蛋白质的透析实验精品课件

Pr+ 醋酸铅或硫酸铜 沉淀
4、生物碱试剂：
Pr+ 鞣酸或苦味酸 沉淀
观察加水
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实验注意事项
(1).在操作过程中试管不能冲向他人以防止烫伤。 (2).操作强酸时要注意，吸管使用要规范。 (3).双缩脲反应铜离子不能多加，否则与氢氧化
钠形成蓝色的氢氧化铜，干扰试验结果。 (4).实验报告各部分内容都要包括，实验结果如
实验一 蛋白质的性质实验
王伟 中国海洋大学医药学院
2021/4/24
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实验目的
1. 加深理解所学有关的蛋白质性质的理论 知识
2. 掌握氨基酸和蛋白质常用的定性、定量 分析的方法及原理
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实验原理
一、蛋白质呈色反应 二、蛋白质沉淀反应
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一、蛋白质呈色反应
❖ 蛋白质的呈色反应是指蛋白质所含的某些氨基酸及 其特殊结构，在一定条件下可与某些试剂发生了生 成有色物质的反应。不同蛋白质分子所含的氨基酸 残基不完全相同，因此所发生的成色反应也不完全 一样。
2021/4/24
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（二）双缩脲反应
❖ 当尿素经加热至180℃左右时，两分子尿素脱去一分 子氨，进而缩合成一分子双缩脲。其在碱性条件下 双缩脲与铜离子结合成红紫色络合物，此反应称为 双缩脲反应。
❖ 蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，此 类似反应也称蛋白质的双缩脲反应。凡分子中含有 两个以上肽键的化合物都呈此反应，故所有蛋白质 都能与双缩脲试剂发生反应。
OH + HNO3
HO
HO
NO2 + NaOH
O
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NO2 + H2O

透析实验
—— 蛋白质的透析
实验原理

透析是膜技术的一种，利用透析膜可以选择性 的透过一定大小分子，从而将待分离纯化的物 质和杂质离子分离开。 透析膜是半透膜，蛋白质是大分子物质，它不 能透过透析膜，而小分子物质可以自由通过透 析膜与周围的缓冲溶液进行溶质交换，进入到 透析液中。


常见的透析有：蛋白质的透析和糖类的透析。
操作步骤
透析 用磁力搅拌器搅拌促进溶液交 换。透析过程中需要更换洗脱溶液 数次（约15min一次），至达到透析 平衡为止（洗出液中无 Cl- ），约需 1h.
检查透析效果

检查氯离子：自烧杯中取水1~2ml，加10%硝 酸溶液数滴使之成酸性，再加入1%硝酸银1~2 滴，检查氯离子的存在。 检查蛋白质：从烧杯中取1~2ml，做双缩脲反 应，检查是否有蛋白质存在。 双缩脲反应：加10%氢氧化钠1ml，振荡摇匀， 再加1%硫酸铜溶液1滴，振荡，观察是否出现 粉红色。
检查透析效果的方法：用1％ BaCl2检查 (NH4)2SO4，用1％AgNO3检查NaCl、KCl 等

操作步骤
装样 取一段透析袋 10~15cm ，将其 一端用棉绳扎死，由开口端加入约 5ml待透析的样品溶液（蛋白质氯化 钠溶液），开口端用棉绳扎死，放 入盛有蒸馏水的烧杯中，系于一横 放在烧杯的玻璃棒上。
透析装置（原理图）实验仪器Βιβλιοθήκη 磁力搅拌器器材与试剂

器材：透析袋 ，烧杯，玻璃棒，磁力搅拌 器，试管及试管架。 试剂：饱和氯化钠溶液，10%硝酸溶液， 1%硝酸银溶液，10%氢氧化钠溶液，1%硫 酸铜溶液。

操作步骤

透析袋的处理：一般是将透析袋剪成10～ 20cm的小段，在2％（W/V）NaHCO3和 1mmol/L的EDTA（pH8.0）中煮沸10min， 用蒸馏水彻底洗尽透析袋，然后放在 1mmol/L的EDTA（pH8.0）中煮沸10min， 用蒸馏水彻底洗尽透析袋，冷却后，存放 于4℃，从此时起取用透析袋，必须戴手 套

THANKS
五、思考题 鸡蛋清为什么可用作铅中毒或汞中毒的解毒剂？
添加副标题
三．材料与试剂
四．实验材料：鸡蛋
五．实验试剂
○ 蛋白质氯化钠溶液：取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液 100ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加氯化钠的目的是溶解球蛋白）。
○ 其他试剂：①硫酸铵粉末 ②饱和硫酸铵溶液
三．实验器材 试管及试管架、滤纸、研钵、烧杯、玻璃棒、漏斗
操作方法
实验三 蛋白质的盐析 作用
一、目的要求
了解蛋白质的 的沉淀反应
学习盐析操作 技术
二、实验原理
用大量中性盐使蛋白质从溶液中沉淀析出的 过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水 胶体，蛋白质溶液在高浓度中性盐的影响下， 蛋白质分子被中性盐脱去水化层，
PART ONE
同时所带电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而 沉淀析出。析出的蛋白质仍保持其天然性质，当降低盐的浓 度时，还能溶解。因此，蛋白质的盐析作用是可逆过程。
实验器材 试管及试管架、透析袋、玻璃棒、线绳、烧杯
操作方法
一．取1支试管，加入约1ml蛋白质溶液，加入1%硫酸铜溶 液3-4滴，观察沉淀的生成。
二．在蛋白质可逆沉淀反应中，将用硫酸铵盐析所得的清蛋 白沉淀倒入透析袋内，用线绳或透析袋夹江透析袋口扎 紧，把透析袋浸入盛有蒸馏水的烧杯中进行透析，并经 常用玻璃棒搅拌，每隔15分钟换水一次，仔细观察透析 袋中的蛋白质沉淀变化情况。
但是，在一定的物理化学因素影响下，由于蛋白质胶体颗 粒的稳定条件被破坏，如失去电荷、脱水、甚至变性，而 以固体形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反 应。这种反应可分为可逆沉淀反应和不可逆沉淀反应。
可逆沉淀反应—蛋白质虽已沉淀析出，但它 的分子内部结构并未发生显著变化，如果把 引起沉淀的因素去除后，沉淀的蛋白质能重 新溶于原来的溶剂中，并保持其原有的天然 结构和性质。利用蛋白质的盐析作用和等电 点作用，以及在低温下乙醇、丙酮短时间对 蛋白质的作用等所产生的蛋白质沉淀都属于 这类沉淀反应。

( A)
• A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果
• B、气泡阻碍蛋白质的运动 • C、气泡与蛋白质发生化学反应 • D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
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2、样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A
• A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱 内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
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4、在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷
酸缓冲液处理的目的是 A.防止血红蛋白被O2氧化
( D)
B.血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和
C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其 结构和功能
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5、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的
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50cm高
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样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到 与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶 端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样， 同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
• B.采用透析法使蛋白质与其他小分子化合 物分离开来
• C.离心沉降法通过控制离心速率使分子大 小、密度不同的蛋白质分离
• D.蛋白质在电场中可以向与其自身所带电 荷相同的电极方向移动
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三、血红蛋白的提取和分离
1.样品处理 2.粗分离 3.纯化 4.纯度鉴定
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1.样品处理
叙述中，正确的是 ( D )
A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去 除细胞表面杂蛋白

检查透析效果的方法：用1％ BaCl2检查 (NH4)2SO4，用1％AgNO3检查NaCl、KCl 等

透析装置
实验仪器

磁力搅拌器
蛋白质的透析
1.
取10～15mL蛋白质氯化钠溶液，装入处理好 的透析袋中，扎紧两端，浸入蒸馏水烧杯中 进行1～2h的透析 用硝酸银检测烧杯中透析液是否有氯离子存 在？用双缩脲法检测是否有蛋白质存在？ 透析完全后，检测透析袋内是否存在蛋白质 和氯离子？ 注意：透析完全时，透析袋内会出现球蛋白 沉淀，因为球蛋白不溶于纯水。
2.
3.

思考题
透析实验
实验原理

透析是膜技术的一种，利用透析膜可以选择性 的透过一定大小分子，从而将待分离纯化的物 质和杂质离子分离开。 常见的透析有：蛋白质的透析和糖类的透析。

实验原理

透析是利用半透膜进行的一种选择性扩散 操作，通常是将半透膜制成袋状，将生物 大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸 入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量 的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分 子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外 两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋 内未透析出的样品溶液称为“保留液”， 袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透 析液”。

实验原理

ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
透析袋的处理：一般是将透析袋剪成10～ 20cm的小段，在2％（W/V）NaHCO3和 1mmol/L的EDTA（pH8.0）中煮沸10min， 用蒸馏水彻底洗尽透析袋，然后放在 1mmol/L的EDTA（pH8.0）中煮沸10min， 用蒸馏水彻底洗尽透析袋，冷却后，存放 于4℃，从此时起取用透析袋，必须戴手 套
实验原理

把需要透析的样品盛于透析袋内，袋内留 有挤去空气的空余部分，以防由于溶剂渗 入造成样品体积增加而引起透析袋胀破 为了获得较快的透析速度，常常采取一些 措施保持膜两侧浓度差具有最大差，如经 常更换透析外液，连续搅动外液

而实现物质分离。
蛋白质透析的应用
生物制品分离纯化
在生物制品的分离纯化过程中， 蛋白质透析常用于去除盐、糖等 小分子杂质，提高产品的纯度。
实验室研究
在实验室研究中，蛋白质透析可 用于制备高纯度的蛋白质样品， 供后续实验使用。
临床应用
在某些临床应用中，如血浆置换 疗法，蛋白质透析可用于去除血 浆中的毒素或过量的药物。
透析效率问题
透析效率问题
透析效率低下可能导致体内毒素和多余水分不能被充分清除 。
解决方案
采用高效透析器，提高血流速度，缩短透析时间，增加透析 液流量等措施，以提高透析效率。同时，根据个体情况调整 透析方案，以达到最佳的透析效果。
蛋白质变性问题
蛋白质变性问题
在透析过程中，蛋白质可能会发生构象变化，导致其功能受损。
浓缩蛋白质溶液
通过去除部分溶剂，使蛋白质溶液得 到浓缩。
蛋白质透析的原理
半透膜原理
01
透析利用半透膜原理，允许小分子物质透过膜而大分子物质被截留，从而实现物质分离。分子量大小差异02
蛋白质分子量较大，无法透过半透膜，而小分子物质如盐、糖
等可以自由透过半透膜。
浓度差驱动
03
透析过程中，小分子物质从高浓度一侧扩散至低浓度一侧，从
疾病机制研究
蛋白质的透析可以帮助研究疾病的发病机制 和治疗机制，为疾病的预防和治疗提供新的 思路和方法。未来随着人类对疾病认识的深 入和技术的进步，蛋白质的透析在疾病机制 研究中的应用将更加广泛和深入。
THANKS
感谢观看
临床应用展望
个性化透析
随着基因组学和蛋白质组学的发展，未来蛋白质的透析将更加个性化，根据患者的具体情况制定个性化的透析方案， 提高治疗效果和患者的生存质量。

聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
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带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
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凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
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• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
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一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
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凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。

用部分收集器收集洗脱液。合并与峰值相对应的试管中的洗脱液，即为脱盐后的蛋白质
溶液。
7、 用氯化钡溶液检测蛋白质溶液和其他各管收集液，评价脱盐效果。
结果处理
记录并解释实验现象，讨论凝胶过滤的脱盐效果。 注意事项
1、 整个操作过程中凝胶必须处于溶液中，不得暴露于空气，否则将出现气泡和断层，应当 重新装柱。
分子的大小和工作目的，选择适合的凝胶型号。交联度高的小号胶如 Sephadex G-25 适于脱
盐。
当在凝胶柱顶加上分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时，自由通透的小分子可以进
入胶粒内部，而受排阻的大分子不能进入胶粒内部。二者在洗脱过程中走过的路程差别较大，
大分子只能粘着胶粒之间的间隙向下流动，所经路程短，最先流出。而渗入胶粒内部的小分
在真空干燥器中减压除气，准备装柱。
2、 装柱：将层析柱垂直固定，加入 1/4 柱长的蒸馏水。把处理好的凝胶用玻棒搅匀，然后
边搅拌边倒入柱中（柱口保持排放）。最好一次连续装完所需的凝胶，若分次装入，需
用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面，影响分离效果。最后放入略小于层析柱
内径的滤纸片，保护凝胶床面。
实验材料
1、Sephadex G-25
2、鸡蛋清溶液: 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按 1:20 混匀,然后用六层纱布过滤。
操作步骤
1、 凝胶溶胀：取 5g Sephadex G-25，加 200ml 蒸馏水充分溶胀（在室温下约需 6h 或在沸水
浴中溶胀 2h）。待溶胀平衡后，用虹吸法除去细小颗粒，再加入与凝胶等体积的蒸馏水，
子受迷宫效应影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出。通透性居中的分子
则后于大分子而先于小分子流出。从而按由大到小的顺序实现大小分子分离。

用1bacl2检查nh42so4用1agno3检查naclkcl等操作步骤装样取一段透析袋1015cm将其一端用棉绳扎死由开口端加入约5ml待透析的样品溶液蛋白质氯化钠溶液开口端用棉绳扎死放入盛有蒸馏水的烧杯中系于一横放在烧杯的玻璃棒上
透析实验
——蛋白质的透析
实验原理
• 透析是膜技术的一种，利用透析膜可以 选择性的透过一定大小分子，从而将待 分离纯化的物质和杂质离子分离开。
操作步骤
透析 用磁力搅拌器搅拌促进溶液交换。透析过
程中需要更换洗脱溶液数次（约15min一次）， 至达到透析平衡为止（洗出液中无Cl-），约需 1h.
检查透析效果
• 检查氯离子：自烧杯中取水1~2ml，加 10%硝酸溶液数滴使之成酸性，再加入 1%硝酸银1~2滴，检查氯离子的存在。
• 检查蛋白质：从烧杯中取1~2ml，做双缩 脲反应，检查是否有蛋白质存在。
试剂：饱和氯化钠溶液，10%硝酸溶液，1%硝酸银溶 液，10%氢氧化钠溶液，1%硫酸铜溶液。
操作步骤
透析袋的处理：一般是将透析袋剪成10～ 20cm的小段，在2％（W/V）NaHCO3和 1mmol/L的EDTA（pH8.0）中煮沸10min， 用蒸馏水彻底洗尽透析袋，然后放在 1mmol/L的EDTA（pH8.0）中煮沸10min， 用蒸馏水彻底洗尽透析袋，冷却后，存放 于4℃，从此时起取用透析袋，必须戴手套
• 双缩脲反应：加10%氢氧化钠1ml，振荡 摇匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，振荡， 观察是否出现粉红色。
注意事项
把需要透析的样品盛于透析袋内，袋内 留有挤去空气的空余部分，以防由于溶 剂渗入造成样品体积增加而引起透析袋 胀破
为了获得较快的透析速度，常常采取一 些措施保持膜两侧浓度差具有最大差， 如经常更换透析外液，连续搅动外液。

观察并记录实验结果
总结词
这是实验的最后步骤，需要仔细记录和分析结果。
详细描述
在透析结束后，观察并记录实验结果。可以通过测量蛋白质的浓度、电泳或光谱分析等方法来分析透 析后蛋白质的性质和结构变化。同时，需要注意观察任何异常现象，并记录下来以供进一步分析。
04
实验结果与数据分析
实验结果记录
实验结果
其他试剂
• 实验过程中可能还需要其他试剂，如稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂等，以辅助实验的进行和确保实验结果的准确性。
03
实验步骤
准备透析袋和缓冲液
总结词
这是实验的基础，确保所有材料都准备齐全。
详细描述
在开始实验之前，需要准备干净的透析袋和适当的缓冲液。透析袋应选择合适大 小的，以确保蛋白质可以自由进出，而缓冲液则应与蛋白质的pH值相匹配，以 确保蛋白质的稳定性。
结果解释与讨论
结果解释
根据实验结果和数据分析，解释蛋白质在透析过程中的行为和性质变化，探究其分离纯 化的原理。
结果讨论
对实验结果进行讨论，分析实验的优缺点，提出改进措施，为后续研究提供参考和借鉴。
05
结论与展望
结论总结
蛋白质的透析实验是一种有效的分离和纯化蛋白质的方法，能够去除杂质和多余的 盐分，提高蛋白质的纯度和结晶质量。
VS
快速
透析法能够在短时间内完成蛋白质的分离 和纯化，提高了实验效率。
本实验的优缺点分析
• 经济：透析法使用的材料成本较低，适合实验室和小规模 生产中经费有限的条件下进行。
本实验的优缺点分析
效率较低
相对于其他分离和纯化方法，透 析法的效率较低，需要较长时间 才能达到较高的纯度。
适用范围有限