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实验12 二苯胺法测定DNA 含量一、目的学习和掌握测定DNA 的定糖法（二苯胺法）的原理和操作技术。
二、原理脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm 处有最大的吸收，在每毫升含DNA20~400微克范围内，光密度与DNA 的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。
除DNA 外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。
HO CH 2C — CH 2 CHO 蓝色化合物 酸性条件 二苯胺 Oω—羟基—γ酮基戊醛三、材料、试剂和器具 （一）试剂1、DNA 标准溶液：取小牛胸腺DNA 用0.1N 氢氧化钠溶液配制成200微克/毫升的溶液。
2、DNA 样品液：（自己提取）控制其DNA 含量在50~100微克/毫升左右。
3、二苯胺试剂：称取1克结果的二苯胺试剂溶于100毫升分析纯的冰醋酸中，再加入10毫升过氯酸（A.R60%以上）或浓硫酸2.75毫升，混匀备用。
临用前加入1毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。
（二）器具1、试管及试管架2、移液管（1，2，5毫升）3、恒温水浴4、可见光分光光度计四、操作步骤（一）DNA 标准曲线的制作==加毕，摇匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0.D 595nm 值。
）以光密度为纵坐标，DNA 含量（ug/ml ）为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定取2支试管，各加0.2~0.5毫升的待测液（内含DNA 应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。
根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA 的含量，按下式计算出样品中DNA 的百分含量。
DNA 含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数10010)(/(%)6⨯⨯⨯=g DNA 新鲜鲜肝总体积毫升含量产率五、注意事项1、二茉胺法测定DNA 含量灵敏度不高，待测样品中DNA 含量低于50mg/L 即难以测定。
脱氧核糖核酸定量测定——改良二苯胺法一、目的学习用定糖法测定脱氧核糖核酸(DNA)的含量。
二、原理在强酸环境下加热，可以使DNA 中嘌呤碱与脱氧核间的糖苷键断裂。
因而DNA 酸解后生成嘌呤碱基、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸。
脱氧核糖在酸性条件下脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺作用后显示蓝色，在595毫微米有最大吸收。
用二苯胺法测定DNA 含量时灵敏度不高，待测样品中DNA 含量若低于50微克/毫升就难以测定。
如用乙醛增加二苯胺法测DNA 的发色量，并用乙酸戊酯把反应中形成的蓝色产物抽提到有机溶剂相内，如此进行测定灵敏度显著提高。
按此改良二苯胺法，待测样品中DNA 含量在10~150微克/毫升范围内，光密度与DNA 量成正比关系。
样品中含少量RNA不影响测定，而蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛亦能与二苯胺形成各种有色物质，故干扰测定。
三、实验材料，仪器和试剂1、实验材料DNA标准溶液：于分析天平上精确称取纯的鱼精DNA，并以水配成100微克/毫升的溶液(DNA 在水内较难溶，可隔夜配制)。
待测DNA：以水配成约50微克/毫升的溶液。
2、仪器移液管、72型分光光度计、电热恒温水浴箱、温度计3.试剂4%二苯胺冰醋酸溶液：20克二苯胺(分析纯)加少量冰醋酸(分析纯)微热至全部溶解后，再以冰醋酸定容到500毫升，只限当天使用。
0.16%乙醛水溶液:取40%乙醛0.4毫升,加水至100毫升。
20%过氯酸:71.4毫升70%过氯酸(HClO₄,分析纯)加水至250毫升。
乙酸戊酯(化学纯)或乙酸异戊酯(化学纯)。
四、操作步骤1、标准曲线制作按下表在各管内分别加入不同量的100微克/毫升DNA标准溶液，然后每管加水使体积均达2毫升。
向各管加入2毫升20%过氯酸与4毫升4%二苯胺冰醋酸溶液，混匀后再加0.2毫升0.16%乙醛水溶液并充分摇匀。
56₄保温一小时后，流动水冷却，并向各管反应混合液内加2毫升乙酸戊酯，试管加塞，剧烈振摇，使反应生成蓝色物质充分地被抽提到乙酸戊酯相内。
dna浓度测定原理
DNA浓度测定的原理主要有两种：紫外分光光度法和脱氧核糖核酸-二苯胺法。
1. 紫外分光光度法：由于核酸分子（DNA或RNA）含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比。
因此，通过测定不同波长的紫外线吸收值，可以计算出核酸样品的浓度。
此外，通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值
（A260/A280），还可以估计核酸的纯度。
纯的DNA制品的比值为，RNA的比值为。
若比值高于，则可能有RNA污染，低于则有蛋白质污染。
对于很稀的核酸溶液，可用荧光光度法进行测定。
在荧光染料溴化乙锭(EB)插入DNA的碱基对平面之间并与之结合后，DNA样品能在紫外光的激发下产生桔红色荧光。
荧光强度与被结合的EB的量成正比，而被结合的EB 的量又与核酸分子长度和含量成正比。
2. 脱氧核糖核酸-二苯胺法：在酸性环境中，脱氧核糖与二苯胺试剂一起加热会产生蓝色化合物。
生成的蓝色化合物在595nm处有最大吸收值。
此方法测定的是样品中的总磷量，若样品中含有无机磷杂质，需通过对照组扣除无机磷含量。
该方法灵敏度相对较高，但易受蛋白质和核苷酸影响。
这两种方法各有特点，可以根据具体情况选择适合的方法进行DNA浓度测定。
实验12 二苯胺法测定DNA 含量一、目的学习和掌握测定DNA 的定糖法（二苯胺法）的原理和操作技术。
二、原理脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm 处有最大的吸收，在每毫升含DNA20~400微克范围内，光密度与DNA 的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。
除DNA 外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。
HO CH 2C — CH 2 CHO 蓝色化合物 酸性条件 二苯胺 Oω—羟基—γ酮基戊醛三、材料、试剂和器具 （一）试剂1、DNA 标准溶液：取小牛胸腺DNA 用0.1N 氢氧化钠溶液配制成200微克/毫升的溶液。
2、DNA 样品液：（自己提取）控制其DNA 含量在50~100微克/毫升左右。
3、二苯胺试剂：称取1克结果的二苯胺试剂溶于100毫升分析纯的冰醋酸中，再加入10毫升过氯酸（A.R60%以上）或浓硫酸2.75毫升，混匀备用。
临用前加入1毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。
（二）器具1、试管及试管架2、移液管（1，2，5毫升）3、恒温水浴4、可见光分光光度计四、操作步骤（一）DNA 标准曲线的制作==加毕，摇匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0.D 595nm 值。
）以光密度为纵坐标，DNA 含量（ug/ml ）为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定取2支试管，各加0.2~0.5毫升的待测液（内含DNA 应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。
根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA 的含量，按下式计算出样品中DNA 的百分含量。
DNA 含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数10010)(/(%)6⨯⨯⨯=g DNA 新鲜鲜肝总体积毫升含量产率五、注意事项1、二茉胺法测定DNA 含量灵敏度不高，待测样品中DNA 含量低于50mg/L 即难以测定。
二苯胺试剂：鉴定DNA。
二苯胺试剂的配制A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中，再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化，再使用。
B液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制:将0。
1 mL B液加入到10 mL A液中，现配现用。
DNA的粗提取与鉴定实验原理1。
DNA在NaCl溶液中的溶解度,是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
当NaCl的物质的量浓度为0。
14 mol／L时,DNA的溶解度最低。
利用这一原理,可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2。
DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液.利用这一原理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
3.DNA遇二苯胺(沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
注意事项1。
步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入.2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。
实验用具鸡血细胞液（5～10 mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0.1 g／mL 的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol／L和0．015 mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100 mL，1个，50 mL，500 mL，各2个），漏斗，试管(20 mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒(100 mL，1个），纱布，镊子,滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。
实验原理：1。
析出溶解在NaC1溶液中的DNA.2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。
3。
DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色.方法步骤：1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。
5 min2．溶解DNA:3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢4．过滤：取黏稠物5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢.3 min6．过滤：取滤液。
7．提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。
二苯胺试剂：鉴定DNA。
二苯胺试剂的配制A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中，再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化，再使用。
B液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制:将0。
1 mL B液加入到10 mL A液中，现配现用。
DNA的粗提取与鉴定实验原理1。
DNA在NaCl溶液中的溶解度,是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
当NaCl的物质的量浓度为0。
14 mol／L时,DNA的溶解度最低。
利用这一原理,可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2。
DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液.利用这一原理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
3.DNA遇二苯胺(沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
注意事项1。
步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入.2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。
实验用具鸡血细胞液（5～10 mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0.1 g／mL 的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol／L和0．015 mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100 mL，1个，50 mL，500 mL，各2个），漏斗，试管(20 mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒(100 mL，1个），纱布，镊子,滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。
实验原理：1。
析出溶解在NaC1溶液中的DNA.2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。
3。
DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色.方法步骤：1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。
5 min2．溶解DNA:3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢4．过滤：取黏稠物5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢.3 min6．过滤：取滤液。
7．提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。
