69)少.研究结果为进一步分离和克隆辣椒抗CMV相关基因提供了试验依据.%To find the gene related to cucumber mosaic virus (CMV)-resistance in pepper, RNAs isolated from pepper materials with resistance and sensitivity to CMV were used to study the differentially expressed genes before and after inoculation by mRNA differential display technique. The results showed 87 differential display bands. Among them, 26 positive clones were selected by recovering, second amplification and cloning. Only seven fragments were found homologous sequences in CenBank database. These sequences mainly participated in ATP syntheses, transcript factors and metablic enzyme ; there were still other fragments with no hit in the CenBank. The characteristic of induction expression in the two tested materials was shown as well. The number of differentially expressed bands in resistant material was less than that in susceptive material.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2011(027)004【总页数】5页(P825-829)【关键词】辣椒;mRNA差异显示;黄瓜花叶病毒;抗病基因【作者】刁卫平;杨学玲;王述彬;刘金兵;潘宝贵;戈伟【作者单位】江苏省农业科学院蔬菜研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所,江苏南京210014【正文语种】中文【中图分类】S436.418.1+2自mRNA差异显示反转录PCR(mRNA differential display reverse transcript-PCR，DDRT-PCR)技术［1］创立以来，因其具有原理简单、操作简便、mRNA用量少、高通量、针对性强，可同时比较同一样品不同状态基因的差异表达等优点，已被广泛应用于植物分子生物学研究，主要涉及基因诱导表达［2］、植物抗逆性［3-4］、发育分子机理［5-7］等方面。
中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCV-CHI)外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备张玉满;王寰宇;刘玉乐【期刊名称】《自然科学进展》【年(卷),期】2001(011)002【摘要】经PCR获得了中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCV-CHI)外壳蛋白(CP)基因,并克隆到pGEM-7Zf(+)载体上.序列分析表明,TYLCV-CHI感染番茄或烟草时,CP基因的核苷酸序列发生变化,并且在烟草上随感染时间的延长,突变频率增高.连接到含有编码tRNAarg4基因argU的表达载体pSBET后,TYLCV-CHI CP基因在大肠杆菌中以包含体形式得到大量表达(约33 ku).以表达的蛋白作抗原免疫家兔,制备了抗TYLCV-CHI CP的抗血清.ELISA实验表明,该血清与抗原特异反应,血清效价为1:3000.Western印迹实验还表明,该血清除了与感染TYLCV-CHI的番茄、烟草有特异免疫反应外,还与感染南瓜曲叶病、烟草曲叶病的叶片有免疫反应,表明这些病毒之间有明显的血清学关系.【总页数】5页(P142-146)【作者】张玉满;王寰宇;刘玉乐【作者单位】中国科学院微生物研究所,;中国科学院微生物研究所,;中国科学院微生物研究所,【正文语种】中文【中图分类】Q93【相关文献】1.广东番茄黄化曲叶病毒AC2基因的原核表达及抗血清制备 [J], 赵芹;李华平;何自福;佘小曼;谢大森;何晓明;彭庆务2.番茄黄化曲叶病毒郑州分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析 [J], 胡京昂;郭竞;崔杏春;李自娟;万秀娟;黄文;应芳卿3.甘薯羽状斑驳病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备 [J], 张振臣;李大伟;陈健夫;于嘉林;乔奇;靳秀兰4.杨凌番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因的克隆与其核心序列分析 [J], 李云洲; 梁燕; 王巧丽; 李翠; 崔霞; 秦蕾5.山东寿光地区番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J], 乔宁;李美芹;郭宝太;刘永光;裴华丽;竺晓平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
北京地区辣椒上黄瓜花叶病毒和甜菜西方黄化病毒复合侵染的分子鉴定左琳彧;雍容婧;袁雯;杜开通;周涛【摘要】Pepper,an important vegetable and economic crop,is susceptible to many viruses.In a survey of virus diseases on vegetables in 2014,some pepper plants showing typical yellow leaf symptom were found in Shunyi Dis-trict,Beijing,China.Total RNA was isolated from the sample with typical symptom,and reverse transcript-PCR assays were performed with specific primers for Cucumber mosaic virus (CMV)and degenerate primers for Polero-virus .Two specific DNA fragments,one about 650 bp and another 1 400 bp,were obtained using primers for CMV andPolerovirus ,respectively.Nucleotide sequence analysis showed that they had the highest identity of 99% and 96% with that of CMV and Beet western yellows virus (BWYV),separately.To our knowledge,this is the first report of co-infection of CMV and BWYV on pepper plants.%辣椒是我国重要的蔬菜和经济作物，受多种病毒危害。
辣椒的果实抗病和抗虫性状的遗传机制研究辣椒（Capsicum annuum）作为一种重要的蔬菜作物，具有丰富的营养和独特的风味，深受人们的喜爱。
然而，辣椒的种植过程中常常受到各种病虫害的侵袭，导致产量和质量的下降。
因此，探究辣椒果实抗病和抗虫性状的遗传机制，对于提高辣椒的抗病虫能力和产量具有重要意义。
在辣椒的抗病性研究中，病害抗性通常是由多个基因的遗传效应所决定的。
以辣椒普遍存在的疫霉病为例，研究表明该病害的抗性受到多基因的共同作用。
其中，CaMi-1和CaMi-2基因是辣椒抗疫霉病的主要候选基因，它们分别编码CaM蛋白、CaM蛋白结合蛋白。
这些蛋白参与了钙信号转导途径，调控了植物的生长发育和抗病能力。
此外，辣椒还通过拟南芥AtNPR1基因进行间接抗病性反应。
该基因在辣椒中的表达水平升高，可以激活一系列抗性相关基因的表达，从而增强辣椒对疫霉病的抗性。
与抗病性相似，辣椒的抗虫性状也受到复杂的遗传机制调控。
以辣椒常见的害虫之一——烟粉虱（Myzus persicae）为例，研究发现，辣椒的抗虫性状主要受到两类基因系统调控。
一类是调节辣椒产生抗性相关物质的基因，比如THI2.1、LOX4、PI-II和PR1等。
这些基因编码了一系列辣椒对烟粉虱的抗虫性物质，如苯丙素类物质、脂肪酸、蛋白酶抑制剂等。
这些物质可以干扰烟粉虱的摄食与生长，从而减轻其对辣椒的危害。
另一类基因是参与植物免疫系统的基因，例如辣椒中的JAZ、JA和ET合成酶基因家族。
辣椒抗虫基因JAZ可以调控植物抗虫免疫反应的启动，后续的信号通路中JAZ可能与其他转录因子相互作用，从而调控一系列与抗虫相关的基因的表达。
同时，辣椒中的JA和ET合成酶基因家族参与了吲哚丙酸（IAA）合成途径，从而调控了植物的生长和抗虫能力。
这些基因的适应性突变可能会导致辣椒的抗虫性状发生变化，进而影响辣椒对烟粉虱的防御能力。
总结起来，辣椒的果实抗病和抗虫性状受到复杂的遗传机制调控。
辣椒叶片总RNA快速提取李小霞;肖仲久;宋培勇;周逊;谢语【摘要】Trizol extraction method was modified to extract total RNA from Capsicum annuum leaves. The result of agar gel electrophoresis, ultraviolet ray photometer and RT-PCR showed that the total RNA obtained by modified Trizol method was of high quality, and suitable for downstream applications.%采用改良的Trizol法对辣椒(Capsicum annuum)叶片的总RNA 进行了提取,利用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法、RT-PCR进行RNA纯度、完整性检测.结果表明,Trizol法提取可获得较高质量的辣椒叶片总RNA,能满足后续的研究需要.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2011(050)017【总页数】2页(P3630-3631)【关键词】辣椒(Capsicum annuu);总RNA;改良Trizol法;提取【作者】李小霞;肖仲久;宋培勇;周逊;谢语【作者单位】遵义师范学院生物系,贵州遵义563002;遵义师范学院生物系,贵州遵义563002;遵义师范学院生物系,贵州遵义563002;遵义师范学院生物系,贵州遵义563002;遵义师范学院生物系,贵州遵义563002【正文语种】中文【中图分类】Q522;S641.3植物组织中总RNA的提取是植物分子生物学研究的基本技术之一，高质量RNA的获得是进行RT－PCR、Northern blot、cDNA 文库构建等分子生物学研究的前提条件［1，2］。
植物组织中富含纤维等多糖物质，很容易与 RNA发生共沉淀［3］，此外 RNase非常稳定，极易导致RNA降解，因此要获得纯度高、完整性好的高质量RNA有一定的难度。
TMV和CMV病毒外壳蛋白基因双靶向的RNA干涉载体构建尹蕾;唐凯悦;张跃新;李猷;律凤霞【摘要】依据RNA干扰机制构建多病毒基因靶向的RNA干涉双元载体系统,为培育抗病毒复合侵染的番茄品种提供遗传转化载体.以烟草病毒病(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)病毒外壳蛋白基因作为RNA干扰靶标基因,针对病毒株系间外壳蛋白基因同源区域设计靶序列引物,经RT-PCR获得两段靶标基因的DNA靶序列.借助T 载体将两段靶序列连接成一条DNA序列.酶切后正向、反向锚定连接到pUCCRNAi中间载体的克隆位点,形成靶序列在载体中的双向重复结构;重复结构酶切后插入含超强启动子的pC2300-35s-OCS表达载体,重组的表达载体质粒电击转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌中,完成RNAi双元载体系统的构建.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2016(000)003【总页数】5页(P759-763)【关键词】烟草病毒病(TMV);黄瓜花叶病毒(CMV);番茄;RNA干涉;载体构建【作者】尹蕾;唐凯悦;张跃新;李猷;律凤霞【作者单位】牡丹江师范学院生命科学与技术学院,黑龙江牡丹江157012;牡丹江师范学院生命科学与技术学院,黑龙江牡丹江157012;牡丹江师范学院生命科学与技术学院,黑龙江牡丹江157012;牡丹江师范学院生命科学与技术学院,黑龙江牡丹江157012;牡丹江师范学院生命科学与技术学院,黑龙江牡丹江157012【正文语种】中文【中图分类】Q789番茄病毒病是由多种病毒单独或复合侵染引起的病害［1］，以烟草病毒病（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）为主要病源。
病原物随病残体在土壤、种子中或其他宿根植物上越冬，生长阶段通过蚜虫、田间操作造成的伤口传病。
番茄病毒病是番茄上发生最普遍、最难防治、为害最严重的病害之一，一般减产20%～30%，影响番茄果实的食用价值，严重时甚至造成绝收［2］。
目前，生产栽培中防治番茄病毒病常采取的方法有选育抗病毒番茄品种、接种弱毒株系诱导抗性、完善栽培技术、隔离传毒蚜虫等方法［3］。
辣椒叶脉黄化病毒中国分离物全基因组克隆及基于外壳蛋白移动蛋白RNA依赖RNA聚合酶编码区域的进化分析刘茂炎1,2刘湘宁李讯张德咏戴良英* 唐前君*收稿日期：2015年7月15日/接受：2015年11月15日/在线发表时间：2015年11月30日摘要本实验的辣椒叶脉黄化病毒（pepper vein yellowsvirus，PeVYV）基因组序列（PeVYV-HN，登录号KP326573）是从湖南省蔬菜研究所（湖南长沙，中国）种植的辣椒植物（Capsicum annuum L.）上分离并通过深度测序sRNA获取的。
该PeVYV-HN基因组由6244个核苷酸，包含六个开放阅读框（ORF），和日本的分离物（AB594828）类似，同样其基因组结构与马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）的其它成员类似。
序列分析表明，PeVYV-HN与日本PeVYV基因组在核苷酸和氨基酸水平上都共享92％的序列同一性。
基于其外壳蛋白（Coat Protein, CP）的，运动蛋白（Movement Protein, MP），和RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）的进化分析表明，PeVYV可以分成对应于其地理来源的两个主要谱系。
相对于非洲分离物，亚洲分离物相具有较高的种群扩张频率。
负选择作用和遗传漂变（奠基者效应）被认为是潜在的PeVYV的分子进化驱动力。
此外，重组不是PeVYV进化的明显因素。
这是在中国PeVYV 的完整基因组序列的第一份报告。
关键词：辣椒脉黄化病毒; 深度测序；全基因组；分子进化马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus），属于黄症病毒科（Luteoviridae）其代表品种马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus，PLRV），当然也包括PeVYV[1–3]。
其基因组为单分子线形正义ssRNA，包含大约6000个核苷酸（nt），在5'端具有一个特异性蛋白（VPg）结构。
一个辣椒轻斑驳病毒中国分离物的基因组测序及分析作者：李丽丽郑敏杨洪一来源：《中国瓜菜》2020年第06期摘要：利用CTAB法分離辣椒叶片总RNA，利用RT-PCR技术扩增出了辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因组不同区域片段。
并经克隆、测序，证明其为辣椒轻斑驳病毒特异序列。
经序列拼接，获得了6 290 nt的辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因组全序列;该序列与GenBank中已报道的其他辣椒轻斑驳病毒基因组的序列同源性为94.0%～99.6%。
系统进化分析显示辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb与日本分离物（PMMoV-J、C-1421、Pa18、TPO-2-19）亲缘关系较近，与西班牙分离物Ia亲缘关系较远。
关键词：辣椒;辣椒轻斑驳病毒;基因组中图分类号：S641.3 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2020）06-012-05Abstract： Total RNA was isolated from leaves of pepper using CTAB method. The fragments located in different regions of a Chinese isolate of Pepper mild mottle virus （PMMoV） were amplified by RT-PCR， and the PMMoV-specific fragments were confirmed by cloning andsequencing. A 6290 nt genome sequence of Chinese isolate Hrb was obtained. The identities between the sequence and other reported sequences in GenBank were 94.0%-99.6%. Phylogenetic analysis indicated that there was close genetic relationship between isolate Hrb with Japan isolates （PMMoV-J， C-1421， Pa18， and TPO-2-19）. In addition， there was far genetic relationship between isolate Hrb with Spanish isolate Ia.Key words： Pepper; Pepper mild mottle virus; Genome辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）是当前辣椒生产中遇到的主要病毒之一[1]。
![一种与辣椒叶色黄化基因连锁的分子标记及应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/8b8b210b366baf1ffc4ffe4733687e21af45ff2a.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010444529.8(22)申请日 2020.05.23(71)申请人 湖南省蔬菜研究所地址 410125 湖南省长沙市芙蓉区马坡岭农科院(72)发明人 杨莎 张竹青 陈文超 梁成亮 李雪峰 周书栋 李鑫 (74)专利代理机构 长沙市融智专利事务所(普通合伙) 43114代理人 袁靖(51)Int.Cl.C12Q 1/6895(2018.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称一种与辣椒叶色黄化基因连锁的分子标记及应用(57)摘要本发明公开了一种与辣椒叶色黄化基因连锁的分子标记及应用。
利用1份高度纯合的材料以及其辐射突变体库中的叶色黄化材料。
利用BSA群体定位的方法获得与辣椒叶色黄化紧密连锁的染色体区域，并在候选区间内开发分子标记。
根据候选基因的单碱基突变设计了1个KASP分子标记，利用该标记对F2群体500个单株进行基因型鉴定，符合率达到100％。
研究结果不仅在杂交制种效率方面具有广阔的应用前景，还为辣椒叶色黄化突变体的筛选，鉴定和辅助筛选辣椒杂交种纯度鉴定等提供新的途径。
权利要求书1页 说明书8页序列表2页 附图2页CN 111500761 A 2020.08.07C N 111500761A1.一种与辣椒叶色黄化基因连锁的分子标记，其特征在于，为辣椒9号染色体5807922bp处C向T的突变。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述的分子标记对应的基因型：T:T为具有叶色黄化表型的基因型，C:C和C:T为不具有叶色黄化表型的基因型。
3.根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，针对突变位点设计的引物包括两条正向引物和一条反向引物，正向引物X：ATAGCCCACGATTTTGGGGGTGGACC；正向引物Y：ATAGCCCACGATTTTGGGGGTGGACT。
辣椒脉黄病毒P4蛋白多克隆抗体制备与应用卜姗;罗香文;张德咏;张松柏;张宇;刘勇【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2022(37)1【摘要】【目的】辣椒脉黄病毒(Pepper vein yellows virus,PeVYV)属马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus),生产上主要侵染辣椒,目前在我国呈现快速扩展态势,因此,亟需开展PeVYV致病性研究,为分析对辣椒的潜在威胁提供依据。
以PeVYV编码运动蛋白P4为免疫源,制备多克隆抗体,建立PeVYV P4蛋白特异性检测方法,为PeVYV P4蛋白功能研究奠定基础。
【方法】采用RT-PCR技术,从感染PeVYV辣椒cDNA中扩增获得片段大小为471 bp的PeVYV P4基因,并克隆到原核表达载体pDEST17,转化E.coli Rosetta中进行诱导表达,采用Ni-NTA柱层析纯化。
以纯化P4蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。
制备的多克隆抗体采用Western blotting检测。
【结果】原核表达的PeVYV P4蛋白,SDS-PAGE表明纯化蛋白为一分子量约为25 kDa的单一条带。
Western blotting检测表明,制备的多克隆抗体,特异性的结合P4蛋白。
PeVYV侵染辣椒样本检测表明,制备的P4多克隆抗体能特异性检测PeVYV。
【结论】制备的PeVYV P4多克隆抗体,可用于特异性检测PeVYV P4蛋白,为进一步深入研究P4蛋白的功能奠定基础。
【总页数】5页(P74-78)【作者】卜姗;罗香文;张德咏;张松柏;张宇;刘勇【作者单位】湖南大学研究生院隆平分院;湖南省农业科学院植物保护研究所【正文语种】中文【中图分类】S436【相关文献】1.水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns6和外壳蛋白P8多克隆抗体的制备及其应用2.葎草花粉致敏蛋白多克隆抗体的制备及其在筛选致敏蛋白组分的应用3.粗糙脉孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备4.百脉根Rac1蛋白多克隆抗体的制备与应用5.番茄斑萎病毒核衣壳蛋白N及膜多糖蛋白Gn的多克隆抗体制备及应用因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
辣椒叶脉黄化病毒中国分离物全基因组克隆及基于外壳蛋白移动蛋白RNA依赖RNA聚合酶编码区域的进化分析刘茂炎1,2刘湘宁李讯张德咏戴良英* 唐前君*收稿日期：2015年7月15日/接受：2015年11月15日/在线发表时间：2015年11月30日摘要本实验的辣椒叶脉黄化病毒（pepper vein yellowsvirus，PeVYV）基因组序列（PeVYV-HN，登录号KP326573）是从湖南省蔬菜研究所（湖南长沙，中国）种植的辣椒植物（Capsicum annuum L.）上分离并通过深度测序sRNA获取的。
该PeVYV-HN基因组由6244个核苷酸，包含六个开放阅读框（ORF），和日本的分离物（AB594828）类似，同样其基因组结构与马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）的其它成员类似。
序列分析表明，PeVYV-HN与日本PeVYV基因组在核苷酸和氨基酸水平上都共享92％的序列同一性。
基于其外壳蛋白（Coat Protein, CP）的，运动蛋白（Movement Protein, MP），和RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）的进化分析表明，PeVYV可以分成对应于其地理来源的两个主要谱系。
相对于非洲分离物，亚洲分离物相具有较高的种群扩张频率。
负选择作用和遗传漂变（奠基者效应）被认为是潜在的PeVYV的分子进化驱动力。
此外，重组不是PeVYV进化的明显因素。
这是在中国PeVYV 的完整基因组序列的第一份报告。
关键词：辣椒脉黄化病毒; 深度测序；全基因组；分子进化马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus），属于黄症病毒科（Luteoviridae）其代表品种马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus，PLRV），当然也包括PeVYV[1–3]。
其基因组为单分子线形正义ssRNA，包含大约6000个核苷酸（nt），在5'端具有一个特异性蛋白（VPg）结构。
基因组包含六个开放阅读框，O RF 0与ORF 1重叠，ORF 2与ORF 1重叠;ORF 4完全处在ORF 3之中。
ORF 5编码76-kDa的通读蛋白，对蚜虫传播至关重要，也有可能是病毒颗粒的稳定因子。
PLRV主要感染茄科的植物，是通过蚜虫传播。
PeVYV是导致叶脉黄化病( yellow vein disease, YVD )的一个重要的病原体，其在西非是一种主要的辣椒病害[4]。
1995年PeVYV 首次在日本得到确定[5]. PeVYV通过蚜虫（Aphis gossypii）、嫁接等固定的方式传播[5]，对辣椒是一个世界性的难题，并经常在与其它病毒混合侵染中发现。
PeVYV可以基于CP序列从其他的病毒容易地区别[6-8]。
辣椒被PeVYV侵染的主要表现症状有叶脉黄化，叶卷曲，叶片变形，叶褶皱和节间缩短等。
PeVYV已经在印度，印尼，马里，菲律宾，西班牙，台湾，泰国，以及苏丹[2, 3]等国家和地区的辣椒作物上分离得到。
最近，有个新的寄主，龙葵(Solanum nigrum)和在印度[3]得到了鉴定。
这些表明，PeVYV具有广泛的地域分布，对辣椒以及其它植物构成全球性的威胁[3, 9]。
日本分离的PeVYV核苷酸序列是储存在基因库（GenBank）仅有的全长序列（登录号AB594828），还有一些也可提供包括在CP，MP和RdRp 基因等部分序列，分别来自在亚洲的台湾，泰国，印度，印尼和菲律宾；在非洲的苏丹，马里和突尼斯; 以及在欧洲的土耳其和西班牙（表S2）。
然而，这些不同的PeVYV分离物的进化史是鲜为人知的[10]。
在2013年，有可能被病毒感染的展示植物矮化，叶片萎缩/畸形，脉间黄化，叶脉变黄，叶片卷曲，叶片褶皱和黄色斑块等症状的辣椒叶片从中国湖南省长沙市收集。
病毒RNA是使用氯化锂法从这些辣椒叶提的[11]，全基因组序列是在Illumina NextSeq 500平台通过小分子RNA（sRNAS）深度测序法得到的。
总共得到12910408个读取点。
低质量的读取数据（Q<20），读取点包含N，并且读取数小于18核苷酸（nt）的，从数据集中移除。
整理好的读取数据集，采用BOWTIE进行BLAST搜索处理，以具有至少15个核苷酸和18-50 nt长度的5'和3'连接匹配作为标准。
在miRBase数据库v.21.0中的初级转录物（pre-miRNA）和成熟miRNA进行BLAST（/BLAST）检索来识别的miRNA。
使用RFAM（10.1）数据库(/)除去非miRNA，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA。
最后，在平均覆盖率达到超过100倍的情况下，PeVYV基因组用Velvet组装成了两个线性重叠群[12]。
长重叠群（3990个核苷酸长度）具有95％的核苷酸序列同源性与PeVYV-日本的31-4020 nt，而短重叠群（1746 nt）与PeVYV-Japan的核苷酸4261-6006 nt具有85％的同源性[13，14]。
根据这两个重叠群设计八个特异性引物（表S1），然后进行RT-PCR 扩增相应的DNA产物。
两个重叠群之间的序列也是利用特异性引物（表S1）进行RT-PCR扩增得到的。
所有RT-PCR的产物通过1％琼脂糖凝胶进行分离，然后使用DNA提取试剂盒（TiangenBiotech, Beijing, China）提取。
纯化的片段克隆到pEASY-T1（TransGen Biotech, Beijing,China），将得到的构体转载到TRANS1-T1噬菌体抗性化学感受态细胞（TransGen Biotech, Beijing,China），具体操作根据制造商的说明。
这八个特异性引物用来通过PCR确定所得到的克隆。
然后五个克隆用来送到BioSune Biotech公司（Changsha,Hunan, China）测序。
3'-和5'-末端序列采用3'和5' RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）（Invitrogen）得到。
在两个连续的片段之间重叠区域的核苷酸序列片段的长度至少为100个基点。
这样一个分离物（命名为PeVYV-HN，accession no.KP326573）通过使用DNASTAR软件（DNASTAR Inc.,Madison, WI, USA）和BioEdit 版本5.0.9 [15] 组装上述序列确定。
全序列的同源性分析使用ClustalW（/Tools/clustalw2/ index.html）[16]和BLAST 进行。
PeVYV分离物，包括PeVYV-HN的外壳蛋白（CP），移动蛋白（MP）和RNA依赖RNA聚合酶（RdRP）的编码区域序列被用来进行进化分析（表S2）。
首先使用CLUSTAL X 2[17 ]对这些序列和亲缘最近的PLRV 分离物的相应区（也担任系统发育分析的外群）进行序列匹配。
为了确保所得的氨基酸对应的核苷酸序列正确编译，采用TRANSALIGN 校准序列。
删除缺口（gaps）后，最终得到的CP，MP和的RdRP序列的长度分别是339，201和483 nt。
从西班牙和土耳其的一些分离物序列经过以上两个步骤后太短，因此，从最后的数据集中移除。
所有序列的推测的重组位点使用RDP4软件包[18]和经典的SimPlot程序[19]进行筛选。
推定的重组事件（P value<1 *10-6）无统计学支持，因此在随后的分析[20]中删除（视为丢失的数据）。
对齐的序列的系统发育树的构建使用最大似然（ML）方法通过PhyML-3.1[21]来实现。
每个数据想核苷酸最适替代模型使用jModeltest0.1.1[22]确定。
结果表明，TrNef+G提供CP序列的最佳拟合，TIM3ef于MP 序列，TIM2ef+I+G为RdRP序列最佳拟合。
使用基于1000倍重复自举法计算支架支持。
此外，采用MEGA5.1[23]软件1000倍自举法构建了一个邻接（NJ）树。
核苷酸和氨基酸序列的相似性分别使用Kimura two-parameter method [24]和DayhoffPAM 250 matrix [25]来评估，而种群内多样性采用MEGA5.1来衡量[25]。
与系统发育关系相关联的非同义（DN）和同义（DS）替换数值的差异各自使用Pamilo-Bianchi-Li (PBL)方法[26]在MEGA5.1中实施计算。
进行了Tajima’s D, Fu和Li’sD*, and F*统计学检测，同时每个PeVYV蛋白编码序列的单倍体多样性，使用DnaSP5.10[27]估计。
PeVYV种群的基因漂流和遗传分化还采用DnaSP5.10计算。
PeVYV-HN的组装全长序列是6244个核苷酸长度。
PeVYV-HN与其他完整的基因组序列的核苷酸序列比较表明PeVYV-HN的1-6244 nt具有最高的身份（92％），与来自日本的分离物序列，同时核苷酸PeVYV-HN的1-5059 nt与辣椒黄化曲叶病毒序列（pepper yellow leaf curl virus，PYLCV，HM439608来自以色列）[28]具有最高的同源性（93％），和序列辣椒黄化病毒（pepper yellows virus，PYV，FN600344）在核苷酸位置2613-4243 nt 具有最高94％的同源性。
另外，PeVYV-HN与日本的分离物共享最高氨基酸序列同源性在ORF0，ORF1，ORF1-ORF2，ORF3，ORF4及ORF3-ORF5（分别是86，92，93，99％，99％，和88％）。
对29个CP，29个MP和20个RdRP序列进行分析，采用SimPlot 和RDP4软件鉴定重组事件。
在PeVYV分离物的三个编码区没有发现重组位点。
三个编码区比较短，因此，分析有可能有低估了重组事件。
使用这些CP，MP和的RdRP 序列来计算构建进化树。
在这些树中所有的序列被一致地分配成相同的两个谱系（I和II）（图1，2，3）。
大多数来自亚洲的分离物聚类在谱系I，而那些来自非洲的则聚在谱系II。
HN分离物显然属于谱系I（亚洲种群），并且在CP进化树上（图1）该分离物聚集在分离物JP（来自日本）旁边。
在CP，MP和的RdRP基因区域分离株间的核苷酸序列差异分别为0.03979±0.00651，0.02418±0.00721和0.05734±0.00630，（表S3）。
在非洲和亚洲PeVYV分离物之间的量级和阈值的差异也被计算了，在非洲的分离物比亚洲的似乎更可变。
