《蛋白质的表达》PPT课件

3，酶水解
目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶 （proteolytic enzyme）或称蛋白酶 （proteinase）已有十多种。
应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不 会发生消旋化。水解的产物为较小的肽 段。
最常见的蛋白水解酶有以下几种：
O
O
O
O
NH CH C NH CH C NH CH C NH CH C
OH O
NH
CH3
CH CH
CH2CH3
CO
C CH2 NH C CH NH C CH2 NH O
鹅膏覃碱的化学结构
+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-
Met-脑啡肽
Leu-脑啡肽
Cys Tyr ILe S Gln S Asn Cys Pro Leu Gly NH2
蛋 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋
白 质
白质分子量之间的关系，即可确定多肽
一 链的数目。
级
结
构
的
测
定
2，测定步骤
(3)，二硫键的断裂
蛋 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可
白 质
在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存
一 在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二
级 结 构
硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保 护生成的巯基，以防止它重新被氧化。
Ser-Val-Tyr-Asp-Gln
3.2.2 肽键
肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有 明显的共轭作用。
组成肽键的原子处于同一平面。
肽键
肽键中的C-N键具有部分 双键性质，不能自由旋转。

萃取法
液-液萃取法
利用两种不混溶的溶剂，将目标蛋白 质从一种溶剂中转移到另一种溶剂中 。
反胶团萃取法
利用反胶团形成的微环境，选择性分 离和纯化蛋白质。
色谱法
凝胶色谱法
利用凝胶介质对不同大小的蛋白质颗粒的分离作用，将目标蛋白质与其他杂质 分离开。
离子交换色谱法
利用离子交换剂对不同带电状态的蛋白质的吸附作用，将其与其他蛋白质分离 开。
亲和层析
利用基因工程改造的蛋白质分 子上的特定标签与固相载体上 的配体结合进行分离纯化。常 用的亲和层析包括His-tag亲 和层析、GST亲和层析等。
离子交换层析和凝胶过滤 层析
与抗体药物的纯化类似，离子 交换层析和凝胶过滤层析也可 用于重组蛋白药物的进一步纯 化和精制。
蛋白质相互作用研究中的纯化应用
02
蛋白纯化方法
沉淀法
盐析法
通过加入高浓度的盐溶 液，改变蛋白质的溶解
度使其沉淀下来。
有机溶剂沉淀法
利用有机溶剂降低蛋白 质溶解度的原理，使其
沉淀。
聚合物沉淀法
利用聚合物与蛋白质的 相互作用，使蛋白质沉
淀。
低温沉淀法
在低温条件下，通过改 变蛋白质的溶解度使其
沉淀。
离心法
差速离心法
通过逐渐增加离心力，将 不同大小的蛋白质颗粒分 离开。
扩展床吸附技术
将大颗粒的介质填充于柱中，使流动相能够通过吸附作用去 除杂质，提高纯化效果。
集成化与自动化技术
集成化分离系统
将多个分离步骤集成在一个系统中， 实现连续的分离纯化，提高生产效率。
自动化控制技术
通过自动化控制系统，实现分离纯化 的全流程监控和自动调节，减少人为 误差和操作时间。

蛋白质前体的加工
• N端fMet或Met的切除 • 二硫键的形成 • 特定氨基酸的修饰 • 切除新生肽链中非功能片段 • 多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程 • 糖基化，磷酸化等等
蛋白质的分泌
不论原核生物还是真核生物，在细胞内合成的蛋白质需定 位于细胞内的特异区域，或者分泌出细胞。分泌性蛋白 都有一段信号肽，即在蛋白质合成过程中N端有一15~36 个氨基酸残基的肽段---信号肽，它能引导蛋白质的肽链 到达并通过内质网，然后被内质网中的信号肽酶切除。 相对于真核生物来说，原核生物蛋白的分泌要简单得多。
一些信号肽的一级结构
蛋 白 的 分 泌 （ 一 ）
蛋白的分泌（二）
蛋 白 的 糖 基 化
革 兰 氏 阳 性 菌 蛋 白 的 分 泌
革 兰 氏 阴 性 菌 蛋 白 的 分 泌
伴侣蛋白
多肽链合成后必须正确地折叠才能具有天然的构象。经 过跨膜转运进入内质网的肽链，在折叠过程中是在蛋白伴 侣（chaperones)或称分子伴侣（molecular chaperones)辅助 下完成的，蛋白伴侣广泛分布于原核及真核细胞中。起到 介导各种功能域乃至整个蛋白质分子的折叠，辅助肽链折 叠成天然构象的具有生物学活性的蛋白质。
调节型强启动子
在克隆基因上游设置调节型强启动子是一个高效的蛋白质表达 系统最基本的条件。
• 不同启动子，效率不同。强启动子可产生较多mRNA，弱的 则相反。
• 外源基因的大量持续表达往往对宿主细胞有害，因为这一过 程会消耗大量能量，从而破坏宿主细胞的必要的生理功能。
• 带有表达克隆基因的质粒，在几次细胞分裂后往往会丢失。 • 解决的办法：引入强启动子并控制克隆基因在宿主细胞生长
融合蛋白作为抗原的标记蛋白

利用蛋白质表达技术，可以调控特定蛋白质的表达，为生 物治疗提供新的策略和方法，如基因治疗、细胞治疗等。
提高蛋白质表达产量的方法与策略
01
优化基因序列
通过优化目的基因的序列，如提高启动子活性、调整密码子使用等，可
以提高蛋白质的表达水平。
02
宿主细胞选择与改造
选择合适的宿主细胞，并进行必要的改造，如细胞代谢途径的优化、细
蛋白质降解
通过细胞内的蛋白酶体系统降解蛋白 质，调节细胞内蛋白质的平衡和功能。
02
蛋白质表达系统
原核表达系统
表达量高
原核表达系统如大肠杆菌表达 系统能够高效表达外源基因，
产生大量的重组蛋白质。
操作简便
原核表达系统相对简单，遗传 背景和培养条件较明确，便于 实验操作和基因工程改造。
表达产物易纯化
原核表达产物通常以可溶性或 包涵体的形式存在，易于分离 和纯化。
酵母表达系统在工业生产中具有一定的应 用价值，可以用于生产酶制剂、生物材料 等。
培养基廉价易得
表达量不稳定
酵母菌可以在相对简单的培养基中生长繁 殖，降低了生产成本。
酵母表达系统的表达量可能受到多种因素 的影响，如基因拷贝数、整合位点等，导 致表达量不稳定。
昆虫表达系统
高效表达外源基因
昆虫表达系统如杆状病毒表达系统能够 高效侵染昆虫细胞，并在短时间内获得
基因转染技术
基因转染技术是一种将外源DNA或RNA导入细胞的技术。通 过基因转染技术，可以将目的基因导入到细胞中，实现目的 基因的表达。
基因转染技术是蛋白质表达的重要手段之一，通过基因转染 技术可以将目的基因导入到各种类型的细胞中，如原代细胞 、干细胞、肿瘤细胞等，实现目的基因的表达和功能研究。

蛋白质缺乏症
蛋白质缺乏症是指由 于蛋白质摄入不足或 吸收障碍导致的营养 缺乏病。
在儿童中，蛋白质缺 乏症还可能导致生长 发育迟缓、智力发育 不良等。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
症状包括体重减轻、 肌肉萎缩、贫血、免 疫力下降等。
蛋白质过量的危害
01
02
03
04
虽然蛋白质是人体必需的营养 素，但摄入过多也会对健康造
成负面影响。
蛋白质的分类
根据结构
可分为简单蛋白质和结合蛋白质。
根据功能
可分为酶、激素、抗体、载体、血红蛋白等。
蛋白质的结构与功能
结构
蛋白质的结构可分为一级、二级、三级和四级结构。一级结构是指蛋白质中氨基酸的排列顺序；二级 结构是指蛋白质中局部主链的构象；三级结构是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置；四级 结构是指蛋白质分子中各个亚基的空间排布及相互作用。
蛋白质 PPT 课件
目录
CONTENTS
• 蛋白质简介 • 蛋白质的合成与分解 • 蛋白质与疾病 • 蛋白质在生物体内的应用 • 蛋白质研究的前沿与展望
01 蛋白质简介
定义与组成
定义
蛋白质是由氨基酸组成的大分子 有机化合物，是构成细胞和组织 的主要物质之一。
组成
蛋白质由20种不同的氨基酸通过 肽键连接而成，其分子量通常在 10,000道尔顿以上。
高蛋白饮食可能导致肾脏负担 加重，引发肾脏疾病。
过量的蛋白质在体内代谢过程 中会产生大量的氨和尿素，增 加肝脏负担，并可能导致肝病
。
此外，高蛋白饮食还可能引发 肥胖、心血管疾病等健康问题
。
04 蛋白质在生物体内的应用
蛋白质在食品工业中的应用
蛋白质作为食品添加剂

原理
促进正确折叠
手段
融合催化二硫键形成酶的标签 选择促二硫键形成的细胞（Origami系列菌株）
分泌表达
融合表达 控制表达水平 “假”包涵体 （疏水区域，膜结合等）
细胞周质表达，胞外分泌
融合溶解性高的标签（GST，MBP） 诱导温度 IPTG浓度 特殊裂解缓冲液（去垢剂，盐，核酸酶„„）
1
2
1
2
3 Lane 1：37℃
最高 蛋白种类多，需裂解 ≤50% 菌体，复杂 较少 ≤4% 变化 较大 蛋白种类少，需渗透 压休克，相对容易 纯化简单。但机理不 详，成功先例少 适用于疫苗开发、抗 体制备，前景广阔。
表达定位
菌液 离心 菌体 悬菌，渗透压休克 菌体 悬菌，裂解，离心 沉淀 溶解，离心 沉淀 胞质不溶组分 胞质可溶组分 培养基组分 细胞总蛋白 细胞周质组分
严谨调控
稀有密码子
溶解性
Rosetta系列
Origami系列
稀有密码子 不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基 因的mRNA 无法正常在E. coli 里表达，是为“稀有”密码子。
表达条件
• 乳糖操纵子与诱导物
• 常用表达条件的优化
乳糖操纵子与诱导物
• 1980年，Guarante L等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统
原核表达概述 原核表达原理概述 表达载体 表达菌株 表达条件
原核表达原理概述
目的基因
构建
转化
培养，诱导
表达载体
重组载体 表达菌株
“基因——载体——菌株——培养”
表达载体
• 启动子
• 融合标签
• 常用表达载体系统
常见启动子 • λpL启动子： • trp启动子： 热诱导启动子 化学诱导启动子

子质
盘曲、 折叠
蛋白质
氨基酸数目成百上千 氨基酸排列次序变化多端
结 构 多
功 能 多
样样
肽链空间结构千差万别
性
性
20
1,根据下图回答问题
（1）图中A表示_氨__基____， D表示__羧__基_。 （2）该化合物是由__3__ 个氨基酸分子失去__2__水 分子而形成的,这种反应 叫做_脱__水__缩__合_。
（D ）
A.细胞和生物体重要的结构物质 B.收缩、运输、免疫等活动的物质基础 C.调节细胞和生物体新陈代谢的重要物质 D.生命活动的主要体现者
6、蛋白质和多肽的主要区别是在于蛋白质（ B ）
A.含有的氨基酸更多
B.空间结构更复杂
C.相对分子质量更大
D.能水解成多种氨基酸
23
7、下列关于蛋白质的叙述中，正确的是（ A）
A、－CO－NH－
B、－NH－CO－
OH ‖∣ C、－C－N－
D、以上都对
10、如下图所示的氨基酸中，不属于构成蛋白
质的氨基酸的是（ B ）
25
11、已知20种氨基酸的平均相对分子质量为128，现有一
蛋白质分子由两条多肽链组成，共有肽键98个，此蛋白
质的相对分子质量最接近于（ C ）
A、12800 B、12544
c、n个氨基酸经脱水缩合形成m条多肽链时， 需脱去__n_-_m___个水，形成__n__-m___个肽键。
d、由100个氨基酸构成的一条多肽链中，
至少有__1__个氨基，_1___个羧基。
13
与蛋白质有关的计算： 1、有关肽键、氨基、羧基、原子数的计算
由m个氨基酸，n条肽链组成的蛋白质分子，至少
64500

侧链上的特定功能团发生化学反应 修饰类型：巯基、氨基、羧基、二硫键
3
（一）巯基的修饰
特点：亲核 最容易发生反应的侧链基团
修饰试剂 烷基化试剂 （碘乙酸、碘乙酰胺） N-乙基马来酰亚胺
DTNB
反应类型 羧甲基化
光吸收 二硫键、 有颜色的TNB
4
（二、氨基的化学修饰）
特点：亲和反应活性高 赖氨酸的ε –氨基
表真达核载表体达(体ex系pr：es酵si母on、v昆ec虫to、r) 哺乳动物 为使插入的外源DNA序列可转录和翻 译成多肽链而特意设计的载体称为表达 载体。
• 偶连基团：氨基、巯基、羧基
• 优点：延长半衰期、较小毒性、血药浓度波动小、
酶降解作用降低……
?
• 应用： 天门冬酰胺酶、腺苷脱氨酶
PEG 修饰脂质体包被的阿霉素
10
四、蛋白质的化学交联和化学偶联
• 交联：含有双功能基团的化学试剂与蛋白 质分子间形成网状交联。
• 偶联：蛋白质分子偶联到一个化学惰性的 水不溶性的载体上。
6
（四）二硫键的化学修饰
• 修饰方法：还原 • 修饰试剂：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。 • 判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是
链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS-PAGE 电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形 成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形 成二硫键。
类型
特点
应用
亲和标记 专一性标记酶活性部位 分离细胞表面受体
不可逆
光亲和标记 专一性标记酶活性部位 发现疾病相关的靶位点
不可逆
鉴别蛋白质
光反应基团
9
三、蛋白质的聚乙二醇修饰
• PEG特点：亲水、不带电荷

在BL21(DE3)细胞的基础上，具有额外拷贝的argU和proL 解决了表达富含AT的基因组蛋白密码
基因
子偏倚性问题
在BL21(DE3)细胞的基础上，具有额外拷贝的argU、ileY 解决了表达富含AT的基因组蛋白密码
和leuW tRNA基因
子偏倚性问题
带有可以与pET共存的、编码T7溶菌酶（T7 RNA聚合酶
常用蛋白表达系统(host)
原核细胞：大肠杆菌。 真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞
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大肠杆菌表达系统
大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。
优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解； ②商品化的载体和菌株种类非常齐全； ③表达效率高； ④易培养，成本低。
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非融合表达，融合表达，分泌表达
P
SD
Foreign DNA
P
SD
P
SD IPP
Foreign DNA
融合表达载体 S•Tag ，T7•Tag
融合基因 GST•Tag ，His•Tag Trx•Tag ，Nus•Tag
Foreign DNA
融合型表达载体
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缺点： ①糖基化与哺乳动物有所差别； ②表达量有限； ③作为药物宿主细胞未被FDA认可； ④培养成本高。
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哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。 优越性： ①糖基化与人源蛋白一致； ②能表达天然结构的完整蛋白，活性很高； ③可进行分泌表达。
缺点： ①表达量低； ②培养成本很高，操作繁琐。

赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应 活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比 较容易与修饰剂发生作用的位点。
常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试 剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等。
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（三）羧基的化学修饰 谷氨酸、天冬氨酸
修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺 类。
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（四）二硫键的化学修饰
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5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前
最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反 应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个 有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很
强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反 应程度。
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（二）氨基的化学修饰
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3、精氨酸残基含一个胍基，精氨酸残基的 强碱性，使其很难与大多数试剂发生修饰 反应，但可以和二羰基化合物发生反应。
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4、色氨酸吲哚基可以发生取代反应或者被 氧化裂解。N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以 使吲哚基团氧化成羟吲哚衍生物，但专一
性较差，酪氨酸残基也可与该试剂发生反 应。
第三章 蛋白质的修饰和表达
蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要 研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学 途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重 组蛋白质的表达进行讲解。
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1
第一节 蛋白质修饰的化学途径
蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引 入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改 变的过程。
有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋 白质的生物学活性，这些修饰称为非必需 部分的修饰。但多数情况下，蛋白质结构 的改变将导致生物活性的改变。

蛋白质表达系统
哺乳动物表达系统
哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的 感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时 间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源 基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出 目的蛋白。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、 增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件。
根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、 稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达 载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目 的蛋白的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周 期短。稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载 体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。由 于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。 诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以 开放。采用异源启动子、增强子和可扩增的遗传标记，可提高 蛋白产量。
蛋白质表达系统
酵母蛋白表达系统
代表：甲醇毕赤酵母 优点：表达量高，可诱导，糖基化机制
接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化， 易实现高密发酵 缺点：部分蛋白产物易降解，表达量不 可控
蛋白质表达系统
昆虫表达系统
昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数 高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。 昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。 利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载 体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具 有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化 及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；其 最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；可表达非常大的外 源性基因(一200kD)；具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达 多个外源基因的能力；对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体 蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在 此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。。常用的杆状病毒 包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕型多角体病 毒(BmNPV)，常用的宿主细胞则来源于草地夜蛾Sf9细胞，用 于表达外源基因的质粒来源于PUC系列，其含有一个多克隆 位点和多角体蛋白启动子。

最准确的方法是用蛋白质的摩尔消光系数计算。在蛋白质 纯化后，将此纯的蛋白质对水充分透析，然后冻于或在真空 干燥器中干燥，继而在105℃下恒重，精确称量1—10mg， 再定量溶于一定体积中(通常为1mg/ml)，测量280nm下的 光吸收，从而得出该蛋白质的摩尔消光系数。这种方法最为 方便、准确，适于微量测定。
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14
如果蛋白质是用SDS-PAGE纯化的，则非共价结合的分 子往往可以有效地除去，但又引入了SDS和其他一些分子 (Tris，Glycine等)。从SDS-PAGE电泳的凝胶中回收蛋白 质的方法很多，但不尽如人意。
如采用电印迹，往往很有效。因为PVDF膜结合蛋白质的 亲和力大大高于盐、去垢剂等小分子物质，从而达到蛋白质 脱盐的目的。
作为蛋白质组成成分的氨基酸一共有20种，它们的名称和结构列在表 1.1中。为了表达蛋白质和肽结构的需要，每个氨基酸都有相应的符号表 示，常用符号通常由氨基酸英文名的三个字母组成。一个蛋白质由上百 个甚至上千个氨基酸组成，为了表达的方便，又设计出单字符号。
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2
除了列出的20种基本氨基酸外，实际上 还有几百种不常见的氨基酸参与某些蛋白质 的组分，可称为稀有氨基酸；另一些氨基酸 出现频率要高些，如羟脯氨酸、甲基组氨 酸和甲基赖氨酸、丁—羧基谷氨酸等，但它 们是在蛋白质生物合成后转变而来的，因此 不计入基本氨基酸之列。
凝胶过滤是测定完整蛋白质分子的分子质量，而SDS-PAGE是测定蛋 白质亚基的分子质量，同时用这两种方法测定同一蛋白质分子质量，可 以方便地判断样品蛋白质是否寡聚蛋白质。
精选课件ppt16 Nhomakorabea较新方法是用毛细管电泳(凝胶筛分或无胶筛分)测定蛋白质的分子质 量，仅需纳克量，而且还可用积分仪或电脑联机精确定量。同时此法对蛋 白质的分辨率和准确性优于SDS-PAGE方法。在某一批IL-3产品的分子质 量测定中，用SDS-PAGE得到均一的区带，但在毛细管筛分电泳中为两个 毗邻的峰。两个峰的分子质量也有约1 000Da的差异，教材作者进一步用 质谱验证了这一结果。