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Tn5引爆极速建库和长片段之战近10年间，NGS（Next Generation Sequencing）技术高速发展，测序仪器不断更新迭代，形成规模化。
在测序模式产业化的大环境下，测序样本制备成为其中很重要的一环。
样本起始量要求过高、建库流程繁琐等都会限制NGS技术的应用。
科学家们一直在不断探索，试图突破此类限制，其中转座酶（Transposase）技术引入建库中就是很大的进步，不仅解决了上述问题，转座酶也在NGS上开发了多个技术应用，拓展了NGS的适用范围。
20世纪40年代，美国遗传学家芭芭拉.麦克林托克在玉米的研究中发现了转座子（Transposon），随后，她花了整整6年的时间来研究转座子的奥秘。
在50年代，当麦克林托克向世人公布她的发现时，学术界并没有多少人认可，但是真理是经得起时间检验的，随后的几十年间科学家们在生物界各个领域证实了转座子系统的广泛存在。
1983年，瑞典皇家科学院诺贝尔奖金评定委员会终于把该年度的生理学和医学奖授予这位81岁高龄的、不屈不挠的女科学家。
麦克林托克是在遗传学研究领域第一位独立获得诺贝尔奖的女科学家，她的名字将和转座基因一起被载入科学史册。
转座基因俗称跳跃基因，它的发现改变了人们对基因组序列稳定性的认识。
理论上的突破也带来了应用上的拓展，科学家们群策群力，将转座子系统开发成基因研究的各种工具，这又反过来促进了遗传学理论的研究。
转座子标签(transposon tagging)技术是研究功能基因的有效工具之一。
比如模式植物大多都有很好的突变体库，其中玉米的两个应用最为广泛的突变体库（uniformMu和Ac/Ds突变体库）就是利用转座子创建的。
转座子标签技术克隆基因的基本原理：转座子是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳到另一个位置。
当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型。
通过遗传分析可确定某基因的突变是否由转座子引起，由转座子引起的突变便可以转座子DNA为探针，从突变株的基因组文库中钓出含该转座子的DNA片段，并获得含有部分突变株DNA序列的克隆，进而以该DNA为探针，筛选野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。
基因图位克隆的策略与途径拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。
同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的通常特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包含农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切有关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。
基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。
不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都务必首先将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因工程或者分子生物学的起点。
本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。
1、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先明白基因的DNA序列，也无需预先明白其表达产物的有关信息。
江西农业学报 2009,21(5):108~110Acta Agricu lt urae Ji angxi转座子应用的研究进展马艳平,刘永生*,张杰,丁耀忠,杨生海收稿日期:2009-03-09基金项目:国家自然科学基金资助项目(30700597)。
作者简介:马艳平(1984-),女,硕士,山东宁津人,主要从事病毒分子生物学和免疫学研究。
*通讯作者:刘永生。
(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室、农业部畜禽病毒学重点开放实验室、农业部兽医公共卫生重点开放实验室,甘肃兰州730046)摘 要:转座子是存在于DN A 上可自主复制和移位的基本单位,它存在于生物界的各个领域,转座子及其相关技术是后基因组时代用于研究基因组功能的生物技术。
综述了转座子的分类、转座子的转座机制以及转座子的应用与发展前景。
关键词:转座子;分类;转座机制;应用中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1001-8581(2009)05-0108-03R esearch Progress i n Applica tion of T ransposonMA Yan-pi ng ,LIU Yong-s heng *,Z HANG Jie,DING Yao-z hong ,Y ANG Sheng-hai(S tate K ey Labora t ory of Veterinary Eti olo gical B i ol ogy ,Key Laboratory of An i m alV irolo gy ofM i nistry of Agr i cu lture ,Key Labo 2ra t ory ofVe teri nary Pub lic H ealth ofM i n istry of Agricu lt ure ,Lanzhou Veter i na ry R esea rch Instit u te ,Ch i nese Acade m y ofAgricult ural Sciences ,Lanzho u 730046,Ch i na)Abstra ct :Transposon is t he basic unit of se lf-rep lica ti o n and shift i n D NA ,it exists i n all fi e l ds of b i ol ogy ,transposon and its re lated technolo gy are the po werful weapons for st udyi ng the functi o n of the geno m e i n the post-geno m e era .Th i s a rtic l e revie ws t he classificatio n of transposo n ,the transposable m echanis m of trans poson ,as we ll as the appli cati on and dev e lo p m enta l prospects of trans 2poso n .K ey wor ds :Transposon ;C lassificatio n ;Transposab l e mechanis m;App lica ti o n转座子又称跳跃因子,其实质是基因组上不必借助于同源序列就可移动的DNA 片段,它们可以直接从基因组内的一个位点移到另一个位点。
突变体构建方法
突变体构建的方法主要包括化学诱变法、基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）和转座子标签法等。
1. 化学诱变法：利用化学物质如紫外辐射、亚硝基脲、硫酸二乙酯等处理细胞，导致DNA结构发生突变，从而获得突变体。
2. 基因编辑技术：包括TALEN、ZFN和目前流行的CRISPR-Cas9等方法，可以精确地编辑生物的基因序列，高效地创建基因敲入、敲除等变异，从而构建突变体。
3. 转座子标签法：通过转座子插入到基因组中的各个位置，产生可识别的突变，通过这种标签法能大量快速地获得突变体库。
这些方法各有其优点和缺点，选择哪种方法取决于研究目的、实验室的技术和能力等因素。
以上信息仅供参考，建议阅读相关文献或咨询专业人士以获取更多信息。
文章编号:042727104(2005)0420498205收稿日期:2005205209基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070031)作者简介:李 惠(1979—),男,硕士研究生,通讯联系人钟 江教授.E 2mail :jzhong @.利用T n5转座子构建杆状病毒AcMNPV 随机突变体的初步研究李 惠,赵明磊,尹 隽,钟 江(复旦大学生命科学学院微生物学与微生物工程系,上海 200433)摘 要:以杆状病毒模式种AcMNPV 为研究对象,应用基于Tn5转座子的随机转座的方法,构建杆状病毒突变体库.将果蝇hsp70启动子后接绿色荧光蛋白基因后插入Tn5转座子,构建了可以在昆虫细胞中表达,易于跟踪的转座载体.利用体外转座系统将转座子随机插入AcMNPV 基因组,并用转座反应液转染S f21细胞,得到了表达绿色荧光蛋白的病毒突变体库.进一步纯化了两株病毒B9F 和Li6A ,进行了转座子插入位点的分析,确定两株病毒中,转座子分别插入了94K 基因和p10基因.该方法将为杆状病毒功能基因组研究提供重要的手段.关键词:AcMNPV ;Tn5转座子;转座酶;突变体中图分类号:Q 939.4 文献标识码:A 杆状病毒A utographa calif ornica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMN PV )是一种应用广泛的真核表达载体1,2和具有潜力的生物杀虫剂3,4,近年来的研究显示它也有可能发展成为一种有效的哺乳动物细胞基因转导和基因治疗的载体5.AcMN PV 基因组长133894bp 6,共有154个潜在的开放阅读框.目前共有约70个基因的功能得到不同程度的研究和鉴定.同时,尚有大量基因的功能有待深入研究.高效地获得各种突变体是分析研究基因功能的重要环节.Tn5是一种细菌的转座子,两端分别带有转座元件IS50R 和IS50L ,可在Tn5转座酶催化下随机插入、整合到目标DNA 序列中,同时带入两端转座元件以内的DNA 序列.本研究构建了带有昆虫细胞表达元件和绿色荧光蛋白基因的转座载体,通过体外转座反应和细胞转染得到了带有随机插入突变的AcMN 2PV 突变库.在此基础上分离并分析了2个突变病毒株.1 材料和方法1.1 细胞、病毒和质粒草地贪夜蛾(S podoptera f rugierda )Sf21细胞系,E.coli DH5α,AcMN PV 1A 株,质粒p HZ402,pAcDZ1均为本实验室保存,转座子构建质粒pMod2购自Epicentre.Sf21细胞用TNM 2FH 培养液加10%胎牛血清培养.细菌、质粒、基因操作参照文献7.1.2 带有昆虫细胞表达框架的T n5转座子的构建以pAcDZ1为模板通过PCR 扩增果蝇hsp70启动子,引物分别为5’2ACA TGCA TGCTA 2G AA TCCCAAAACAAACTG 23’和5’2GG AA TTCTA TTCA G A GTTCTCTTCTTG 23’,反应条件为预变性95℃5min ;然后95℃1min ,56℃30s ,72℃1min 共30个循环;最后72℃延伸10min.扩增得到长度约为500bp 的产物,经电泳、胶回收试剂盒(V 2gene )纯化,并克隆到T 载体(Ta KaRa )上,得到p T 2hsp70p ,序列分析验证其正确.用Nco Ⅰ和S ac Ⅰ双酶切p T 2hsp70p ,分离2.7kb 片段;用同样的酶双酶切p HZ402,胶回收分离800bp 的gf p 基因片段.两片段连接得到p T 2hsp70p 2gfp.以B am H Ⅰ和S ac Ⅰ双酶第44卷 第4期2005年8月复旦学报(自然科学版)Journal of Fudan University (Natural Science )Vol.44No.4Aug.2005切p T 2hsp70p 2gfp ,回收1.3kb 片段,连接到用同样的酶双酶切处理的转座子构建质粒pMod2上,得到pMod 2hsp70p 2gfp (见图1).1.3 AcMNPV D NA 的制备Sf21细胞悬浮培养至约1×106个时(参照文献8),按MO I =1pfu/cell 接种AcMN PV ,48h 后,细胞悬液以5000r/min 离心15min ,取上清液.上清液再以17000r/min 4℃离心30min ,用450μL 无菌水悬浮沉淀.加入50μL 10%的SDS ,56℃30min ;加入蛋白酶K 至100μg/mL ,再次56℃30min.用酚/氯仿法抽提病毒基因组DNA ,乙醇沉淀DNA.以50μL 无菌水溶解DNA ,4℃放置待用.图1 pMod 2hsp70p 2gfp 质粒及转座子示意图Fig.1 Structure of pMod 2hsp70p 2gfp1.4 体外转座以pMod 2hsp70p 2gfp 为模板进行PCR ,引物分别为FPP (5’2A TTCA GGCTGCGCAACTGT 23’)和RPP (5’2GTCA GTG A GCG A GG AA GCGG AA G 23’)(Epicentre ,图1),得到线性转座子DNA 片段.反应条件为:94℃预变性5min ;然后,94℃30s ,55℃30s ,72℃1min 共30个循环;最后72℃延伸10min.PCR 产物纯化后用于进行体外转座反应.转座反应参照Epicentre EZ ∶∶TN 转座酶说明书进行,10μL 反应液包括2μL AcMN PV DNA ,6μL 线性转座子序列,1μL 10×buffer 和1μL EZ ∶∶TN 转座酶.37℃反应过夜.1.5 细胞转染5×105个Sf21细胞27℃静置培养2h ,使细胞贴壁.取5μL 上述转座反应液,用Cellfectin (Invitro 2gen )转染细胞,方法参见产品说明书.转染后细胞27℃培养,Nikon HFX 倒置荧光显微镜观察.转染后72h ,收集细胞的培养上清液,作为重组病毒库的原代病毒液,4℃保存备用.1.6 突变体病毒株的分离通过空斑试验进行.六孔细胞培养板中每孔加入5×105个Sf21细胞,27℃静置2h 后,吸去上清液,加入适当稀释度的病毒液1mL ,27℃感染3h 后,吸去病毒液,同时将3%低熔点琼脂糖融解,与两倍体积的细胞培养液混合,加入到各孔中,每孔2mL.静置培养1h ,待琼脂糖凝固后,每孔再加入1mL 培养液.27℃培养3～5d ,至空斑出现.挑取空斑,悬浮于培养液中.如此重复空斑试验数轮,得到纯化的病毒株.图2 PCR 确定转座子的插入位点示意图Fig.2 Primers for the determination of transposon interstion site via PCR1.7 转座子插入位点分析沿病毒基因组每隔3kb 左右设计一个引物,共44个引物(Ac1244,图2,表1),同时根据转座子序列设计向上游和向下游的引物(Mod 2up 和Mod 2down ,图2,表1).分别以Mod 2up 、Mod 2down 与Ac1244组成引物对,共88对,进行PCR 反应.Mod 2up 或Mod 2down 可与转座子插入位点附近的一个引物产生PCR 反应产物(图2).与野生型病毒对照,并通过对PCR 产物的序列分析,确定转座子的插入位点.2 结 果2.1 携带昆虫细胞表达元件的转座子的构建PCR 扩增hsp70启动子,并接到绿色荧光蛋白基因(gf p )上游,然后再将该表达框插入转座子构994 第4期李 惠等:利用Tn5转座子构建杆状病毒AcMNPV 随机突变体的初步研究建质粒pMod2,得到带有昆虫细胞表达框架的Tn5转座子的质粒pMod 2hsp70p 2gfp (图1).将质粒转染细胞后,荧光显微镜观察可见部分细胞产生微弱绿色荧光(图未显示),表明该hsp70启动子/gfp 表达框架可以在昆虫细胞中表达.表1 用于确定转座子位点的PCR 引物的序列和在病毒基因组上的位置Tab.1 The nucleotide sequences and positions in AcMNPV genome of primers used for the determination oftransposon instertion site via PCR名称序列(5’———3’)起点位名称序列(5’———3’)起点位Ac 21tgtggaccgcagaacagata 627Ac 224cgaatatggacctaacaacc 71362Ac 22aaggctctgacgcatttcta 3545Ac 225tgtggtaatagtggcgttgg 74761Ac 23cacaacggaaggtcgtctgc 6445Ac 226ccaacaaccgagttagagta 77805Ac 24atggattgcgagtatttgcg 9338Ac 227cacggcaatacctatcatct 80922Ac 25tacgcaaggcggactacaat 12520Ac 228cgttactttccaacacccag 84065Ac 26gacgcaacacgactacactg 15473Ac 229gcaaacgacgaccgcataat 87366Ac 27cggcatcaacgagccaactt 18365Ac 230ctgaatagcgatgctgatgc 90449Ac 28ctcctccgaaggtccgtcta 21327Ac 231gcttactgtgcctgtatcaa 93342Ac 29ccagttcaacaatccctctt 24462Ac 232ttgcgagaccgtcaacataa 96487Ac 210ctccgtctggatttactgcc 27451Ac 233ctcggtgttcccgtatcgtc 99366Ac 211cgatgacctcgtggtatgga 30866Ac 234caagggcaacaaatagacgc 102229Ac 212gagaatagccgtcgccacaa 33991Ac 235gcatcaatctcccaagcaaa 105343Ac 213ccaccactaccaacaacaac 36884Ac 236cccttctttgtagatgctgt 108545Ac 214acccttcttggaacacgaca 39922Ac 237agactcgttacccgacttga 111566Ac 215aatctgccgtccagcataaa 42864Ac 238tccgagacataccacaaagc 114765Ac 216gcagaaagcgatagtgaaag 45756Ac 239tggctcataactaaactcgc 117940Ac 217agcctgctgtcgtgaatacc 48985Ac 240gcggcacataataatcgtcg 120913Ac 218aaccgctgtcgtaatcttgg 52227Ac 241cgcaagatgatggctttcct 124001Ac 219tgacgcacaacatcaactac 55542Ac 242gttcgccattagggcagtat 127099Ac 220cggctcaccgctactttctc 58834Ac 243aaaactgccgtcgtcaatac 130185Ac 221cgtttagggattctatggtg 62188Ac 244gaacggagcgtgattagtgt 133066Ac 222tcgtcgtgttgtcatagccc 65122Mod 2down acgactacgcactagccaaca NA Ac 223cgacctttccacctatcacg68114Mod 2uptcggcatggacgagctgtacNA图3 PCR 检测病毒突变株中的hsp70启动子Fig.3 PCR detection of the hs p70promoter in the mutant virus 1.DNA 分子质量标准(λDNA Hi n d Ⅲ/Eco R Ⅰ);2.B9F 突变病毒株DNA 为模板;3.Li6A 突变病毒株DNA 为模板;4.野生型AcMNPV DNA 为模板.2.2 AcMNPV 突变体库的构建PCR 扩增pMod 2hsp70p 2gfp 中转座子序列,得1.4kb 的线性化片断.将病毒基因组DNA 和该转座子片段混合,在EZ ∶∶TN 转座酶的催化下,进行体外转座.转座反应液直接用于转染Sf21细胞.一天后在荧光显微镜下观察到绿色荧光.由此得到随机插入突变病毒库.对原代病毒液进行效价测定,达2×106pfu/mL ,其中产生绿色荧光的约占20%.将该原代病毒再次感染Sf21细胞,仍然观察到细胞发出荧光,证明转座子已经成功插入病毒基因组.2.3 突变病毒株的纯化空斑试验和多孔板稀释法从突变病毒库中分离得到了2株突变病毒株,分别为B9F 和Li6A.抽提病毒基因组DNA ,并以之为模板,用扩增hsp70启动子的引物进行PCR 检测,可以从突变病毒株的DNA 中扩增得到hsp70启动子片断,以野生型病毒DNA 为模板则不能得到该片断(图3).证明突变病毒株中带有插入的转座子.2.4 转座子插入位点的确定沿AcMN PV 基因组顺时针方向每隔3kb 左右设计1个寡聚核苷酸(Ac12Ac44,表1),分别以它们和根据转座子内部序列设计的寡聚核苷酸Mod 2up 和Mod 2down 作为引物,以突变病毒株的基因组DNA 为模板进行PCR ,对阳性的PCR 产物进行序列分析,从而确定了两株病毒中转座子的插入位点,结果如图4所示.这两个突变05 复旦学报(自然科学版)第44卷 株中,转座子分别插入并破坏了AcMN PV 的94K 基因和p10基因.B9F 突变株中,转座子插入位点位于94K 基因编码区,置换了基因组中114585至115089bp 之间的区域(图4A ),而Li6A 突变株中,转座子的插入位点位于AcMN PV 的p10基因编码区的119057bp 位点(图4B ).表明这两个基因都是病毒在体外细胞中复制非必需的位点.图4 B9F 和Li6A 突变株转座子插入位点示意图Fig.4 Transposon insertion sites of the mutant AcMNPV B9F and Li6A3 讨 论杆状病毒基因组学和基因功能的研究已经取得了很大的进展,对数十种病毒的基因组进行了全序列的分析,对其中的相当部分基因,特别是对于那些在病毒感染和复制中具有关键作用的基因进行了转录表达和功能的分析9.但由于杆状病毒的基因组庞大,其中一半左右的病毒基因的功能尚未有深入研究.获得大量的突变体病毒是研究病毒基因功能的重要途径之一.随机位点插入转座子在帮助人们分离大量基因功能破坏的突变方面发挥了重要的作用,已经被用在研究一些微生物乃至高等生物的基因组中10～13.杆状病毒的基因组是双链DNA ,具有感染性,DNA 转染细胞后就能开始复制,产生子代病毒.因此,杆状病毒非常适合用体外随机转座的方法获得大量的突变病毒,但目前国内外尚未有这方面研究的报道.本研究利用转座子的方法获得了一个随机突变AcMN PV 库,初步从中分离了两个突变病毒株,B9F 和Li6A ,确定了这两个病毒分离株中转座子插入位点分别为病毒的94K 基因和p10基因.AcMN PV 94K 基因是一种早期表达的基因,其基因功能还不清楚,对病毒感染细胞非必需14.p10基因则是一个在病毒感染极晚期高水平表达的基因,与病毒感染的细胞中纤维状结构有关,但对于病毒在体外培养细胞中的感染与复制也是非必需的15.这表明可以利用该方法确定病毒的非必需基因.由于破坏必需基因功能的突变会导致无法获得纯的突变株,因此尚不能以本文报道的方法进行研究,需要设计其他的研究手段,如通过改变培养条件,增加异源辅助病毒共同感染,或借助病毒全基因组的BAC (细菌人工染色体)克隆先在细菌中获得必需基因突变的病毒基因组的方法.这些研究还在进行中.利用转座子随机突变技术研究杆状病毒基因功能的工作可以帮助我们更加深入的认识病毒复制的机制,认识病毒与细胞及宿主昆虫之间的相互作用,从而为更好地利用这一病毒提供理论基础.如何更加高效地获得病毒分离株,并确定转座子的插入位点,还需要通过进一步的研究加以解决.参考文献:1 Possee R D.Baculoviruses as ex pression 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transposon into the virus genome.The transposed genome was then used to transfect insect cells S f21,and a library of mutant viruses capaple of ex 2pressing green fluorescence protein was obtained.Two mutant viruses ,B9F and Li6A ,was isolated ,and the transposon in 2sertion sites was determined within the coding region of 94K gene and p10gene ,respectively.This technology will be very useful in the functional genomics study of baculoviruses.K eyw ords :AcMNPV ;Tn5transposon ;transposase ;mutant205 复旦学报(自然科学版)第44卷 。
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转座子建库流程及原理-概述说明以及解释1.引言1.1 概述转座子建库是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因组学研究、进化生物学和遗传工程等领域。
通过转座子建库可以快速准确地获取目标DNA序列，并在进一步的研究中发挥重要作用。
转座子是一类能够在基因组中移动和复制的DNA序列，在生物进化过程中起到了重要的作用。
由于转座子的广泛存在和多样性，利用转座子进行建库研究能够有效地捕获和分析基因组中的各种变异和多样性。
转座子建库主要分为两个步骤：设计引物和提取目标DNA。
设计引物是为了选择特定的转座子元件，以便将目标DNA序列与转座子连接起来。
提取目标DNA是为了获取感兴趣的DNA序列，通常采用PCR等技术进行扩增。
转座子建库的原理是基于转座子的特性和作用机制。
转座子能够通过酶的作用在基因组中移动和复制，从而改变基因组结构和功能。
转座子的结构和特点对其移动和复制的方式产生了重要影响，这也是利用转座子进行建库研究的基础。
总结而言，转座子建库是一种重要的技术手段，能够帮助我们深入了解基因组的组成和功能。
通过设计合适的引物和提取目标DNA，我们可以获取到感兴趣的DNA序列，并通过分析转座子的移动和复制机制，揭示转座子在基因组中的作用和影响。
未来的研究方向包括进一步完善转座子建库技术和深入探究转座子的作用机制，以更好地应用于基因组学研究和生物技术开发中。
1.2文章结构文章结构部分的内容可以是以下内容：文章结构部分：本文将围绕转座子建库流程及原理展开讨论，主要分为以下几个部分：引言、正文和结论。
引言部分将对文章的主题进行一个概述，简要介绍转座子建库的相关背景和意义。
接着，将介绍文章的整体结构，明确各个章节的内容和目标。
最后，阐明本文的目的，即期望通过对转座子建库流程和原理的研究，推动相关领域的发展。
正文部分是本文的核心，将重点详细介绍转座子建库流程和原理。
首先，将详解转座子建库流程的各个步骤，包括设计引物和提取目标DNA。
单碱基突变细胞株构建一、突变基因识别首先，需要通过基因测序或其他分子生物学技术识别和确定发生突变的基因。
这些技术可以检测出单碱基变异（SNV）等基因突变，并确定其在基因组中的位置。
二、突变细胞株筛选在识别出突变基因后，需要从细胞库中筛选出相应的细胞株。
这些细胞株可以是诱导多能干细胞（iPSC）或其他类型的细胞。
通过PCR或测序技术对候选细胞株进行筛选，确保它们包含特定的突变。
三、突变基因克隆为了在细胞株中引入突变，需要克隆突变基因。
这一步骤通常涉及PCR扩增和克隆到载体中，以便在后续步骤中进行基因转移。
四、突变基因整合将克隆的突变基因通过转基因技术整合到细胞株中。
常用的技术包括基因枪、电穿孔或化学转染等。
在整合过程中，需要确保突变基因正确插入细胞的基因组中。
五、细胞株筛选与验证通过分子生物学技术，如PCR和测序，对经过基因整合的细胞株进行筛选和验证。
确保突变基因已成功整合到细胞基因组中，并且表达水平与野生型相似。
六、功能分析对构建成功的单碱基突变细胞株进行功能分析。
比较突变细胞株与野生型细胞株在生物学特性、表型等方面的差异。
这些分析有助于了解突变对细胞功能的影响。
七、药物筛选利用构建的单碱基突变细胞株进行药物筛选。
观察药物对突变细胞株和野生型细胞株的作用差异，寻找可能针对该突变的有效药物或治疗策略。
八、临床前研究最后，进行临床前研究，以评估单碱基突变细胞株在动物模型中的表现和潜在的治疗效果。
这些研究有助于为将来的临床试验提供依据，并评估该方法在药物研发中的潜在应用价值。
转座酶法建库产品-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：转座酶法建库产品是一种用于构建基因组文库的技术方法，它利用转座酶（也称为跳跃基因或跳跃酶）的能力，将外源DNA片段插入到宿主基因组中的特定位点。
这种方法在基因组编辑、基因定位和功能研究等领域具有重要的应用价值。
通过转座酶法建库产品，研究人员可以快速高效地构建包含目标基因组片段的文库，为基因组研究提供了强大的工具。
本文将介绍转座酶的作用机制、建库产品的制备方法以及其在不同领域的应用情况，希望能够为读者提供全面的了解和参考。
1.2 文章结构文章结构部分主要介绍了本文的整体框架和内容安排。
文章分为引言、正文和结论三个部分。
1. 引言部分主要从概述、文章结构和目的三个方面介绍了本文的主题和目的。
概述部分简要介绍了转座酶法建库产品的概念和重要性，引起读者的兴趣。
文章结构部分则说明了文章的整体构架，包括引言、正文和结论三个部分，为读者提供了对文章内容的整体把握。
目的部分则明确了本文的写作目的和意义，指导读者对文章的阅读有一个明确的方向。
2. 正文部分主要介绍了转座酶的作用、建库产品的制备方法和应用领域三个方面。
转座酶的作用部分详细介绍了转座酶在基因组建库中的作用机制和重要性。
建库产品的制备方法部分则系统介绍了转座酶法建库产品的制备步骤和技术要点。
应用领域部分则展示了转座酶法建库产品在生物科学领域的应用前景和重要性。
3. 结论部分对本文的内容进行了总结和展望。
总结部分概括了本文的主要内容和结论，提炼出本文的核心观点。
展望部分则展望了转座酶法建库产品在未来的发展前景和应用潜力，为读者展示了这一领域的发展方向。
通过以上文章结构部分的介绍，读者可以清晰地了解到本文的内容安排和阅读路径，帮助他们更好地理解和把握全文的主题和要点。
1.3 目的目的部分的内容应该是对本文的写作目的进行说明，可以写成如下形式：在本文中，我们将探讨转座酶法建库产品的制备方法以及其在不同领域中的应用。
细菌突变体构建
细菌突变体构建是一种常用的研究手段，可以用于研究基因的功能、寻找新的药物靶点、优化细菌的生物活性等方面。
下面是细菌突变体构建的八个步骤：
1.基因组测序和基因定位
首先需要对细菌基因组进行测序和定位，以便确定目标基因的位置和序列信息。
这可以通过基因组测序或染色体步移等方法实现。
2.确定突变的基因
在目标基因确定后，需要确定哪些基因是可能导致所需突变的。
这可以通过对比不同物种或不同品系的基因组序列差异来确定。
3.设计突变引物
根据目标基因的序列信息，设计突变引物。
突变引物应该包含目标基因的上游和下游序列，以确保可以准确地将突变基因插入到野生型基因中。
4.聚合酶链式反应（PCR）扩增突变基因
使用PCR技术将突变基因扩增出来，以便后续的杂交和转化操作。
5.将突变基因与野生型基因进行杂交
将突变基因与野生型基因进行杂交，以便将突变基因导入到细菌的染色体中。
这可以通过电转、接合等方法实现。
6.通过抗生素抗性筛选突变体
在导入突变基因后，需要通过抗生素抗性筛选等方法来筛选出具有所需突变的突变体。
这可以通过比较野生型和突变体对不同抗生素的抗性差异来实现。
7.验证突变体的表型和基因型
对筛选得到的突变体进行表型和基因型验证，以确保得到的突变体具有正确的突变。
这可以通过DNA测序、RT-PCR等方法实现。
8.评估突变体的生物活性
最后需要评估突变体的生物活性，以便了解突变对细菌生物活性的影响。
这可以通过比较野生型和突变体在生长速率、代谢产物产量等方面的差异来实现。
使用基因编辑工具进行基因转座的方法基因编辑工具是一种革命性的技术，可以精确地修改生物体的基因组。
其中一项强大的应用是基因转座，它能够将基因从一个位置移动到另一个位置。
本文将介绍使用基因编辑工具进行基因转座的方法。
在进行基因转座之前，首先要选择合适的基因编辑工具。
CRISPR/Cas9系统是目前最常用的工具，因为它具有高度灵活性和精确性。
另外，还有一些类似CRISPR的工具，如TALENs和ZFNs，也可以用于基因转座。
接下来，我们将介绍一种在植物中进行基因转座的方法。
首先，需要设计合适的转座子。
转座子是一段DNA序列，能够在宿主基因组中导致基因转座。
它包含两个重要的元素：转座酶序列和目标基因的导向序列。
转座酶是一种酶，能够识别并切割基因组中的特定序列。
常用的转座酶有dCas9和Transposase。
dCas9是一种无功能Cas9蛋白，它不能剪切DNA，但可以用于导向其他转座酶。
而Transposase是一种能够识别和切割转座子的酶。
目标基因的导向序列是转座子中负责识别并与宿主基因组中特定序列配对的部分。
这保证了转座子仅转座到目标基因组的特定位置。
在设计转座子时，需要遵循一些原则。
首先，转座子的长度应适中，一般为1000-4000碱基对。
太短的转座子可能导致非特异性转座，而太长的转座子则可能不容易在宿主基因组中引起转座反应。
其次，转座子的序列应与宿主基因组中的特定区域具有足够的异质性，以确保它能够选择性地与目标基因组配对。
一旦设计好了转座子，就可以使用基因编辑工具介导其转座到目标基因组中。
首先，需要将转座子导入到目标细胞中。
这可以通过基因转染或转化来实现。
转座子可以携带选择标记，如抗生素抗性基因，以便筛选成功转座的细胞。
接下来，需要产生转座反应。
这可以通过在目标细胞中表达转座酶来实现。
dCas9可以与其他转座酶复合形成CRISPR/dCas9-转座酶复合物，或者与Transposase复合形成CRISPR/dCas9-Transposase复合物。
用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌EDR4突变体库陈永轩;王娜娜;高小宁;秦虎强;黄丽丽;韩青梅【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2014(023)011【摘要】为筛选枯草芽孢杆菌EDR4拮抗相关基因,利用转座子TnYLB-1构建该菌株的插入突变体库.通过对种子液OD600值、转接培养液Ⅰ继续培养OD600值及转接培养液Ⅱ后的孵育时间3因素设计正交试验,转化过程中加入pMarA质粒的不同量及质粒与感受态细胞共培养的不同时间研究2因素对转化效率的影响,确定pMarA对EDR4的转化体系.通过50℃高温诱导培养产生EDR4的插入突变体,挑取单菌落2 756个,构建EDR4的插入突变体库,随机挑选14株突变体经PCR检测转座子TnYLB-1序列,发现转座子已成功插入到EDR4基因组中;进一步通过Southern杂交验证,发现转座子TnYLB-1主要以单拷贝形式随机插入,也有部分多拷贝插入.此突变体库的建立可为以后筛选该菌株拮抗相关基因等研究奠定基础.【总页数】7页(P123-129)【作者】陈永轩;王娜娜;高小宁;秦虎强;黄丽丽;韩青梅【作者单位】旱区作物逆境生物学国家重点实验室,西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S436.634【相关文献】1.枯草芽胞杆菌9407TnYLB-1转座子突变体库的构建 [J], 范海燕;汝津江;高坦坦;杨旸;王琦;李燕;2.枯草芽胞杆菌9407TnY LB-1转座子突变体库的构建 [J], 范海燕;汝津江;高坦坦;杨旸;王琦;李燕3.利用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌的突变体文库 [J], 马欣;刘俊;乔俊卿;伍辉军;高学文4.洋葱伯克霍尔德菌T1828和ZWL15-Tn5转座子插入突变体库的构建及相关突变体的筛选初探 [J], 刘好桔;钟义军;饶志强;葛岚;吴晓玉5.百脉根根瘤菌MAFF303099 Tn5转座子插入突变体库的构建及筛选 [J], 周向珍;朱辉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Tn5转座酶建库原理Tn5引爆极速建库和长片段之战近10年间，NGS（Next Generation Sequencing）技术高速发展，测序仪器不断更新迭代，形成规模化。
在测序模式产业化的大环境下，测序样本制备成为其中很重要的一环。
样本起始量要求过高、建库流程繁琐等都会限制NGS技术的应用。
科学家们一直在不断探索，试图突破此类限制，其中转座酶（Transposase）技术引入建库中就是很大的进步，不仅解决了上述问题，转座酶也在NGS上开发了多个技术应用，拓展了NGS的适用范围。
20世纪40年代，美国遗传学家芭芭拉.麦克林托克在玉米的研究中发现了转座子（Transposon），随后，她花了整整6年的时间来研究转座子的奥秘。
在50年代，当麦克林托克向世人公布她的发现时，学术界并没有多少人认可，但是真理是经得起时间检验的，随后的几十年间科学家们在生物界各个领域证实了转座子系统的广泛存在。
1983年，瑞典皇家科学院诺贝尔奖金评定委员会终于把该年度的生理学和医学奖授予这位81岁高龄的、不屈不挠的女科学家。
麦克林托克是在遗传学研究领域第一位独立获得诺贝尔奖的女科学家，她的名字将和转座基因一起被载入科学史册。
转座基因俗称跳跃基因，它的发现改变了人们对基因组序列稳定性的认识。
理论上的突破也带来了应用上的拓展，科学家们群策群力，将转座子系统开发成基因研究的各种工具，这又反过来促进了遗传学理论的研究。
转座子标签(transposon tagging)技术是研究功能基因的有效工具之一。
比如模式植物大多都有很好的突变体库，其中玉米的两个应用最为广泛的突变体库（uniformMu和Ac/Ds突变体库）就是利用转座子创建的。
转座子标签技术克隆基因的基本原理：转座子是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳到另一个位置。
当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型。
通过遗传分析可确定某基因的突变是否由转座子引起，由转座子引起的突变便可以转座子DNA为探针，从突变株的基因组文库中钓出含该转座子的DNA 片段，并获得含有部分突变株DNA序列的克隆，进而以该DNA为探针，筛选野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。
平板上的转座突变株机器自动挑蓖落・-————-----—-畸到38好L板上培养转到96孔板上・-—__—_____--—’进行P僳I转另一个板I山l转另一个板l山戬.gsT分析数据整理●÷————————————一●}--—---————-—一图1建立转座子突变株库的技术路线子在铜绿假单胞菌PA01基因组中的转座插入采样数不符合泊松分布,虽然如此,但毕竟在最终还是获得了一个近饱和的突变株库。
而Garsin(71等在构建粪肠球菌的Tn917转座插入突变株库时发现,测序的8865个Tn917转座突变株突变基因只对应了610个不同的开放阅读框,远远低于预期的2400个。
这些结果说明使用随机性差的转座子会大大增加建库的成本。
因此,有的研究利用了两种类型转座子构建突变株,这是为了防止一种转座子可能有的插入热区,而造成在基因组插入位点的随机性不佳,进而造成某些基因的突变株在筛选中漏选,而另一些基因的突变株则被多次重复筛选。
两种类型转座子的使用,可以互相弥补,降低发生漏选或者重复筛选的可能性。
例如在建立铜绿假单胞菌PAl4突变株库工作中,最开始采用的是Tn5来源的细菌转座子——hphoA。
如前所述,尽管Tn5来源的转座子插入随机性非常好,研究者还是发现了至少一个热区(Hot spot,即gacA基因,同样也存在一些冷区(Cold spots。
为了避免转座位点的选择性,研究者又采用了真核生物来源的mariner转座子,该转座子能够在很多原核生物中进行转座,而且预计与TnphoA在靶位偏嗜上存在差异,故联合使用可以降低转座选择性;②对突变基因测定方法采用随机引物PCR的方式,以达到自动化的目的。
确定突变株突变基因的方法有很多,如反向PCR等,但这些方法的最大问题是需要人工参与,无法实现完全自动化测序,从而使确定突变基因的工作几乎不可能完成。
而随机引物PCR的方法可以采用机器自动化79进行,使测序工作完全不需要人工的参与,达到省时省力的目的,从而使建库所耗时间和精力大大降低,可以由一个研究组完成而不需要大规模的协作。
图2随机引物PCR测序方法示意图依据以上的方法,目前已经建立了有铜绿假单胞菌PA01和PAl4两个突变株库。
除此之外,针对特定研究目的的某些小规模的突变株库也参考上述方法建立起来,例如Pobigaylo等根据上述方法用mini—Tn5转座子对Sinorhizobium meliloti建立了一个5000个左右的突变株库喁】63建立细菌突变株库的意义建立细菌突变株库的意义不言自明:第一,建立突变株库将大大促进建库细菌的研究。
对细菌基因功能的研究依赖于其突变株的构建,而其构建过程往往耗时耗力。
如果已经有一个完整突变株库的话,其他研究者就不需要作这个耗时耗力的工作了,他只需要将研究的靶基因告诉建库单位,该单位就利用转座子建立细菌单基因突变株库的策略和方法作者:丛延广, 胡福泉作者单位:解放军第三军医大学基础部微生物学教研室,重庆,400038 刊名:微生物学免疫学进展英文刊名:PROGRESS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY 年,卷(期:2008,36(2被引用次数:0次参考文献(8条1.Riley M Genes and proteins of Escherichia coli K-12 (GenProtEC 19972.Kobayashi K.Ehrlich SD.Albertini A Essential Bacillus subtilis genes 2003(083.Giaever G.Chu AM.Ni L Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome 20024.Ecoli genomic project5.Jacobs MA.Alwood A.Thaipisuttikul I Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa 2003(246.Liberati NT.Urbach JM.Miyata S An ordered,nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants 2006(087.Garsin DA.Urbach J.Huguet-Tapia JC Construction of an Enterococcus faecalis Tn917-mediated-gene-disruption library offers insight into Tn917 insertion patterns 2004(218.Pobigaylo N.Wetter D.Szymczak S Construction of a large signature-tagged Mini-Tn5 transposon library and its application to mutagenesis of Sinorhizobium meliloti 2006(06相似文献(10条1.学位论文毕志香Tn916诱变的嗜水气单胞菌突变株的特性分析及转座子插入位点的探讨2005嗜水气单胞菌(Ah是重要的水生病原菌,给水产养殖业造成极大的经济损失,同时还是重要的人畜共患病病原菌。
本文研究对象MJ-1即是采用转座子Tn916诱变技术获得的一株多个毒力因子同时缺失的突变株,将其连传20次后,Tn916仍稳定地存在于MJ-1的染色体上。
分析MJ-1的生物学特性,与亲本株相比,其胞外蛋白酶(酪蛋白酶和弹性蛋白酶、淀粉酶、DNA酶、溶血素和S层等几种主要毒力因子不表达;生化特性表明,MJ-1对部分糖的发酵能力丢失;外膜蛋白图谱、胞外产物图谱发生改变;对HEp-2细胞的粘附性小;对EPC细胞和小白鼠的毒力丢失。
MJ-1株同时缺失多种分泌性胞外毒力因子和细胞表面蛋白如S层等,提示嗜水气单胞菌J-1株中可能存在毒力岛。
为确定Tn916的插入位点,采用PCR技术扩增调控胞外蛋白酶分泌的转录调控蛋白(ahyR全长基因,结果未扩增得到,推测Tn916可能插入到ahyR基因中。
进一步采用插入诱变技术构建ahyR基因的突变株以验证Tn916是否插入ahyR基因中。
根据GenBank公布的嗜水气单胞菌转录调控蛋白ahyR基因的序列设计一对特异性引物,利用PCR方法扩增AhJ-1株ahyR基因的部分片段(656bp。
PCR产物克隆入pMD18-T载体,经序列测定后定向连接入含有卡那霉素抗性(Kmr基因的自杀性质粒pJP5603中,构建重组质粒pJP-ahyR。
将鉴定为阳性的重组质粒转化AhJ-1株感受态细胞,获得一突变株细菌。
PCR方法鉴定该突变株为J-1株ahyR基因的同源重组突变株,命名为J-1△ahyR。
同时研究了其主要生物学特性。
采用MJ-1株作为弱毒活疫苗免疫剑尾鱼。
将剑尾鱼分成4组,免疫组每尾腹腔注射菌数分别为107CFU、105CFU、103CFU,对照组注射0.1mL无菌PBS,30d 后采血测血清凝集抗体效价以及血液中白细胞的吞噬活性,而后用20LD50的Ah强毒株J-1株腹腔注射攻击。
每尾注射107CFU组的凝集抗体效价、白细胞的吞噬活性和相对保护力等都比其他免疫组高。
试验结果表明弱毒株MJ-1具有很好的免疫原性并对剑尾鱼具有一定的保护力。
该研究为嗜水气单胞菌弱毒疫苗的研制奠定了基础。
2.学位论文邓平深红红螺菌高产氢突变株的筛选及转座子插入位点分析2008能源危机席卷全球,寻找替代能源势在必行。
氢能以其来源丰富、重量轻、贮能高、燃烧产物是水等优点成为备受关注的新型能源。
光合细菌(photosynthetic bacteria,PSB是一类能进行光合作用并产生氢气的细菌,深红红螺菌(Rhodospirilum rubrum属于兼性厌氧菌,是光合细菌的模式菌株,具有非常重要的研究价值。
此外,光合细菌还能分解多种有机物。
光能利用,产氢和处理有机废物、废水结合于一体的特性,使光合细菌显示出了巨大的研究价值。
转座子作为遗传学研究的重要工具,能够插入基因组中造成插入突变。
利用转座子进行菌株诱变,能够得到较稳定的突变株。
并且通过一定的方法,获得侧翼序列,将有利于在分子水平上对产氢机制进行深入的探讨。
二氯化钯(PdCl2溶液能与氢气等还原性气体发生反应而析出黑色的金属钯。
本研究据此设计了一种快速筛选高产氢光合细菌突变株的方法。
即在96孔深孔培养板中培养光合细菌并使其产氢,用浸润PdCl2的脱脂棉片封盖,以观察对应孔的棉片颜色变化程度来筛选高产氢的突变株。
本研究利用转座子构建了光合细菌Tn5随机插入突变库,并应用此法在其中进行了筛选,对选出的高产氢突变株进行发酵,用气相色谱检测其产氢情况,结果发现两种方法得出的结论并不一致,对此情况进行了讨论,提出了改进的方法,为快速筛选高产氢菌株方法的建立打下了坚实的基础。
本研究中,筛选得到一株高产氢菌株R.rubrum RM4。
在持续光照条件下,产氢量是出发菌株的1.89倍。
利用转座子上携带复制起始点的特点,将高产氢突变株基因组用BamH I进行消化、自连接、转化到大肠杆菌中,并利用转座子引物进行测序,从而得到转座子侧翼序列。
经比对,发现转座子插入破坏的基因为丙二酰-CoA脱羧酶(Malonyl-CoAdecarboxylase。
目前,并没有相关文献说明此酶与光合细菌产氢有联系,所以很可能存在其他突变位点。
3.期刊论文董洪燕.张小荣.潘志明.彭大新.刘秀梵.Hongyan Dong.Xiaorong Zhang.Zhiming Pan.Daxin Peng. Xiufan Liu转座子随机插入鉴定肠炎沙门氏菌生物膜形成相关基因-微生物学报2008,48(7[目的]生物膜在沙门氏菌的致病性和引起沙门氏菌食物中毒等方面起着重要作用,本研究为了鉴定影响沙门氏菌生物膜形成的基因.[方法]利用结晶紫染色定量法对74株鸡源的肠炎、鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌进行生物膜测定,选择生物膜生长较好的肠炎沙门氏菌C050041,采用转座子随机插入法构建突变株库.[结果]84%的鸡源沙门氏菌菌株可在塑料表面形成生物膜;通过转座子插入获得1924个突变株,筛选的生物膜降低突变株经生长曲线测定、测序和序列比对及Southern blot分析鉴定出15个插入基因,它们分别为metE、ompR、rpoS、,和G、rfaJ、rfaK、rfaP、rfbH、rhlE、spiA、steB、tpx、ybdN和2个未知功能的基因.[结论]我们鉴定出了多个影响生物膜形成的新基因,这些基因的发现为进一步研究沙门氏菌生物膜形成的调控机制,研制减毒沙门氏菌疫苗奠定了基础.4.学位论文谢春娅甘油利用型深红红螺菌突变株筛选及突变基因性质分析2009目前能源紧张,许多国家为了减少对非可再生资源石油等的依赖性,正在积极寻找新的替代能源。
