![利用转座子建立细菌单基因突变株库的策略和方法[1]_图文_百.](https://img.doczj.com/img02/18hk1f5kzo3vu0ixxxass2myaf0qv3s-21.webp)
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平板上的转座突变株机器自动挑蓖落
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图1建立转座子突变株库的技术路线
子在铜绿假单胞菌PA01基因组中的转座插入采样数不符合泊松分布,虽然如此,但毕竟在最终还是获得了一个近饱和的突变株库。而Garsin(71等在构建粪肠球菌的Tn917转座插入突变株库时发现,测序的8865个Tn917转座突变株突变基因只对应了610个不同的开放阅读框,远远低于预期的2400个。这些结果说明使用随机性差的转座子会大大增加建库的成本。因此,有的研究利用了两种类型转座子构建突变株,这是为了防止一种转座子可能有的插入热区,而造成在基因组插入位点的随机性不佳,进而造成某些基因的突变株在筛选中漏选,而另一些基因的突变株则被多次重复筛选。两种类型转座子的使用,可以互相弥补,降低发生漏选或者重复筛选的可能性。例如在建立铜绿假单胞菌PAl4突变株库工作中,最开始采用的是Tn5来源的细菌转座子——hphoA。如前所述,尽管Tn5来源的转座子插入随机性非常好,研究者还是发现了至少一个热区(Hot spot,即gacA基因,同样也存在一些冷区(Cold spots。为了避免转座位点的选择性,研究者又采用了真核生物来源的mariner转座子,该转座子能够在很多原核生物中进行转座,而且预计与TnphoA在靶位偏嗜上存在
差异,故联合使用可以降低转座选择性;②对突变基因测定方法采用随机引物PCR的方式,以达到自动化的目的。确定突变株突变基因的方法有很多,如反向PCR等,但
这些方法的最大问题是需要人工参与,无法实现完全自动化测序,从而使确定突变基因的工作几乎不可能完成。而随机引物PCR的方法可以采用机器自动化
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进行,使测序工作完全不需要人工的参与,达到省时省力的目的,从而使建库所耗时间和精力大大降低,可以由一个研究组完成而不需要大规模的协作。
图2随机引物PCR测序方法示意图
依据以上的方法,目前已经建立了有铜绿假单胞菌PA01和PAl4两个突变株库。除此之外,针对特定研究目的的某些小规模的突变株库也参考上述方法建立起来,例如Pobigaylo等根据上述方法用mini—Tn5转座子对Sinorhizobium meliloti建立了一个5000个左右的突变株库喁】6
3建立细菌突变株库的意义
建立细菌突变株库的意义不言自明:第一,建立突变株库将大大促进建库细菌的研究。对细菌基因功能的研究依赖于其突变株的构建,而其构建过程往往耗时耗力。如果已经有一个完整突变株库的话,其他研究者就不需要作这个耗时耗力的工作了,
他只需要将研究的靶基因告诉建库单位,该单位就
利用转座子建立细菌单基因突变株库的策略和方法
作者:丛延广, 胡福泉
作者单位:解放军第三军医大学基础部微生物学教研室,重庆,400038 刊名:
微生物学免疫学进展
英文刊名:PROGRESS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY 年,卷(期:2008,36(2
被引用次数:0次
参考文献(8条
1.Riley M Genes and proteins of Escherichia coli K-12 (GenProtEC 1997
2.Kobayashi K.Ehrlich SD.Albertini A Essential Bacillus subtilis genes 2003(08
3.Giaever G.Chu AM.Ni L Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome 2002
4.Ecoli genomic project
5.Jacobs MA.Alwood A.Thaipisuttikul I Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa 2003(24
6.Liberati NT.Urbach JM.Miyata S An ordered,nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants 2006(08
7.Garsin DA.Urbach J.Huguet-Tapia JC Construction of an Enterococcus faecalis Tn917-mediated-gene-disruption library offers insight into Tn917 insertion patterns 2004(21
8.Pobigaylo N.Wetter D.Szymczak S Construction of a large signature-tagged Mini-Tn5 transposon library and its application to mutagenesis of Sinorhizobium meliloti 2006(06
相似文献(10条
1.学位论文毕志香Tn916诱变的嗜水气单胞菌突变株的特性分析及转座子插入位点的探讨2005
嗜水气单胞菌(Ah是重要的水生病原菌,给水产养殖业造成极大的经济损失,同时还是重要的人畜共患病病原菌。
本文研究对象MJ-1即是采用转座子Tn916诱变技术获得的一株多个毒力因子同时缺失的突变株,将其连传20次后,Tn916仍稳定地存在于MJ-1的染色体上。分析MJ-1的生物学特性,与亲本株相比,其胞外蛋白酶(酪蛋白酶和弹性蛋白酶、淀粉酶、DNA酶、溶血素和S层等几种主要毒力因子不表达;生化特性表
明,MJ-1对部分糖的发酵能力丢失;外膜蛋白图谱、胞外产物图谱发生改变;对HEp-2细胞的粘附性小;对EPC细胞和小白鼠的毒力丢失。MJ-
1株同时缺失多种分泌性胞外毒力因子和细胞表面蛋白如S层等,提示嗜水气单胞菌J-1株中可能存在毒力岛。
为确定Tn916的插入位点,采用PCR技术扩增调控胞外蛋白酶分泌的转录调控蛋白(ahyR全长基因,结果未扩增得到,推测Tn916可能插入到ahyR基因中。进一步采用插入诱变技术构建ahyR基因的突变株以验证Tn916是否插入ahyR基因中。根据GenBank公布的嗜水气单胞菌转录调控蛋白ahyR基因的序列设计一对特异性引物,利用PCR方法扩增AhJ-1株ahyR基因的部分片段(656bp。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经序列测定后定向连接入含有卡那霉素抗性(Kmr基因的自杀性质粒pJP5603中,构建重组质粒pJP-ahyR。将鉴定为阳性的重组质粒转化AhJ-1株感受态细胞,获得一突变株细菌。PCR方法鉴定该突变株为J-1株ahyR基因的同源重组突变株,命名为J-1△ahyR。同时研究了其主要生物学特性。
采用MJ-1株作为弱毒活疫苗免疫剑尾鱼。将剑尾鱼分成4组,免疫组每尾腹腔注射菌数分别为107CFU、105CFU、103CFU,对照组注射0.1mL无菌PBS,30d 后采血测血清凝集抗体效价以及血液中白细胞的吞噬活性,而后用20LD50的Ah强毒株J-1株腹腔注射攻击。每尾注射107CFU组的凝集抗体效价、白细胞的吞噬活性和相对保护力等都比其他免疫组高。试验结果表明弱毒株MJ-1具有很好的免疫原性并对剑尾鱼具有一定的保护力。该研究为嗜水气单胞菌弱毒疫苗的研制奠定了基础。
2.学位论文邓平深红红螺菌高产氢突变株的筛选及转座子插入位点分析2008
能源危机席卷全球,寻找替代能源势在必行。氢能以其来源丰富、重量轻、贮能高、燃烧产物是水等优点成为备受关注的新型能源。光合细菌(photosynthetic bacteria,PSB是一类能进行光合作用并产生氢气的细菌,深红红螺菌(Rhodospirilum rubrum属于兼性厌氧菌,是光合细菌的模式菌株,具有非常重要的研究价值。此外,光合细菌还能分解多种有机物。光能利用,产氢和处理有机废物、废水结合于一体的
特性,使光合细菌显示出了巨大的研究价值。转座子作为遗传学研究的重要工具,能够插入基因组中造成插入突变。利用转座子进行菌株诱变,能够得到较稳定的突变株。并且通过一定的方法,获得侧翼序列,将有利于在分子水平上对产氢机制进行深入的探讨。
二氯化钯(PdCl2溶液能与氢气等还原性气体发生反应而析出黑色的金属钯。本研究据此设计了一种快速筛选高产氢光合细菌突变株的方法。即在96孔深孔培养板中培养光合细菌并使其产氢,用浸润PdCl2的脱脂棉片封盖,以观察对应孔的棉片颜色变化程度来筛选高产氢的突变株。本研究利用转座子构建了光合细菌Tn5随机插入突变库,并应用此法在其中进行了筛选,对选出的高产氢突变株进行发酵,用气相色谱检测其产氢情况,结果发现两种方法得出的结论并不一致,对此情况进行了讨论,提出了改进的方法,为快速筛选高产氢菌株方法的建立打下了坚实的基础。
本研究中,筛选得到一株高产氢菌株R.rubrum RM4。在持续光照条件下,产氢量是出发菌株的1.89倍。利用转座子上携带复制起始点的特点,将高产氢突变株基因组用BamH I进行消化、自连接、转化到大肠杆菌中,并利用转座子引物进行测序,从而得到转座子侧翼序列。经比对,发现转座子插入破坏的基因为丙二酰-CoA脱羧酶(Malonyl-CoAdecarboxylase。目前,并没有相关文献说明此酶与光合细菌产氢有联系,所以很可能存在其他突变位点。
3.期刊论文董洪燕.张小荣.潘志明.彭大新.刘秀梵.Hongyan Dong.Xiaorong Zhang.Zhiming Pan.Daxin Peng. Xiufan Liu转座子随机插入鉴定肠炎沙门氏菌生物膜形成相关基因-微生物学报2008,48(7
[目的]生物膜在沙门氏菌的致病性和引起沙门氏菌食物中毒等方面起着重要作用,本研究为了鉴定影响沙门氏菌生物膜形成的基因.[方法]利用结晶
紫染色定量法对74株鸡源的肠炎、鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌进行生物膜测定,选择生物膜生长较好的肠炎沙门氏菌C050041,采用转座子随机插入法构建突变株库.[结果]84%的鸡源沙门氏菌菌株可在塑料表面形成生物膜;通过转座子插入获得1924个突变株,筛选的生物膜降低突变株经生长曲线测定、测序和序列比对及
Southern blot分析鉴定出15个插入基因,它们分别为metE、ompR、rpoS、,和G、rfaJ、rfaK、rfaP、rfbH、rhlE、spiA、steB、tpx、ybdN和2个未知功能的基因.[结论]我们鉴定出了多个影响生物膜形成的新基因,这些基因的发现为进一步研究沙门氏菌生物膜形成的调控机制,研制减毒沙门氏菌疫苗奠定了基础.
4.学位论文谢春娅甘油利用型深红红螺菌突变株筛选及突变基因性质分析2009
目前能源紧张,许多国家为了减少对非可再生资源石油等的依赖性,正在积极寻找新的替代能源。氢能,因其具有清洁无污染,储能高,可储存、运输等优点,被视为最理想的新型能源。另一方面,随着生物柴油的飞速发展,其副产物甘油出现过剩,如何解决过剩的甘油,引起全球普遍的关注。若能利用甘油产氢,既可解决其对环境造成的压力,也可降低产氢成本,这是一条非常理想的途径。尽管如此,目前相关报道很少,仅2006年刘伯飞等报道克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoiae利用甘油产生1,3—丙二醇和氢气,但相关的机理还不清楚。
深红红螺菌(Rhodospirill umrubrum是一类能进行光合作用并产生氢气的光合
细菌,目前对其产氢机理的研究主要集中在捕光色素、固氮酶、氢酶等方面,而深红红螺菌利用甘油产氢目前未见报道。试验发现野生型深红红螺菌不能在甘油为唯一碳源的培养基上生长。
本研究通过pRL27[Tn5]转座子插入突变构建深红红螺菌的突变库,利用甘油为唯一碳源的筛选培养基,筛选得到甘油利用型深红红螺菌突变株54株。对生长情况较好的B8进行深入研究:PCR检测突变株中转座子上的卡那抗性基因,从分子水平确定转座成功;气相色谱检测其产氢能力,在甘油浓度为10g/L时,产氢速率为
0.24ug/mL/h,总产量为3.7mmol/200mL/day;SDS-PAGE检测发现其和野生型在总蛋白上存在差异,这些差异的蛋白可能和甘油代谢或者代谢调控的相关蛋白有关;利用分子生物学方法确定突变株中转座子的插入位点,发现B8的突变位点位于一个编码胞外可溶性连接蛋白(extracellar solute—bindingprotein,family3的基因上,该蛋白与细胞物质运输和激活后续信号传导相关,也是首次发现其与甘油代谢产氢过程相关。对另外一株突变株C4也进行了相关研究:通过Bioiog检测发现其较野生型能利用
更多种类的碳源;气相色谱检测也发现其与野生型在细胞壁脂肪酸成分上存在极大的差异,这些不同脂肪酸构成的细胞壁与物质进入细胞相关。
本文首次筛选得到利用甘油型深红红螺菌突变株,并鉴定其突变相关基因,需进一步阐明其利用甘油的机理,为今后进一步提高该菌对甘油的利用能力和产氢能力奠定了一定的基础。
5.学位论文盖英宝豚鼠气单胞菌CB101的GlcNAc利用系统及调控蛋白NagC 对chiI和nagA1转录的调控2007
L10是Aeromonas caviae CB101的转座子突变株,研究发现它可以在LB培养基中组成型表达几丁质酶和二糖酶。Tail-PCR和测序发现,两株突变株转座子插入的位置均是GlcNAc利用系统中的nagA基因3’端。以L10 Tail-PCR的产物为探针,利用southern杂交从CB101 cosmid基因文库中筛选到克隆子一个包含nagA基因的克隆子。步移法测序发现克隆子包含GlcNAc利用系统4个基因:nagE、nagB、nagA 和nagC,并且发现惟一的二糖酶基因nagA1在nagE的下游,但在nagC下游没有发
现nagD基因。
nagE是pts转运系统,GIcNAc主要通过该转运蛋白进入胞内,生成GlcNAc-6-P;nagA是脱乙酰基酶,将GlcNAc-6-P脱乙酰基生成GlcN-6-P;nagB是脱氨基酶, GlcN-6-P经nagB脱氨基后形成Fructose-6-P,进入糖酵解途径;nagC是转录负调控因子,调控着nag operon的转录。序列分析显示nagBAC的转录方向相同,而且基因的间隔仅有几个碱基。我们由此推测:nagBAC共转录表达,NagC是几丁质酶和二糖酶的转录调控蛋白,转座子插入nagA破坏了下游的调控蛋白基因nagC的转录和表达,从而几丁质酶和二糖酶变为组成型表达。
为了证明推测,我们构建了nagC缺失突变株CB101△nagC,检测了缺失突变株和L10几丁质酶活性和二糖酶活性以及胞外蛋白的组成。结果表明nagC缺失突变株与L10酶的表达分泌情况基本相同,胞外蛋白大部分是几丁质酶ChiI和二糖酶NagA1。我们利用Realtime-PCR检测了CB101△nagC的chiI和nagA1在转录水平上的变化,检测结果验证了NagC蛋白不仅调控了nag基因簇的nagE、nagB和nagA,
还是chil和nagA1的调控蛋白的假设。为了证明nagBAC共转录,我们用RT-PCR 扩增出了共转录条带,说明nagB、nagA和nagC在转录时共用一个启动子转录。为了进一步阐述NagC蛋白是chiI和nagA1的调控因子,我们对NagC蛋白序列和结构域分析,发现NagC包括两个结构域:Helix-turn-Helix domain和
ROK(repressors,opening reading frames,and kinasesmotif,与E.coli K12的NagC蛋白的两个结构域十分相似,是典型的ROK家族调控蛋白特征。因此我们外源表达了NagC蛋白,并利用凝胶阻滞迁移证明了NagC蛋白可以强烈的结合到chiI and nagA1上游的启动子区。
综上所述,CB101的NagC蛋白不仅调控了nagEBA的转录,同时还是chiI和nagA1基因的转录调控因子,这也是首次发现Nagc蛋白对几丁质酶基因的转录有调控作用。
6.会议论文董洪燕.张小荣.潘志明.彭大新.刘秀梵转座子随机插入鉴定肠炎沙门氏菌生物膜形成相关基因2008 目的:生物膜在沙门氏菌的致病性和引起沙门氏菌食物中毒等方面起着重要作用,本研究为了鉴定影响沙门氏菌生物膜形成的基因.
方法:利用结晶紫染色定量法对74株鸡源的肠炎、鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌进行生物膜测定,选择生物膜生长较好的肠炎沙门氏菌C050041,采用转座子随机插入法构建突变株库.
结果:84%的鸡源沙门氏菌菌株可在塑料表面形成生物膜;通过转座子插入获得1924个突变株,筛选的生物膜降低突变株经生长曲线测定、测序和序列比对及southern blot分析鉴定出15个插入基因,它们分别为metE、ompR、rpoS、rpoS、rfaG、rfaK、rfaP、rfaH、rhle、spiA、steB、tpx、ybdN和
2个未知功能的基因.
结论:我们鉴定出了多个影响生物膜形成的新基因,这些基因的发现为进一步研究沙门氏菌生物膜形成的调控机制,研制减毒沙门氏菌疫苗奠定了基础.
7.学位论文巫益鸣苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518插入突变体库的构建及芽胞萌发相关基因的初步研究2009
苏云金芽胞杆菌因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物,与其它芽胞杆菌相比,一个显著特点就是在形成芽胞的同时还能产生具有杀虫活性的晶体蛋白。芽胞在外界条件适宜的情况下又能萌发并形成营养体,其中的一些相关机制的研究虽然取得了长足的进步,但仍然有诸多未知的领域有待研究,苏云金芽胞杆菌的芽胞萌发及其相关机制方面的研究报道则更少。
本研究利用携带Mini-Tn10转座子的温度敏感型质粒pIC333构建了苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518的随机插入突变体库,寻找和鉴定与芽胞萌发相关的一些基因。通过芽胞萌发实验初筛,以及相差显微镜观察和OD600nm检测的复筛,筛选到一株在萌发剂L-丙氨酸诱导下芽胞不萌发的突变株,命名为MA1。进一步研究表明突变株MA1在其他萌发剂(氨基酸以及糖类物质的诱导下都不表现出萌发的表型。测序获得了转座子Mini-Tn10插入位点侧翼的核苷酸序列长度达6,250 bp,通过NCBI的序列比对分析,确定转座子Mini-Tn10插入基因的表达产物为葡萄糖酸盐透性酶(gluconate permease,GntP,且插入位点位于gntP基因3’末端。GntP的主要功能是将Na+,砷酸盐,亚锑酸盐,硫酸盐等离子透过生物膜,推测GntP可能是作为一种通道蛋白或是一种转运蛋白,使得一些离子或小分子物质跨过芽胞衣以及皮层到达芽胞内膜并与其上的萌发受体结合,激活与萌发相关酶的活性,如皮层裂解酶,使芽胞皮层及芽胞衣更具通透性,致使芽胞皮层部分水化,芽胞核心的DPA以及一些阳离子释放,起始芽胞的萌发。
通过对实验室已有的YBT-1518基因组文库的筛选以及借助载体pHT304亚克隆文库的构建,筛选得到了包含有完整gntP基因的亚克隆子,命名为pBMBW1,并将pBMBW1转化突变株MA1,得到MA1的回复突变菌株BMBW1,并观察其芽胞的萌发情况,结果显示芽胞萌发的表型并未得到回复,故推测转座子Mini-Tn10的插入突
变不仅影响了gntP基因自身的功能,也影响了其侧翼基因(很可能是以操纵子的形式存在的功能。
8.期刊论文邓海华.李晓丹.曹慧.王世明.黄婷婷.崔中利.DENG Hai-Hua.LI Xiao-Dan.CAO Hui.WANG Shi-Ming.
HUANG Ting-Ting.CUI Zhong-Li PNP降解相关基因温敏突变株的分离及其特性研究-微生物学通报2007,34(1
通过接合转移将质粒pSC123上的转座子Tn5随机插入到DLL-E4基因组DNA 中,从大约8,000个突变株中得到1株温度敏感型突变株MT54.根据转座子上的已知序列设计引物以MT54基因组DNA为模板进行PCR扩增,证实MT54的染色体中有转座子插入.MT54在30℃条件下能够以对硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP为唯一碳源生长,但在37℃不能生长.格里斯试色剂法检测NO2-的生成情况进一步证明了MT54的这种特性.通过30℃和37℃两种温度条件下MT54和原始出发菌株DLL-
E4对PNP和对苯二酚降解情况的比较,推测温敏突变位点可能发生在与PNP降解相关的基因中.
9.学位论文刘雪梅耻垢分枝杆菌突变菌株库的建立及耐卷曲霉素突变株的筛选与性质研究2008
结核病(Tuberculosis,TB是一种严重危害人类健康的传染病,其病原菌是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB。目前结核病处于复
结核病的人数，超出各类传染病死亡人数的总和，仅2006年一年因结核病死亡的人数就有1.5亿。同时多重耐药结核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB的出现，以及人类免疫缺陷病毒(HIV的联合感染导致结核病再度在全球成流行趋势，且感染率、发病率和死亡率均居高不下。中国作为一个有着巨大人口压力的发展中国家，其结核病负担也相当严重。目前临床上使用的一线抗结核药物如异烟肼(INH、利福平(RFP、链霉素(SM、乙胺丁醇(EMB和吡嗪酰胺(PZA均已出现耐药菌，这些药物大部分是上个世纪60年代研发的，一直未得到更新，这就制
约了结核病控制进程，尤其近期在非洲人陆发现极端耐药结核分枝杆菌，该病原菌对所有一线抗结核约都耐受。耐药结核分枝杆菌一旦传播开来，人类将面临重大灾难。因此，抗结核二线药物就成为了结核病治疗的生力军。卷曲霉素因其对耐多药及持留期结核分枝杆菌具有独特的疗效，被临床上确定为理想的二线结核病治疗药物，并且，该抗生素也是开发新的肽类结核病药物的模板。随着卷曲霉素住临床上的应用，耐药菌株陆续被发现。因此，深入研究抗结核二线约物的作用机制、耐药机制，指导临床合理用药，以遏制或减缓结核分枝杆菌对此类药物的耐约性，有效治疗MDR-TB以及因持留期结核分枝杆菌引发的感染迫在眉睫。转座子突变技术是研究微生物功能基因组学的一项重要技术。为了进一步探索结核分枝杆菌对卷曲霉素的耐药机制，开发约物作川的新靶点，更好地指导临床合理用药，我们采用转座突变技术，以非致病性、快生型耻垢分枝杆菌为模式生物，构建突变菌株库，并利用高浓度卷曲霉素(100 ug/ml筛选高耐药的突变株，共4株，其耐约药由10 ug/ml提高到200ug/ml。利用PCR技术，克隆4株突变耐药株中已知的卷曲霉素耐药基因(tlyA，rrs，测序，将序列通过BLAST分析，发现4株突变株中，rrs基因均未发生突变，flyA则由于片段较短，难以分析。囚此，我们又尝试了将突变菌株的基因组酶切自连，转化剑人肠杆菌DH5a，利用卡那霉素筛选携带有转座子中卡那霉素基因的自连质粒，测序，获知转座子侧翼序列。在筛选获得卷曲霉素耐药突变株后，进一步比较了野生型和突变型生长特性、细胞全蛋白表达、细胞壁脂肪酸水平、细菌交义耐药等方面的情况。实验结果初步证明了耻垢分枝杆菌对卷曲霉素的高度耐药性与细菌本身的生理变化相关。为进一步阐明结核分枝杆菌的卷曲霉素耐药机理提供了新的思路，也为临床开发新的检测耐药菌株的方法提供了基础。 10.学位论文李繁土壤中有机磷细菌的分离鉴定及解磷突变体的筛选 2004 磷素是植物生长的重要限制因子,单纯依靠大量施用磷肥来解决磷素缺乏已经出现资源浪费、环境污染等诸多弊端.利用植物根际与磷循环相关的生物学系统来解决这个问题已经越来越被人们关注,解磷微生物在这个生物学系统中担任着重要的角色.该实验从北京部分地区采集土样分离纯化出7株解有机磷的微生物,对它们的生理生化性状进行了测定,并对其16SrDNA进行序列分析.根据这些试验结果,S2、S3、X1和He归为假单胞菌属,Y1归为芽孢杆菌属 ,H1归为不动杆菌
属,H2归为寡养单胞菌属.对菌株S2、S3、X1和Y1的G+C﹪含量进行了测定,并将它们与标准参比菌株产碱假单胞(Pseudomonas alcaligenes、铜绿假单胞(Pseudomonas aeruginosa和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus进行了DNA-DNA杂交.杂交结果表明,S2与产碱假单胞菌 (Pseudomonas alcaligenesDNA同源性为81.47﹪,S3与产碱假单胞(Pseudomonas alcaligenesDNA同源性为85.2﹪,X1与产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenesDNA同源性为82.78﹪,Y1与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereusDNA同源性为92.40﹪,所以该研究确定S2、S3和X1为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes,Y1为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus.选取其中的一株产碱假单胞菌S2用Tn5转座子进行了诱变.从2500株接合子中筛选出7株解磷圈增大和1株无解磷圈的突变株.用PCR扩增测序验证了Tn5在S2染色体上的插入,用磷钼蓝比色法测定突变株具体解磷能力增大倍数,最终得到了5株增大1.5倍以上的突变株. 本文链接：https://www.doczj.com/doc/042484754.html,/Periodical_wswxmyxjz200802020.aspx 授权使用：上海交通大学(shjtdxip，授权号：f99909d7-b66e-4a94-a808-
9ea90115f95f 下载时间：2011年3月17日
基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。
平板上的转座突变株机器自动挑蓖落 ?-————-----—-畸到38好L板上培养转到96孔板上 ?-—__—_____--—’进行P僳 I 转另一个板I 山
l 转另一个板l 山 戬.gsT分析数据整理 ●÷————————————一●}--—---————-—一 图1建立转座子突变株库的技术路线 子在铜绿假单胞菌PA01基因组中的转座插入采样数不符合泊松分布,虽然如此,但毕竟在最终还是获得了一个近饱和的突变株库。而Garsin(71等在构建粪肠球菌的Tn917转座插入突变株库时发现,测序的8865个Tn917转座突变株突变基因只对应了610个不同的开放阅读框,远远低于预期的2400个。这些结果说明使用随机性差的转座子会大大增加建库的成本。因此,有的研究利用了两种类型转座子构建突变株,这是为了防止一种转座子可能有的插入热区,而造成在基因组插入位点的随机性不佳,进而造成某些基因的突变株在筛选中漏选,而另一些基因的突变株则被多次重复筛选。两种类型转座子的使用,可以互相弥补,降低发生漏选或者重复筛选的可能性。例如在建立铜绿假单胞菌PAl4突变株库工作中,最开始采用的是Tn5来源的细菌转座子——hphoA。如前所述,尽管Tn5来源的转座子插入随机性非常好,研究者还是发现了至少一个热区(Hot spot,即gacA基因,同样也存在一些冷区(Cold spots。为了避免转座位点的选择性,研究者又采用了真核生物来源的mariner转座子,该转座子能够在很多原核生物中进行转座,而且预计与TnphoA在靶位偏嗜上存在 差异,故联合使用可以降低转座选择性;②对突变基因测定方法采用随机引物PCR的方式,以达到自动化的目的。确定突变株突变基因的方法有很多,如反向PCR等,但 这些方法的最大问题是需要人工参与,无法实现完全自动化测序,从而使确定突变基因的工作几乎不可能完成。而随机引物PCR的方法可以采用机器自动化 79
第十章基因突变 一、教学目的与要求： （1）了解基因突变的类型和性质、特征 （2）掌握基因突变分子机理和诱变因素的作用方式 （3）理解基因突变的检测方法 (4) 掌握基因突变的修复途径 二、教学重点、难点、疑点： 1.突变的概念、类型和性质 2.诱发突变的分子基础 3.诱发突变与人类癌症 4.生物体基因突变的修复机制 5.果蝇基因突变的检出 6.植物基因突变的检出 7.人类基因突变的检出 [解决方法] （1）通过出示基因结构变化的示意图，加深学生对基因突变内涵的理解。 （2）课堂教学中不断提出问题，让学生通过概念的运用达到巩固概念和知识迁移的目的。 2．教学难点及解决办法 基因突变的原因。 [解决办法] 对人类镰刀型细胞贫血症病因结合图解进行分析，使学生真正明白基因突变的原因——DNA复制过程也可能发生差错，基因中个别碱基的变化，就会造成性状改变。 3．教学疑点及解决办法 为什么说基因突变是变异的主要来源？ [解决办法]讲明基因突变与基因重组的区别，联系实际举例。 三、教学方法设计： 四、教具或教学手段：多媒体课件 五、教学过程与板书设计：
第一节基因突变的概念和特征 一、基因突变的概念及类别 1、基因突变：指在染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变基因突变：指染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变 2、类别 隐性突变：A a 显性突变：a A 自发突变—外界环境条件的自然作用或生物体内的生理生化变化而产生的突变 诱发突变—在专门诱变因素影响引起的突变，为“诱发突变” 形态突变型—可见突变：指造成外形改变的突变型 至死突变型—能造成个体死亡或生命力明显下降的突变型 条件突变型—在一定条件下有致死效应 3.一般特征 ①突变的频率：指生物体在每一世代中发生突变的机率，或者在一定时 间内突变可能发生的次数。 高等植物 10-5— 10-8 细菌和噬菌体 10-4—10-10范围大、突变频率比动植物高 例如：氨基酸过程中三种疾病是由三种基因突变导致酶发生变化引起的，有一定的突变频率 苯丙氨酸羟化酶缺乏导致苯丙酮尿症；尿黑尿酸氧化酶缺乏会产生尿黑酸尿症；酪氨酸酶缺乏导致白化病 苯丙氨酸羟化酶 苯丙酮酸苯丙氨酸酪氨酸 积累尿黑尿酸氧化酶 酪氨酸酶 苯丙酮尿症尿黑酸黑色素
此文档下载后即可编辑 基因突变的检测方法 基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且 由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化 程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据 检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象， 一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp 的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过
基因文库中目的基因的筛选 克隆基因的方法有很多，根据研究基础的不同，可以使用以下的方法克隆目的基因： 1. PCR或RT-PCR法 2. 从基因文库中分离基因 3. 从cDNA文库中分离基因 4. 转座子标签法 5. 图位克隆法 6. 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法 7. 人工合成法 本章中主要介绍从基因文库中筛选目的基因的几种方法。 获的目的克隆的方法有两种 1）目的基因的直接选择 2）从基因文库中筛选 称为鸟枪射击法，建立一个包含所有基因或大部分基因的克隆，从中筛选目的克隆。 一、直接选择 直接选择的基因比较少，如抗生素抗性基因。如克隆一个kan抗性基因，在R6-5质粒上含有四种抗性基因：kan, 氯霉素、链霉素、硫胺类药物，kan抗性基因存在于13个EcoRI片段中的一段中。将R6-5的片段插入pBR322的EcoRI位点中，连接混合物中将含有13个不同片段的大量重组拷贝，其中部分是kan抗性的。只有含kan的克隆才能在含有kan的培养基上正常生长。 1.1 标记援救可以扩大直接选择的范围 利用E. coli的突变系可扩展该项技术。例如要从E. coli中克隆trpA基因，编码色氨酸合成
酶，一个突变系不能合成色氨酸，只有加入色氨酸后才能存活。因此E. coli的突变体可以用来克隆trpA基因。首先从一个正常个体中提取总DNA，然后酶切，连接产生大量重组DNA分子，其中一个将携带完整的trpA基因。连接混合物用来转化缺陷型E. coli细胞，大部分转化子是缺陷型的，携带trpA的重组子将是野生型的，可以在基本培养基上生长。 1.2 标记援救的范围和限制 存在两个限制因素： 1）必须存在着目的基因的突变品系 2）需要一种只有野生型能够生长的培养基。 一般而言，标记援救适用于微生物的合成酶，可以在基本培养上选择。
文章编号:042727104(2008)0320301205 收稿日期:2007207213 作者简介:尹 隽(1969—),女,讲师;通讯联系人钟 江,男,教授,E 2mail:jzhong@https://www.doczj.com/doc/042484754.html,. Tn5转座子插入p95基因不影响 AcMNPV 的复制 尹 隽,胡志鹏,宋大新,钟 江 (复旦大学生命科学学院微生物学与微生物工程系,上海200433) 摘 要:从Tn5转座子介导的AcMNPV 随机插入突变体库中,分离到一株复制正常的突变体AcApra41.突变定位发现Tn5转座子插入了病毒p95基因中.为了排除AcApra41中还有其他突变,利用同源重组法构建了p95基因定点插入突变的重组病毒AcGFP 2P95in.PCR 确认p95基因中插入了Tn5转座子;Westernblot 也证实A 2cApra41和AcGFP 2P95in 感染的细胞中,P95蛋白的分子量都因为插入突变而变小,由野生型的95ku 变为55ku.病毒复制动态曲线和荧光显微镜观察证实带有该插入突变的病毒能够在Sf9细胞中正常复制,并表达极晚期基因.这一结果表明完整的P95蛋白对病毒复制是非必须的. 关键词:杆状病毒;突变体;复制;基因表达 中图分类号:Q812 文献标识码:A 杆状病毒(Baculoviridae )是一类主要感染节肢动物的病毒,基因组为双链环状DNA,大小约为80～180kb [1].一方面它们作为基因表达载体已被广泛地用于生产各种蛋白质,另一方面它们也可以作为生物杀虫剂使用.在所有的杆状病毒中,苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Auto gra pha cali fornica multiplenucle 2opolyhedrovirus,AcMNPV )是被研究得最为深入的一种病毒,该种病毒的基因组大小为133894b p,包括156个潜在的阅读框[2].尽管有一些基因已经被研究得很清楚,比如病毒的结构蛋白,必需的顺式作用因子等[327],但还是有许多基因的功能尚不清楚.为了能高效地研究这些未知基因,我们用Tn5转座子介导的随机插入突变法构建了AcMNPV 突变库(李惠等[8],尹隽等,待发表). 本文研究了从突变体库中筛选到的一株p95基因带有插入突变的突变体.研究结果提示完整的P95蛋白对病毒在细胞中的复制是非必须的. 1 材料和方法 1.1 细胞、病毒和菌株 草地贪夜蛾细胞系Sf9细胞用TNM 2FH 培养基(Sigma 2Aldrich,MO,USA )补充10%的小牛血清、100U/mL 青霉素和100U/mL 链霉素培养.带有AcMNPV 基因组的质粒(bacmid )来源于Bac 2to 2Bac 系统(Invitro gen,CA,USA ),保存于大肠杆菌中,它转染Sf9细胞后可以复制产生感染性的AcMNPV [9].以在病毒多角体启动子下游插入绿色荧光蛋白基因(gfp )的bacmid (bacGFP )作为起始病毒基因组,利用体外转座系统构建了AcMNPV 随机插入突变体库(尹隽,发表中). E.coli BJ5183(RecA +)作为重组用菌 株,E.coli EC100(Epicentre,WI,USA )用于保存bacmid.用于培养含bacmid 菌株的抗生素浓度分别为:卡那霉素(Kan )50m g/mL,庆大霉素(Gen )7m g/mL,阿普拉霉素(Apra )20m g/mL. 1.2 Tn5转座子插入定位 参见李惠等[8],简单介绍如下.根据AcMNPV 基因组序列,全基因组每隔1.5kb 沿同一方向设计了88个引物(分别命名为v1～v88,具体序列略).在转座子上设计两个引物Tn 2u p (5′2GTCTCCGACCT 2 第47卷 第3期 2008年6月复旦学报(自然科学版)JournalofFudanUniversit y (NaturalScience )Vol.47No.3Jun.2008
基因突变检测多少钱检测方法是什么 一代测序法（Sanger法）： 科学家Sanger，于1977年建立，他本人也因此而获得了诺贝尔奖。该技术至今已用 三十多年，现在已相当成熟完善。人类基因组计划的测序工作就是使用该项技术完成的， 现在***的仪器是美国ABI公司的***3730型全自动遗传分析仪，是经过国际和国家认证的仪器，可重复性达到100%，是亲子鉴定和法医鉴定的专用仪器。该方法是目前基因检测的国际金标准。缺点是通量小，适合少量样本，可进行个性化位点检测，成本极高，比芯片 或高通量检测高100倍。 Taqman法： 准确性好，适合于大量样本、少量位点，价格贵，缺点是不能读出序列，不太直观。 质谱法： 准确性较好，缺点只能读出质量数据，不能读出序列，对于缺失和插入突变无法读出，但这种突变更加可怕，适合于大量样本、多位点（最多能检测25个位点），所以可能会 出现少量假阳性和假阴性。 二代基因检测芯片法： 适合于超多位点，大量样品检测和科研参考，每个样本做几百个位点和做几千个位点 的检测成本，相差无几，最大优点是成本低廉，一个位点的价格只相当于一代测序价格的1%，缺点是出来的大量数据，可信度不高。 我们都知道“是药三分毒”，癌症患者的过度治疗会造成患者的器脏损伤，甚至化疗 整个过程费钱费力却“不讨好”，所以进行在进行治疗之前先进行基因测序检测，会让靶 向药物治疗事倍功半。 肺癌的靶向药基因检测，现在很多公司都可以做，医院基本上也是外送公司做，看你 检测几个几个基因，一般不会超过7200，一般检测就是EGFR,融合基因ALK,ROS1，C-MET，中源协和基因检测。 一般的，基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术。 基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检 测引起遗传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、 遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。目前有1000多种遗传性疾病可以通过基因检 测技术做出诊断。
1 、基因突变常发生在细胞周期的 A ：分裂间期 B ：分裂期前期 C ：分裂期后期 D ：在分裂期的各个时期都有可能 请选择答案： A:B:C:D: 2 、下列基因突变叙述中正确的是[ ] ①基因突变包括自然突变和诱发突变 ②在DNA复制中，碱基排列顺序发生差异，从而改变了遗传信息，产生基因突变 ③基因突变一般对生物是有害的，但是，也有的基因突变是有利的 ④基因自由组合使生物产生新基因 A ：A．①②③④ B ：B．①②③ C ：C．①②④ D ：D．②③④ 请选择答案： A:B:C:D: 3 、在下列几种育种方法中，可以改变原有基因分子结构的育种方法是 A ：杂交育种 B ：诱变育种 C ：单倍体育种 D ：多倍体育种 请选择答案： A:B:C:D: 4 、通过人工诱变培育的新类型是 A ：无籽番茄 B ：矮秆抗锈病小麦 C ：无籽西瓜 D ：青霉素高产菌株 请选择答案： A:B:C:D: 5 、下列叙述中，不属于诱变育种优点的是 A ：可以提高变异的频率 B ：育种年限显著缩短 C ：大幅度改良某些性状 D ：需大量处理供试材料 请选择答案： A:B:C:D:
6 、下列人类疾病中不是由基因突变引起的是 A ：白化病 B ：血友病 C ：侏儒症 D ：镰刀型盆血症 请选择答案： A:B:C:D: 7 、下列各项中可能产生新基因的是 A ：用离体花药培养玉米植株 B ：用秋水仙素得到三倍体西瓜 C ：通过杂交培养抗病小麦品种 D ：用X射线处理青霉素菌种 请选择答案： A:B:C:D: 8 、若一对夫妇所生育子女中，性状差异甚多，这种变异主要来自 A ：基因突变 B ：基因重组 C ：环境影响 D ：染色体变异 请选择答案： A:B:C:D: 9 、杂交育种依据的主要遗传学原理是 A ：染色体变异 B ：基因连锁互换 C ：基因自由组合 D ：基因突变 请选择答案： A:B:C:D: 10 、进行无性生殖的生物，可遗传的变异来源是 A ：基因重组和基因突变 B ：基因重组、基因突变、染色体变异 C ：基因突变、染色体变异 D ：基因重组、染色体变异 请选择答案： A:B:C:D: 11 、在育种实验中，将纸袋套在花上的目的是 A ：保持开花的温度和水分 B ：防止花粉成熟后散失 C ：防止自花传粉 D ：防止外来花粉的干扰 请选择答案： A:B:C:D: 12 、
转座子及其相关技术的研究 摘要：转座子是一类在细菌的染色体,质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分,是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列，转录组的活动对生物体基因组的转录以及演变存在着严重影响，本文就转座子的基因机理及特征、转座子沉默、转座子的标签技术以及其在植物中的运用进行阐述。 转座子是存在于DNA上可自主复制和移位的基本单位。MclCintockl’嗜次在玉米中的发现改变了人们对基因组序列稳定性的认识，打破了遗传物质在染色体上呈线性固定排列的传统理论。目前认为，多数生物体有自发突变且有重要表型效应出现的原因源于转座子的可动性，并且可以导致宿主基因组发生从点突变到染色体重排的一系列变化，转座子在进化上为建立宿主基因特性起着重要作用。 1.转座子特征与分类 基因转座时发生的插入作用中受体分子都有一段3-12bp的靶序列DNA会自我复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。转座子可以分为两大类：以DNA-DNA方式转座的转座子和反转录转座子。第一类转座子可以通过DNA复制或直接切除两种方式获得可移片段,重新插入基因组DNA中。第二类转座子又称为返座元，在结构和复制上与反转录病毒类似，它通过转录合成mRNA,再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座。 2转座子相关技术 2.1转座子分离方法 有4种方法用来分离转座子:(l)转座子诱捕法，此法适用于分离具有相当高的整合和切割频率的转座子。(2)Southern杂交法，此种方法需要有适当的探针，用于检测已知的转座子。(3)重复DNA序列鉴定法，适用于高拷贝数的无论是否有活性的转座子。(4)PcR扩增法，对己知序列的转座子可以设计引物直接PCR扩增。
2、试剂和耗材） GIAGEN,德国QIAamp?DNA Blood Mini Kit （）Platiinim?Taq DNA Polymerase High Fidelity （Invitrogen, 11304-102 Nuclease-Free Water （Promega,P 1195） d NTP Mix （Promega,P 151B） PCR引物：北京博迈德科技有限公司合成 DL10000 DNA Marker（TAKARA,大连宝生物）DNA分子定量标准：技术Bioer 产物回收纯化试剂盒（BioSpiii Gel Extraction kit,日本PCR有限公司）公司） Axygen, 200-1000 ul 吸头（美国110.5?10 u、2?20 u k 20-200 □、管EP、 仪.器3 ；Taimon1600R凝胶成像系统分析仪（上海天龙公司）Eppendorf 5417R 高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）公司，美国）Allegra 6R离心机（Beckman-Coulter应涡旋混合器（北京北德科学仪器厂）MVS-1公司，德国） 1000 u 150 口1、200 ul、（Eppendorf^ 口1 移液器、10 U 1、NEWAIR 公司，美国）1【级生物安全柜NU425-400E （拓速冷冻离心机（BECKMAN COULTER 公司，美国）X-15R 公司德国）仪（Eppendorf Eppendorf Masteicycter PCR 公司，美国）（Bio-Rad电泳仪：Universal 024BR电热恒温水浴器（北京来亨科贸有限责任公司）240全自动凝胶成像系统（中国）凝胶成像分析系统：Tocan 测序仪：GenomeLab CEQ/GeXP （BECKMAN COULTER 公司，美国）20 u k 200 ul和1000 ul加样器（吉尔森公司，法国）旋涡震荡器（Scientific Industries公司，美国） 二、实验方法 1、样品采集，送检和保存 乙二胺四乙酸（EDTA） -3K抗凝管采集HIV和HEV合并感染者外周静脉血，于24h内测定CD4+T淋巴细胞计?数，抗凝血经常规离心分离全血中间层，分装后-80°C冻存用于P53基因变异的测定。 2、血浆样本DNA的提取 取200 P1全血中间层于1.5ml无菌EP管中，加入20 口1蛋白酶K；再加入200 ul AL缓冲液，涡旋振荡15秒，56°C孵育10分钟；瞬时离心EP管，加入200 u 1 无
基因突变的检测方法
基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。 突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR 产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程
实验六转座子引起的插入突变 一、实验目的 通过实验进一步认识转座子的遗传学效应之一：转座可引起插入突变。 二、实验原理 转座子（transposon，Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（insertion sequence，IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。 复合式转座子（composite transposon）是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，IS 序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的（3-12bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。 转座作用的遗传学效应有如下几个方面，转座引起插入突变；转座产生新的基因；转座产生染色体畸变；转座引起的生物进化。 常见的大肠杆菌复合转座子的抗药性、大小、末端重复序列和转座特性 转座子抗药性大小（bp）末端重复序列转座特异性转移频率 Tn1 Ap 4800 140bp（反向）低有时高有时低Tn2 Ap 4800 140bp（反向）低有时高有时低Tn3 Ap 4600 140bp（反向）低一般 低低 Tn4 Su、Sm 20500 140bp （并带有Tn3） Tn5 Kan 5200 1460bp 低 Tn6 Kan 4100 低 Tn7 Tp、Kan 高低 Tn9 Cm 2500 800bp（顺向） （实际上即IS1） Tn10 Tc 9300 1400bp（反向） 一般 （实际上即IS2） Ap：氨苄青霉素抗性 Su：磺胺抗性 Kan：卡那霉素抗性 Sm：链霉素抗性 Cm：氯霉素抗性 Tc：四环素抗性 Tp：甲氨苄氨嘧啶抗性
肿瘤基因突变检测 癌症是一类难以预防的疾病，中晚期癌症治愈的可能性又很小，而早期癌症的治愈率可达65%以上，有些肿瘤可达90%以上，因此，战胜癌症的关键是早期发现癌症。由于癌症早期常无特殊症状，甚至毫无症状，故癌症的早期发现、早期诊断主要是通过定期健康体检和人群筛查完成。目前筛查癌症的方法主要是通过化验血肿瘤指标及B超、CT、MRI、PET-CT 等检查，但这些方法的敏感性和特异性均不高，发现有异常时往往已是中晚期。 17种常见高发肿瘤，包括乳腺癌（breast cancer）、结肠癌（colorectalcancer）、子宫癌（endometrial cancer）、脑胶质瘤（glioma）、白血病（leukemia）、肺癌（lungcancer）、淋巴癌（lymphoma）、成神经管细胞瘤（medulloblastoma）、黑色素癌(melanoma)、间皮瘤(mesothelioma) 、多性骨髓瘤(multiple myeloma) 、卵巢癌(ovarian cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer) 、真性红细胞增多(polycythemia vera) 、前列腺癌(prostatecancer) 、肾细胞癌(renal cell cancer)和恶性内瘤(sarcoma)，其发病机制涉及与多种肿瘤发生共同相关的肿瘤易感基因群介导的分子改变，参与了肿瘤发生的早期分子事件。系统寻找和探讨它们在肿瘤发生发展过程中的遗传学变异，对阐明肿瘤早期发生机制及寻找肿瘤早期预警、早期诊断和早期治疗的分子靶标都具有重要的现实意义。利用高通量分子测序技术平台，可同时开展多个肿瘤基因突变检测项目，如EGFR、K-RAS 、N-RAS、B-RAF、PI3K 、p53、p16、BRCA1、
1文献综述 1.1水稻基因组学研究现状 1.1.2 水稻全基因组测序 水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮食作物之一，全世界有一半的人口食用它，水稻年总产量占世界粮食作物产量第三位，维持较多人口的生活。亚洲是世界水稻主产区，近年稻米产量占世界的90%以上，中国稻米年产量占亚洲的38%。大米作为我国主要粮食种类，在养活我国13亿人口和改善我国居民营养结构中具有举足轻重的影响。同时，水稻又以其基因组相对较小(～430Mbp)，高效的遗传转化体系，与玉米、大麦和小麦等其它禾本科作物在基因组上存在明显的共线性，而成为研究单子叶植物的模式植物。 国际水稻基因组计划(IRGSP)启动于1998年，以粳稻品种(japonica)日本晴(Nipponbare)为模式材料，由中国、日本、美国等是十个国家参与，所采用的方法为逐步克隆策略(clone by clone sequencing)，随后在2002年由日本和中国科学家率先公布了第1、4染色体的精确序列(Feng et al., 2002; Sasaki et al., 2002; Consortium 2003)；2003年9月第10条染色体的全长序列由美国Clemson大学公布(Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium, 2003)。2005年8月水稻全基因组精确序列在Nature发表(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。IRGSP公布的水稻“日本晴”精确序列经过分析表明：(1) 水稻“日本晴”基因组大小为389Mb，IRGSP公布的序列能够覆盖其全基因组的95%，并包含了所有的常染色质和两个完整的着丝粒；(2) 整个基因组中包含大约37544个非转座相关基因，其中71%的基因可能在拟南芥中有同源基因；(3)通过与拟南芥基因组序列对比分析发现，拟南芥90%的基因在水稻中可能存在同源物；(4) 水稻中预测的37544个基因中，29%是属于成簇的基因家族；(5) 水稻基因组中转座元件的数目和种类与玉米和高粱基因组共线性区段的扩张是一致的；(6) 有证据证明基因能从细胞器中转移到细胞核(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。 另外的一些科学研究部门和公司也分别启动了各自的水稻测序计划。如华大基因在2005年宣布完成籼稻品种“93-11”的全基因组序列测序，其所采用的方法为鸟枪法。Syngenta公司也于2002年宣布完成了粳稻品种“日本晴”的全基
转座子 科技名词定义 中文名称：转座子 英文名称：transposon;Tn 定义1：转座元件中的一种，具有完整转座元件的功能特征并能携带内外源基因组片段(单基因或多基因)。在基因组内移动或在生命体之间传播并可表达出新的表型。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；基因表达与调控（二级学科） 定义2：转座因子中的一种。除含与转座有关的基因外，还含抗药基因、抗重金属基因和接合转移基因等，可赋予受体细胞一定的表型特征。 所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 Ac-Ds转座元件 转座因子或转座子是一类在很多后生动物中（包括线虫、昆虫和人）发现的可移动的遗传因子。一段DNA顺序可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用，此过程称转座。这段序列称跳跃基因或转座子，可分插入序列（Is因子），转座（Tn），转座phage。 目录
编辑本段简介 Transposon a segment of DNA that can become integrated at many different sites along a chromosome (especially a segment of bacterial DNA that can be translocate 转座子引起的插入突变 d as a whole)
转座子是一类在细菌的染色体,质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分,是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列. 转座子是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分 转座(因)子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。 复合型的转座因子称为转座子(trans—poson，Tn)。这种转座因子带有同转座无关的一些基因，它的两端就是IS，构成了“左臂”和“右臂”。两个“臂”可以是正向重复，也可以是反向重复。这些两端的重复序列可以作为Tn的一部分随同Tn转座，也可以单独作为IS而转座。 玉米“花斑”由一种转座因子的存在所导致 转座子是细菌细胞里发现的一种复合型转座因子，这种转座因子带有同转座无关的一些基因，如抗药性基因；它的两端就是IS，构成了“左臂”和“右臂”。两个“臂”可以是正向重复，也可以是反向重复。这种复合型的转座因子称为转座子(trans—poson，Tn)。这些两端的重复序列可以作为Tn的一部分随同Tn转座，也可以单独作为IS而转座。Tn两端的IS有的是完全相同的，有的则有差别。当两端的IS完全相同时，每一个IS都可使转座子转座；当两端是不同的IS时，则转座子的转座取决于其中的一个IS。Tn有抗生素的抗性基因，Tn很容易从细菌染色体转座到噬菌体基因组或是接合型的质粒。因此，Tn可以很快地传播到其他细菌细胞，这是自然界中细菌产生抗药性的重要来源。 两个相邻的IS可以使处于它们中间的DNA移动，同时也可制造出新的转座子。Tn10的两端是两个取向相反的IS1O，中间有抗四环素的抗性基因(TetR)，当TnlO整合在一个环状DNA分子中间时，就可以产生新的转座子。当转座子转座插人宿主DNA时，在插入处产生正向重复序列，其过程是这样的：先是在靶DNA插入处产生交错的切口，使靶DNA产生两个突出的单链末端，然后转座子同单链连接，留下的缺口补平，最后就在转座子插入处生成了宿主DNA的正向重复。
基因突变的检测方法 基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。 突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR 产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适
基因变异广义上说就是指基因结构变化从而产生了可遗传的变异。也就是说DNA水平上的突变造成的基因改变。而这一突变过程可能有很多原因，有自发性的，比如DNA配对过程中的装配错误，也有外源性的诱导因素，如物理，化学，生物因素等造成染色体结构改变或者基因结构的直接变化。 突变的形式多种多样，常见的有：点突变，即一个或多个核苷酸发生了改变；框内突变指的是3个或是的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加1个或几个氨基酸；除此之外，还存在着DNA大片段的缺失，通常是指几百个bp至几十个kb的碱基缺失或复制。 这其中，最常见的莫过于点突变，他是指一个或者几个核苷酸的缺失或改变，通常会形成三种类型，第一种是同义突变，即碱基替换后，虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码的兼并性），亦称静止突变，第二种是错义突变，指的是碱基替换，密码子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基酸，第三种是无义突变，即碱基替换后，使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。 基于上述的变化，常见的基因变异研究方法有如下几种 一、筛选性方法 有人将这类方法分为2类，根据电泳性质不同及其他包括化学修饰法等 1 RNase 法 该法是一种最早提出的检测DNA突变的方法口。其原理是RNase可以识别RNA：DNA或RNA：RNA杂交链中错误配对的碱基并将其切断。经聚丙烯酰胺凝胶电泳将正常链及被切断的含有突变点的链区分开来。杂交方法是将同位素或其它方法标记的正常野生型RNA 片段与相对应的待测DNA 片段混合，90"C
左右变性并在室温下复性形成杂交分子。当待测DNA 片段中存在碱基突变时，在该位点上二条链不能正常配对，便成为RNase的识别和切割位点 2 DGGE、CDGE、TGGE、TSGE法 梯度变性凝胶电泳（DGGE）原理是当双链DNA在梯度变性的聚丙烯酰胺凝胶中行进到与DNA变性温度(熔点温度)一致的凝胶变性浓度位臵时，DNA 发生解旋变性此时电泳速度迅速降低。而当解旋的DNA链中有一个碱基突变时，将会影响其电泳速度变化的程度，从而将正常与突变的DNA区别开。 CDGE(constant denatural gel electrophoresis)法通过预实验或理论计算预先精确确定待测DNA片段的熔点温度后采用单一变性浓度凝胶电泳，简化了DGGE 法的操作 类似于CDGE法，TSGE (temperature sweep gel electropnoresis)法则取消了温度梯度而代之以单一温度 这类方法的优点是：(1)检出率高，～100 (2)可用于分析突变——正常DNA 混合样品；(3)可以回收分离出的DNA 片段；(4)可以直接测定未经扩增的DNA 。这类方法的缺点也很多，如(1)分析片段较小，<500 bp；(2)需要制备昂贵的GC clamp(3)需要事先经过复杂的计算机处理计算熔点温度或预试验确定变性条件； (4)位于高度富含GC的片段中的突变可能漏检。鉴于以上不利因素，DGGE等一类方法有逐渐被SSCP(单链构象多态性)法取代的倾向。尽管如此，这类方法一经建立，应用十分方便，适于大规模样品分析 3 SSCP法 单链构象多态性(single strand conlotraation polymorphism，)是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA或RNA分子依其碱基序列不同而形成不同构象，