柱层析法制备高纯人血FIX研究初探_蔡骏

格式：pdf
大小：169.62 KB
文档页数：3

下载文档原格式

一步柱层析纯化血浆分离多种血液制品组分

ＭｅｔｈｏｄｓＳｏｕｒｃｅｐｌａｓｍａｗａｓｌｏａｄｅｄｏｎｔｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｌｕｍｎａｔａｃｏｎｓｔａｎｔｌｆｏｗｒａｔｅｕｓｉｎｇａｇａｍｓｅ（ｔｕｎｇｓｔｅｎｃａｒｂｉｄｅ）－
ＬＡＷｅｎ－ｊｕｎ，ＷＡＮＧＹａｈ，ＺＨＯＵＪｉｎｇ，ＬＩＮＸｉａｏ・ｆａ，ＺＨＡＮＧＬｉ－ｊｕｎ
ＳｃｈｏｏｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｈｅｎｚｈｅｎＰｌｏｙｔｅｃｈｎｉｅ，
期短、成本低、可去除病毒等优势，其有望成为传统低温乙醇工艺的有效替代技术，应用于工业化生产。
关键词：人血浆；柱层析；扩张床吸附中图分类号：Ｒ５５２Ｒ３９２．３３文献标识码：Ａ文章编号：１００４ — ５５０３（２０１５）０２．０１９４ — ０５
Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０５５，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＺＨＡＮＧＬｉ￣ｕｎ。Ｅ — ｍａｉｌ：ｃ７ｚＯ＇＠ｓｚｐｔ．ｅｄｕ．ｃｎ

凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白

凝胶层析（分子筛）利用凝胶颗粒形成具有三维空间多孔性网络结构的物质，不带电荷，可起滤过或“筛”的作用。
亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力的层析技术。
层析法分类
按层析过程的机理分类：
层析法分类
按两相所处的状态分类：流动相有两种状态：液体作为流动相气体作为流动相固定相也有两种状态：固体吸附剂作为固定相以吸附在固体上的液体作为固定相按两相所处的状态分为：液相层析和气相层析
凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）
外水体积（V0）
内水体积（Vi）
基质体积（Vg）
柱床体积（Vt）
当分子的Kd＝0时，Ve＝Vo即该分子被完全排阻于凝胶颗粒之外，全部分布于流动相里，固定相里分布为零（A)；当分子的Kd＝1时，Ve＝Vo+Vi即该分子完全不被排阻，均匀的分布在流动相和固定相里，两相比值为1(C)；当0 < Kd <1时， Ve = Vo + Kd*Vi即表明分子受到部分排阻(B)。
层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
01
03
02
层析的两种相
亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。缺点是针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件限制了其使用。
亲和层析法
亲和层析示意图
离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化。
离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。

高纯度人血红蛋白及高特异性抗人血红蛋白单克隆抗体的制备

是在与其药效相关的基础上进行识别的，能够反映出当归四逆汤的药效，为以后进行 “ 活性指纹图谱 ” 研究，评价中药质量提供科学依据。
油抗肿瘤活性成分辨识研究［Ｊ］．分析化学研究报告，
临床杂志，２００８，２０（５）：５３８ — ５４０．

［８］蒋建兰，丁洪涛，苏
鑫，等．基于组效关系的姜黄挥发
中药质量控制方法是用其含量较高的成分来控制该中药的质量，未能反映出中药的药效，该实验识别出的６个化合物
２８２９．
中的应用［Ｊ］．中国药理学通报，２０１３，２９（２）：１６１ — １６５．
［２］赵欣，谷艳，宋欣鑫，等．ＨＰＬＣ法同时测定当归四逆汤中４种有效成分的含量ＥＪ］．沈阳药科大学学报，
高纯度人血红蛋白及高特异性抗人血红蛋白单克隆抗体的制备
孙菁李珏燕陈智平 △ 张成林蔡豪斌
南宁５３００９１）
（广西医科大学公共卫生学院
摘要目的：获得高纯度的人血红蛋白（Ｈｂ）抗原，并用其免疫小鼠，筛选获得高特异性抗人血红蛋白单克隆抗体（ｍＡｂ — Ｈｂ），为建立高灵敏度、高特异性人粪便潜血免疫检测法提供关键试剂。方法：选择ＣＭ— ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（ＣＭ５０）阳离子柱进行分离纯化获得高纯度Ｈｂ，进而用其免疫小鼠，经融合制备获得了１１株可特异性分泌ｍＡｂ — Ｈｂ的杂交瘤细胞。获得的１１株ｍＡｂ－Ｈｂ用双抗夹心方法竞争配对，及与其他实验动物Ｈｂ进行交叉反应来筛选检测ｍＡｂ — Ｈｂ的特异性。结果：获得的１１株

实验6-血红蛋白凝胶柱层析 (恢复)

3 血红蛋白样品制备取1ml抗凝血于小烧杯中，加入10ml 20 mmol/L、pH7.0 的磷酸缓冲液，再加入固体铁氰化钾，使浓度达到5mg/mL（全班共享）。 4 层析柱还原层的形成吸管取1ml 40mM FeSO4于小烧杯中，加入1mL 0.2 mmol/L Na2HPO4-1ml80mmol/L Na2H2EDTA 混合液搅拌均匀。控制层析柱上缓冲液几乎完全进入凝胶时，止体。速取该混合液0.5ml，小心加入层析柱中，控制流速，使混合液缓缓进入柱床，至完全；加入0.5ml缓冲液，同法操作。
5 上样待柱中的磷酸缓冲液进入柱床后，止流，加入前面配制好的血红蛋白样品0.5ml，打开液流使样品溶液完全流入柱内。
6 洗脱滴管小心加入磷酸缓冲液进行洗脱，控制液面约 4cm高度，拧紧上柱盖，进液管臵缓冲液瓶中。控制调整流速，观察记录色带产生与变化，用洁净玻璃试管分别收集红色和黄色流出液，备用。 7 清洗待所有色带流出层析柱，继续用缓冲液清洗层析柱2min.用磷酸缓冲液混悬，回收凝胶。
实验6 血红蛋白凝胶柱层析
实验目的
1.学习蛋白质大分子的分离纯化原理和方法 2.学习凝胶柱层析的操作技术
实验原理
生物实验中经对不同生物大分子进行分离纯化，以便对他们作进一步的研究。对生物大分子进行分离纯化的基本原理主要是利用它们之间各种理化性质的差异，如：利用分子表面荷电状态的不同发展成熟的电泳技术；根据不同分子对介质吸附性不同而建立的吸附层析，疏水层析等技术；利用生物大分子特异亲和的特性建立亲和层析技术及生物芯片检测技术。

蛋白质鉴定 1.双缩脲显色: 试管中加入待试液10滴,加入双缩脲试剂2滴，观察颜色变化. 2.沉淀反应: 蛋白质溶液1mL, 加10%醋酸2滴，加饱和苦味酸7滴，观察现象。蛋白质溶液产生沉淀。

山东大学生命学院生化试验报告--柱层析分离色素

姓名俞华军系年级09生科3班组别同组者朴薇科目生物化学实验题目柱层析分离色素学号200900140157【实验目的】1、了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。

2、熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。

【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a, 叶绿素b,胡萝卜素和叶黄素组成。

利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用丙酮、甲醇、乙醇等提取。

分离色素的方法有很多，可以用纸层析、薄膜层析、柱层析等。

层析分为固定相和流动相两部分，当流动相从固定相上流过时，由于混合物中各成分在两相间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的混合物得到分离。

分离提纯是研究化学物质的前提，而层析是一种很好的分离提纯方法。

层析的原理是混合物在层析系统中的分配系数不同而达到分离提纯的目的。

本实验采用的是比较简单的柱层析，柱层析法分离的色素顺序应该为色素下移循序：黄色（胡萝卜素）——蓝绿（叶绿素a）——黄绿色（叶黄素）——绿色（叶绿素 b）。

【实验材料】一.试剂1.无水乙醇或95%乙醇2.三氧化二铝3.石英砂4.饱和氯化钠溶液5.丙酮6.无水硫酸钠7.石油醚（60-90℃） 8.洗脱掖：丙酮：石油醚＝1：9二．样品菠菜、辣椒等三．器材层析柱（１×３０厘米），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平【实验步骤】1．色素的提取：20克菠菜，加少许石英砂，再加30毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中，分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用。

2．样品的浓缩：将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体12毫升左右，以备加样使用。

3．层析柱的制备：15克碱性三氧化二铝加入30毫升石油醚搅拌，浸泡10min.。

在层析柱内加入一团棉花在底部，再加入石英砂0.5cm以上，然后用石油醚半充满柱子，再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醚，直到装完。

柱前衍生化法同时测定人凝血因子Ⅷ中甘氨酸和盐酸赖氨酸的含量

362药学实践杂志2018年7月25日第36卷第4期Journal of Pharmaceutical Practice ,Vol .36 , No .4 , July 25 ,2018•研究报告•柱前衍生化法同时测定人凝血因子1中甘氨酸和盐酸赖氨酸的含量士姚佳佳，闫晨（上海新兴医药股份有限公司，上海200135)[摘要]目的建立一种柱前衍生-高效液相色谱法同时测定人凝血因子观中2种氨基酸含量的方法。

方法以2,4-二硝基氟苯(D N F B)为衍生剂，采用Ci8色谱柱，流动相A为水，B为乙腈，C为含4 m m ol/L三乙胺的0 .05 m o l/L醋酸钠缓冲液 (p H=6.4)，进行梯度洗脱，流速1.0 m l/m in，检测波长360 nm。

结果甘氨酸的线性范围为2.98〜14.90 g/L( r= 0 .999 9 )，盐酸赖氨酸线性范围为1.195〜5.975 g/L(r= 0 .999 9)，甘氨酸和盐酸赖氨酸的平均回收率分别为99.1%和 98 .2%。

结论此方法检测结果准确，可用于人凝血因子1中甘氨酸和盐酸赖氨酸的含量测定。

[关键词]甘氨酸;盐酸赖氨酸;人凝血因子1;柱前衍生化;高效液相色谱[中图分类号]R917 [文献标志码] A [文章编号]1006-0111(2018)04-0362-04[D O I] 10 .3969 /j .issn .1006-0111.2018 .04 .017Glycine and lysis hydrochloride assay in human coagulation factor M by pre column derivationYAO Jiajia ,YAN Chen (Shanghai Xinxing Medicine Co L td,Shanghai 200135 ,China)[Abstract]Objective T o establish a method of analysis for glycine and lysis hydrochloride in h u m a n coagulation factor M by pre-column derivation H P L C.Methods T h e sample wa s derivatized with 2,4-dinitrofluorobenzene(DNFB).H P L C was performed on a C18column with gradient elution.T h e mobile phase A wa s water,B was acetonitrile and C wa s 0 .05m o l/L sodium acetate buffer containing 4 m m o l/L trimethylamine.T h e flow rate was 1.0ml/min and detection wavelength wa s 360n m. Result There wa s a linear range for glycine between 2.980 g/L〜14 .90g/L (r—0.999 9)and lysis hydrochloride between 1.195 g/L〜5.975g/L (r=0 .999 9) .T h e average recovery rate of glycine and lysis hydrochloride was 99 .1%and 98 .2% . Conclusion T h e established method i s accurate and can be used to determine the contents of glycine and lysis hydrochloride in h u m a n coagulation factor 观.[K e y words]glycine，lysis hydrochloride，h u m a n coagulation factor 观，pre-column derivation，H P L C人凝血因子1[1]是由健康人的血浆经分离、提纯，并经病毒去除和灭活处理的冻干制剂。

一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方法[发明专利]

专利名称：一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方法专利类型：发明专利
发明人：刘良明,刘建仓,胥婷,李涛,李东红
申请号：CN200810069572.X
申请日：20080422
公开号：CN101289493A
公开日：
20081022
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方法，在2～6℃条件下依次进行如下操作：首先用抗凝猪全血制备得压积红细胞；用低渗溶液溶解压积红细胞并通入惰性气体，加入抗氧化剂并调节溶液pH值，加入保护剂和抑菌药物，高速离心后得粗制血红蛋白溶液；往粗制血红蛋白溶液中加入甲苯，低温下萃取后取下层血红蛋白溶液进行透析；透析后的血红蛋白溶液冷冻干燥后再溶解成高浓度小体积的液体并上样于葡聚糖凝胶层析柱纯化，收取分子量均一的高纯度血红蛋白经过滤除菌去热原，然后冷冻真空干燥，得高纯度无基质无热源的血红蛋白干粉。

用本发明方法得到的血红蛋白无基质无热源，能安全有效地进行进一步修饰以制造血液代用品，操作简便，成本低廉。

申请人：中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所
地址：400042 重庆市渝中区大坪长江支路10号
国籍：CN
代理机构：重庆中之信知识产权代理事务所
代理人：张景根
更多信息请下载全文后查看。

固定化铜离子亲和膜层析柱的制备及其吸附血红蛋白的研究

・ !#&・
色
谱
第 !" 卷
!" 实验部分
! ! !" 仪器与试剂 ! ! ""# 型电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公 $"#%!# 型酸度计（上海伟业仪器司医疗设备厂）、厂）、 &’( )*%!$$$ 型紫外 % 可见分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司）。纤维素分析滤纸（杭州新华造纸厂），亚氨基二乙酸（化学纯，湖州市生物化学厂），牛血红蛋白（上海伯奥生物科技有限公司），其他试剂均为国产分析纯。 ! ! #" 固定化铜离子亲和膜色谱柱的制备 ! ! 固定化铜离子亲和膜的制备方法参见文献。将制得的膜裁成直径为 !# ++ 的圆片，取# ［ %& ］张（总质量为 $ , &"! ’ - ）装入自制的相同内径的柱管，即制得固定化铜离子亲和膜色谱柱。 ! ! $" 亲和膜色谱柱吸附血红蛋白试验 ! ! 使用前先用 # +. 磷酸氢二钠 % 柠檬酸缓冲溶液（ $" ( ）平衡柱。室温下将 ! +. 血红蛋白溶液（用生理盐水配制）注入柱中，用 %$ +. 磷酸氢二钠 % 柠檬酸缓冲溶液（ $" ( ）淋洗柱，收集洗液，用分光光度法测定 )$# /+ 波长下的吸光值。 ! ! 亲和膜色谱柱吸附 "0 的吸附率按下式计算：吸附率 1 上样量（ +- ）2 洗液中的量（ +- ） 3 %$$ 4 上样量（ +- ）
#" 结果与讨论

人血白蛋白生产及其应用研究进展

人血白蛋白生产及其应用研究进展王鸣宇;王斐;臧恒昌;张惠【摘要】人血白蛋白是临床上一种特殊的急救药品，本综述介绍了人血白蛋白的生产以及在医药领域中的应用，展望了人血白蛋白的应用前景及发展趋势，以期为国内相关产品的开发和应用提供思路。

%Human albumin is a special clinical rescue medication. This review introduced the production of human al-bumin and its application as medicine. In addition,it also looked ahead at the prospects and trends of human albumin,ex-pecting to provide ideas for the development and application of domestic related products.【期刊名称】《药学研究》【年(卷),期】2014(000)010【总页数】3页(P600-602)【关键词】人血白蛋白;生产;应用【作者】王鸣宇;王斐;臧恒昌;张惠【作者单位】山东大学药学院，山东济南 250012; 山东泰邦生物制品有限公司，山东泰安 271000;山东大学药学院，山东济南 250012;山东大学药学院，山东济南 250012;北京凯元盛世科技发展有限责任公司，山东济南 250012【正文语种】中文【中图分类】R977.6人血白蛋白（human albumin）是最早从人血浆中提取并大规模生产应用的血液制品，在临床上有着重要的应用价值［1］。

自20世纪40年代进入临床使用，人血白蛋白一直有“救命药”之称，成为一种特殊的临床急救药品。

但由于原料的限制和临床上不合理的使用，目前市场上人血白蛋白价格高昂，供不应求。

因此，本文将人血白蛋白的生产工艺以及临床应用进行总结，以期为研究者及生产厂家提供理论参考。

柱层析分离红曲色素及其组分的抑菌性对比_徐伟

柱层析分离红曲色素及其组分的抑菌性对比*徐伟，范志诚，马思慧（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨，150076）摘要:实验采用了硅胶柱层析方法，对红曲色素中包含的红曲红、红曲橙、红曲黄三种组分进行分离条件研究，结果表明：应使用梯度洗脱的方法对红曲色素三种组分进行分离，正己烷∶乙酸乙酯混合液（体积比5∶1）为黄色组分洗脱剂；乙酸乙酯为橙色组分洗脱剂；乙酸乙酯∶甲醇混合液（体积比5∶1）为红色组分洗脱剂；当分离条件为：红曲色素上样量2mL ，洗脱剂流速3mL/min 时，分离效果最好。

并分别进行三种分离组分对大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的抑菌性试验，得到橙色组分对其两种菌的抑菌性最强。

关键词：红曲色素；硅胶柱层析；分离组分；抑菌性中图分类号：TS201.3;O652.6;TQ925.7;TS201.3文献标识码：BSeparation of Monascus Pigments by Column Chromatography andInhibition Comparison of Isolated ComponentsXU wei ，FAN Zhi-cheng ，MA Si-hui(Department of foodtuff Engineering,Harhin university of Commerce ，Heilongjiang ，Harhin 150076，China)Abstract:In this study,silica gel column chromatography was used to separate red pigments,orange pigments and yellow pigments ,the three components of monascus pigments.And the separating conditions were researched and determined.The results showed that separating the three components of pigment components should make use of gradient elution method.The mixture of n-hexane and ethylacetate (volume ratio of 5:1)for isolating yellow components,ethylacetate for isolating orange components and the mixture of ethylacetate and methanol (volume ratio of 5:1)for isolating red components.The best sample was 2mL,the best elution agents velocity was 3mL/min.And then comparing the antibacterial activity of three components separated from pigment to E.coli and Bacillus subtilis.The results showed that the antibacterial activity orange components is strongest in the three components.Key words:monascus pigment ；silica gel column chromatography ；comparison ；antibacterial activity*基金项目：黑龙江重大科技攻关项目，项目编号：GA07B401-3收稿日期：2010-09-18作者简介：徐伟（1963-），女，汉族，黑龙江哈尔滨人，副教授，博士。

512_柱前衍生高效液相色谱法测定人血浆中白消安浓度白消安浓度

512_柱前衍生高效液相色谱法测定人血浆中白消安浓度白消安浓度柱前衍生高效液相色谱法测定人血浆中白消安浓度张善堂～方焱～屈建～陈象青～沈爱宗～孙言才,安徽省立医院～合肥 230001,[摘要] 目的:建立测定人血浆中白消安浓度的高效液相色谱法。

方法:血浆样品经衍生化处理，选用NovaPak C18色谱柱(4μm，3.9×150mm),甲醇-水(74:26，v/v)为流动相，流速0.9ml/min，-1检测波长280nm。

结果:白消安血浆浓度的线性范围为0.0500,3.20mg?L(r=0.9993, n=9),方法回收率99.66%,102.4%，血浆提取回收率81.70%,86.35%，日内和日间RSD均,15%。

结论:该方法准确、灵敏，适用于白消安血浆浓度测定及其药动学研究。

[关键词] 白消安;高效液相色谱法;血药浓度Determination of busulfan in human plasma by HPLC with pre-colum derivatizationShantang，FANG Yan，QU Jian，CHAN Xiangqing，SHEN Aizong，SUN Yancai(ZHANG Anhui ProvincialHospital，Hefei 230001，China)ABSTRACT: OBJECTIVE To develop a HPLC assay for determination of busulfan concentration in human plasma. METHODS Plasma samples were prepared by derivatization with sodium diethyldithiocarbamate(DDTC) andextraction with ethyl acetate ,the extract was dried under nitrogen and reconstituted with methanol prior to HPLC determination. Chromatography was accomplished using a NovaPak C analytical colum (4μm，3.9×150mm) and mobile phase 18of methanol-water(74:26,v/v) at a flow rate of 0.9ml/min with UV detection at-1280n0.9ml/minm. RESULTS Calibration curves were linear from 0.0500 to 3.20mg?L(r=0.9993,n=9), the recovery of method was 99.66%,102.4%， and the extraction yield foe busulfan inplasma was 81.70%,86.35%. The RSDs of intra- and inter-day werelower than 11.20% and 14.99%,respectively. CONCLUSION The method is sensitive and accurate for the determination of busulfan concentrationin human plasma. It is suitable for the pharmacokinetics study of busulfan.KEY WORDS: busulfan; HPLC;plasma drug concentration作者简介张善堂，男，硕士，副主任药师。

凝胶柱层析分离血红蛋白和DNP-胰糜蛋白酶.

凝胶柱层析分离血红蛋白和DNP胰糜蛋白酶
血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳 Nhomakorabea目的与要求：
了解电泳的原理、练习乙酸纤维素薄膜电
泳技术；
掌握凝胶层析的原理、熟练掌握实验操作。
原理：
凝胶层析原理 P19
电泳原理 23
凝胶柱层析分离血红蛋白和DNP-胰糜蛋白酶

Sephadex G-50的准备装柱15cm 加样与洗脱凝胶的再生
血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳

点样
电泳150V一小时染色与脱色
注意事项：

影响电泳的因素：蛋白质分子所带电荷、分子量。凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

4 王海龄, 耿力, 丁卫, 等. 单克隆抗体免疫亲和层析法纯化人的凝血因子 Ⅸ. 中国输血杂志, 1989, 2 ( 3) ∶111
5 中国生物制品规程. 一部. 北京: 中国人口出版社 1995. 248
6 Hor ow it z B. W iebe M E, L ippin A , et al. Inactiv ation of viruses of in lablie bloo d derivatives I. Disr uption o f lipid env elo ped v ir uses by tri ( n-but yl ) pho sphate deter gent combinat ion. T r amsf usion. 1985, 25( 2) ∶516
蔡骏等: 柱层析法制备高纯人血 FIX 研究初探
109
现今为止只有单克隆抗体亲和层析才能达到
单条带的电泳结果。
3) 微量免疫电泳显示 P CC 中所含有白蛋白、球蛋白沉淀线在 FIX 制剂的免疫电泳图谱没有出现, 显示了纯化效果。 4) 凝血酶活性为阴性, 揭示这种制剂是安全的, 致静脉血栓的可能性极低。 5) 我们也进行过 S/ D 法[ 6] 对 FIX 制剂病毒灭活试验, 得到初步结果是, S/ D 试剂对 F IX 活性是安全的, 今后采用 S/ D 灭活病毒对 FIX 活性回收是有保障的。 6) 该工艺和 S/ D 法结合非常容易, 有机溶剂和去污剂可在离子交换剂或亲和层析上; 轻易去除, 不需另附加去除病毒措施, 如果再增加 BM M 膜去除病毒措施[ 7] , 病毒安全性方面更有保障。
洗涤凝胶后用含 0. 01mol / L 枸椽酸钠,
2m ol/ L NaCl , pH 6. 0 0. 1L 两次洗脱 PCC,
洗脱液超滤( M r 10000) 透析除盐到生理盐
水水平以下。尽快- 20℃深冻。
2. 1. 2 DEAE-Sephar ose F F 层析 DEAE-
药物生物技术
第 6 卷第 2 期
含有 0. 16mol/ L, 0. 19mol/ L 和 0. 28m ol/ L
FⅡ凝固活性凝血酶原时间( PT)
NaCl 洗脱杂蛋白。DEAE PCC 洗脱用 pH
法[ 4] 。
8. 0 的同样缓冲液, 含有 0. 36mol / L NaCl 。 2. 2. 2 凝血酶活性测定参考文献[ 5] 。
1 材料和仪器
血浆本所血源室提供
DEAE-Sephadex A50, DEAESephar ose FF , Heparin-Sephar ose CL -6B 均为瑞典 Pharmacia 公司出品
层析柱 5 1. 6×40cm 瑞典 LKB 公司 5 1. 6×25cm 上海锦化仪器公司超滤器日本密滤膜公司
Com par ison o f differ ent pro thro mbin complex
concentra te in vitr o and v iv o studies. T hr omb
Res, 1990, 60( 1) ∶63
3 M enache M , Behre H E. O rt hner C, et al. Conag ulation fact or Ⅸ Concentrat e: M ethod of pro paration and assessment of po tential v iv o thr ombenicity in animal modal. Blood, 1984, 64 ( 4) ∶1220
2 方法
2. 1 分离方法
过滤
人血浆 DEAE-Sephadex A50 吸附
洗脱超滤透析深冻-20℃ 融化, 冷冻离心
DEAE-Sepharose FF 层析
H ep ar in -
Sepharose CL -6B 层析
2. 1. 1 DEAE-Sephadex A50 吸附 15g
抗人血清来自成都输血所。
2. 2 检测方法 2. 2. 1 F IX 凝固活性高岭土凝血部分活
3 结果
酶时间( K PT T ) 法[ 4] ,
3. 1 F IX 提纯 FIX 纯化结果见表 1。
T ab 1 F IX P urificatio n
Plasma A 50 P CC DHEepAaEr i-nS-eSpehpahraorsoesFeFCLP-C6BC
Fig 1 Results o f SDS-P AG E
3. 3 免疫电泳结果免疫电泳结果见图 2。
4 讨论
1) 采用本工艺路线制备 F IX 比活为 35IU /
1. A 50 P CC; 2. D EAE P CC; 3. F IX ag ainst an anti-
PCC plasma r abbit imm une serum. F ig 2 Result s o f immunoelectro por esis
7 刘世维 , 倪道明, 吕临红, 等. BM M 膜病毒过滤系统在血液制品中使用初步研究. 中国输血杂志, 1994, 7( 增刊) ∶36
参考文献
1 Bur nouf T , M ichalski C, G oudemand M , et al.
Preliminary Research of Preparation of Highly Purified
7) 该工艺路线不仅能制备 FIX, F Ⅱ, F Ⅶ, F Ⅹ等血浆组分均能在各个层析分离峰中回收, 因此在血浆综合利用方面很有应用价值。 8) 工艺流程中有制品融化过程, 对 F Ⅸ活性有影响, 若在温度控制、工艺连续性及工艺参数方面进一步优化, 纯化效果可能还会提高。
P ro per ties of a Hig hly P urified Human Plasma
PCC 上样, 平衡液洗涤, 用同样的缓冲液含有 2. 2. 5 微量免疫电泳按 Grabbar-
0. 25mol / L NaCl 洗脱杂蛋白, 再用 0. 35mo l/ Wiliams imm unoelect ropho resis 法进行, 兔
L NaCl 洗脱 F IX。
Sepharose FF 层析柱用 0. 006mol / L 磷酸盐
缓冲液 pH 6. 0 平衡。取 A50 PCC37℃融化
后上样。洗脱液为含有 0. 005m ol/ L 枸椽酸
钠, 0. 05mo l/ L 磷酸盐 pH 6. 0 的缓冲液, 并
X 收稿日期 1998-11-30
108
F actor Ⅸ: C T her apeutic co ncentr ate prepar ed
by co nventio nal chr omat og raphy . V ox Sang ,
1989, 59( 1) ∶225
2 K ohler M , Heiden M , Har baneur G , el al.
DEAE-Sephadex A50 在 pH 7. 0, 0. 075m ol/
L NaCl 中溶胀, 并在 121℃灭菌 30min。取新
鲜血浆 10L , 多层纱布过滤, 加入经预处理的
A50 凝胶 4℃搅拌 45min, 分离凝胶及血浆。
血浆用来制作白、球蛋白。用含 0. 01m ol/ L
枸椽酸钠, 0. 2m ol/ L NaCl, pH 7. 0 1L 三次
FIX
Pr ot ein co ncentr atio n( % )
S pecif i c acit ivity ( IU / mg )
Pur ficatio n fa ct or
5. 2±0. 2 3. 0±0. 3 0. 1±0. 05 0. 01±0. 005
0. 01±0. 005 1. 0±0. 21 6. 8±0. 2
35 ±2
10 0 68 0 3 50 0
FI X a ctivity
( 70±5) % ( 50±5) % ( 85±5) %
3. 2 SDS-P AGE 结果 SDS-PAGE 结果见图 1。
ห้องสมุดไป่ตู้
1. F IX ; 2. DEA E PCC; 3. A 50 PCC; 4. Plasma; 5. Sta ndard pro tein
2. 1. 3 Heparin-Sepharose CL -6B 层析
2. 2. 3 SDS-P AGE 分离胶 15% , 采用低
Heparin-Sepharo se CL -6B 层析柱用 Mr 标准蛋白。
0. 02mol / L 枸椽酸钠 pH 7. 4 平衡。用 DEAE 2. 2. 4 蛋白浓度微量双缩脲法。
关键词凝血酶原复合物; 人凝血因子Ⅸ; 人凝血因子Ⅱ
乙型血友病的治疗方法现今仍为含有 F Ⅸ 的制剂如凝血酶原复合物 ( P rot hrom in Complex Co ncent rat e, PCC) 或高纯度 F Ⅸ的替代疗法。PCC 是以血浆为原料经过一步阴离子层析吸附制得, 比活一般为 0. 7 ～ 1. 5IU / mg , 较血浆大约提纯 50～100 倍, 除 F Ⅸ外, P CC 一般还含有维生素 K 依赖蛋白如 F Ⅱ( 人凝血因子Ⅱ) , FⅦ( 人凝血因子 Ⅶ ) , F Ⅹ( 人凝血因子Ⅹ) , 由于生产工艺的差异, 还可能含有蛋白 C, S, IT I( 间 A胰蛋白酶抑制剂) , 高分子激肽原, C4C5, C9 ( 补体 4, 5, 9) [ 1] , 长期输注 PCC 制品有可能会引发广泛性静脉栓塞。[ 2] M enache 应用 DEA ESephadex 和 Dex tr an Sul fat e 两步层析制备得到比活接近于 10IU / mg F Ⅸ制品, [ 3] 本文在此报道一种采用离子交换及肝素亲和层析制备高纯度人血 F Ⅸ的工艺。