复乳法制备载牛血红蛋白纳米微球型血液代用品中表面活性剂_溶剂对包封率和粒径的影响
- 格式：pdf
- 大小：474.09 KB
- 文档页数：6
1( 华东理工大学 , 教育部医用生物材料工程研究中心 , 上海 200237) 2( 上海市科技工 程学院 , 上海 200231) 摘要 在前期研究基础上 , 采用复乳化法制 备载牛血红蛋白 纳米微球型 血液代用 品。免去传统 的匀浆 强力分
散措施 , 通过表面活性剂的加入及溶剂筛选 , 在初乳和复乳步骤均采用较温 和的超声波 分散 , 获得 97% 以 上的高包 封率、 平均粒径约 286 nm 微球。油相中表面活性剂亲水 亲油平衡值对包封率有显著影响 , 且与外水相表 面活性剂 匹配才能获得高的包封率。混合表面活性剂 P olo xamer 188/ Span80 比单一表面活性剂 Span80 能 更稳定乳液 , 提高 包封率。表面活性剂浓度高 , 有利于获得高的包封率和 窄的粒径分 布。但超过一 定量时 , 对包 封率影 响不明 显 , 而 粒径及粒径分散指数增大。溶剂脱除速率适中有利于获得较高的包封率、 较小的粒径和粒径分散指数。 关键词 表面活性剂 R318 08 溶剂 包封率 粒径 A 文章编号 1001 5515( 2009) 01 0116 06 中图分类号 文献标识码径、 PDI 和 EE%
3. 1 油相表面活性剂的影响 3. 1. 1 的影响 由预实验发现 , 油相中不加表面活性剂时, 操作过程中肉眼可见大块的红色 H b 沉降下来, 大 部分 H b 未包封进微球。整个乳液不稳定, 溶剂挥 发完后底部有大量沉淀。分析原因是壳材 PCL 疏 水性强 , 油 水界面张力大。为克服界面张力 , 一般 在初乳 ( W1/ O ) 阶段采用强力分散设备 , 如匀浆机 10 000 r/ min 以 上的输 出功率。由于 W1/ O 阶 段 H b 处于未包封状态 , 容易导致 H b 氧化。我们尝试 加入一定 量的表面 活性剂来 降低油 水 界面张 力。 作为注射用 血代品, 其 表面活性剂选 用原则: # 无 毒 ; ∃ 两种或以上的混合表面活性剂比单一表面活 性剂能配比出 范围较宽 的亲水 亲油 平衡 ( H ydro phile lipophile balance, H L B) 值, 有利于 筛选合 适 的表面活性剂配比。据此我们选用 Span80( H L B= 4. 3) 和 Po loxam er188( H L B= 29) 作为油相混合表 面活性剂, 这两种表面活性剂常被用于制备体内药 物输送 体 系。 固定 表 面 活性 剂 在 油相 中 的 浓 度
世界范围出现血源严重短缺, 血液代用品的研
* 十五 863 纳米专项基金资助项目 ( 2004 A A 302050) ; 上海 市 科委纳米专项基金资助项目 ( 0452nm022) 通讯作者。E mail: liucs@ ecust . edu . cn
第1 期
章晓兰等。
复乳法制备载牛血红蛋白纳米微球型血液代用品中表面活性剂、 溶剂对包封率和粒径的影响
。另外, 相对于天
然红细胞( 直径约 7~ 8 m ) , 小尺寸微球更易穿过 血管狭窄或血栓等原因引起的血管阻塞 , 在中风或 心脏病治疗中显示较强的优势[ 5] , 因此粒径是微球 型血代品制备过程控制的关键因素之一。 近年来 , 复乳化方法包载蛋白/ 药物成为研究热 点。 Cedrat i 等[ 6] 采用复乳法制备载 H b 微囊 , 获得 80% 以 上 的 EE% , 但 微 囊 尺 寸 大, 约 150
Zhang Xiaolan1, 2 Yuan Yuan1 Shan Xiaoqian1 Sheng Yan1 Xu Feng1 Liu Changsheng1
1( Eng inee ri ng R esearc h Ce nter f or Bi ome di cal M at er ial s of M i ni str y of Edu cati on, East Chi na Uni v ersi ty of S ci ence and T echnol og y , Sh anghai 200237, China) 2( S hang hai M ate ri al Eng i neeri ng S chool , Shan ghai 200231, Ch ina)
[ 7]
m。
Meng 等 改变 壳材及溶剂把 微囊尺寸降 到约 10 m 。Chang 研究组获得约 200 nm 的微囊, 但 EE% 低, 只有 13% ~ 29% [ 8] 。诸多研究显示 , EE% 和小 粒径很难兼顾 , EE% 高, 往往粒径大 , 反之, 为了获 得纳米级微囊, 通常采用较强的机械分散措施破碎 乳滴。但乳滴在破碎过程 中, 内含药 物易流失 , 使 EE% 降低。此外强大的机械剪切力易使一些生物 大分子失活、 变性而失去应有的生物功能 , 如 H b 在 强的机械剪切力作用下易氧化而失去携氧 释氧性 能。 本研究组采用改性复乳法制备载牛 H b 纳米微 球型血代品( H bP) , 获得 87 35% 的 EE% 。为减小 粒径 , 在复 乳化步骤 采用 10 000 r/ min 匀浆 3 min 的强力分散 [ 9 ] 。但实验过程发现 , H b 在高强度的 匀浆剪切力作用下, 易氧化使其部分携氧 释氧性能 丧失。鉴于此, 在前研究基础上 , 我们免去匀浆强力 分散措施, 初乳和复乳步骤均采用超声波低输出功 率的温和分散, 力求获得 EE% 高的 H bP。着重考 察了表面活性剂、 溶剂对 EE% 和粒径的影响。
Abstract
On t he basis of prev ious r esear ches, w e hav e prepared Bov ine hemog lo bin loaded nano pa rticles
( H bP ) , using the do uble emulsion metho d. M o re m ild dispersing treatment was emplo yed during the primary and secondary emulsio n; o ver 97% encapsulation efficiency ( EE% ) and an aver age size abo ut 286 nm w ere achieved by u sing sur factants, screening so lvents, as w ell as av oiding the t raditio nal stro ng dispersing process. T he value o f Hy dro phile lipophile balance in oil phase ex erted a signif icant effect o n EE% and led to higher EE% w hen matched wit h the surfactants in outer aqueous phase. W hen compared w ith the so le solvent Span80, the mixed sur factants such as Polox emer188/ Span80 stabilized the emulsion mor e efficiently and incr eased the EE% . T he hig her co ncentration of surfactants resulted in higher EE% and narr ow er size distributio n. But ov er some amo unt, the surfactants had no significant effect on EE% , resulting in la rger size and polydispersity index ( P DI) . T he appro pr iate r emoval r ate of so lv ents contr ibutes to hig her EE% , smaller size and P DI. Key words Surfactant Solv ent Encapsulat ion efficiency Size
2
材料与方法
牛 H b 冻干粉购自上海源聚生物公司。聚己内
酯( P oly[ capro lact one] ( P CL , M w 80 KD) ) 购于 Sig ma A ldrich 公 司。 P olox amer188 购 自 美 国 BASF 公司。 PVA( 聚合度 : 1750 ! 50) , 国药集团化 学试剂有限公司。明胶 , 上海润捷化学试剂有限公 司。其他试剂为国产分析纯。 2. 1 载牛 Hb 纳米微球的制备 采用溶剂扩散 挥发复乳化( W1/ O/ W2) 制备工 艺, 具体实施如下: 内水相 ( W1) : H b 溶于等渗 PBS 缓冲溶液中; 油相 ( O) : 壳材 PCL 与表面活性剂溶 于一定量的 有机溶 剂二氯 甲烷 ( dichlo romet hane,
第 26 卷 第 1 期 2009 年 2 月
生物医学工程学杂志 Journal of Biomedical Engineering
Vol. 26 No. 1 February 2009
复乳法制备载牛血红蛋白纳米微球型血液代用品中 表面活性剂、 溶剂对包封率和粒径的影响*
章晓兰1, 2 袁 媛1 单晓茜1 盛 燕1 徐 锋1 刘昌胜1
117
的载药微球很难达到这种要求, 因此对于血代品只 能做到尽可能延长其血循环停留时间。研究表明, 粒径为纳米级的微球在体内具有隐性颗粒的特征, 能躲避网状内皮系统及单核巨噬细胞吞噬系统的识 别、 清除, 显著延长血循环时间
[ 4]
DCM ) 中 ; 外水相 ( W2) : 0. 5% P VA 或明胶 ( Gelati n) 溶液。0. 5 ml W1 注射到 5ml O 相中 , 27w 超声 波作用 12 s 形成 W1/ O 初乳液。 W2 相分步加入到 W1/ O 中 70 w 超声波作用 12 s 形成 W1/ O/ W2 复 乳液, 然后倾入 200 ml P BS 缓冲溶液 , 搅拌挥发溶 剂。最后离心收集微球, 冻干储存备用。具体制备 工艺过程参见前文研究[ 10] 。 2. 2 包封率 ( Encapsulation Efficiency, EE%) 测定 方法 EE% 是包在微 球中的 H b 量占总投料量 的百 分比, 是表 征制备 效率的 重要指 标, 可按式 : EE% = ( H b 总投料量 - H b 游离 ) / H b总投料量 ∀ 100% 计算。其 中 H b 总投料量 为 H b 投料总量 , H b 游离 则是离心后上清 液中游离的未被包埋的 H b 量。由于悬浮液或离心 后的上清液中助剂的干扰, 无法直接用分光光度法 定量 H b 。根据每个 H b 分子含 4 个铁原子的定量 关系, 借鉴临床上硫氰酸钾法测定血清铁的方法来 提取 H b 中的铁原子从而间接定量 H b [ 10] 。 2. 3 粒径测定 把冻干微球悬浮在等渗 P BS 缓冲溶液 , 采用纳 米粒度及 ZET A 电位分析 仪 ( Zet asizer Nano ZS, M alvern Inst rum ent s) 测定平均粒径及粒径分散指 数 ( Po lydispersit y index, PDI) 。
散措施 , 通过表面活性剂的加入及溶剂筛选 , 在初乳和复乳步骤均采用较温 和的超声波 分散 , 获得 97% 以 上的高包 封率、 平均粒径约 286 nm 微球。油相中表面活性剂亲水 亲油平衡值对包封率有显著影响 , 且与外水相表 面活性剂 匹配才能获得高的包封率。混合表面活性剂 P olo xamer 188/ Span80 比单一表面活性剂 Span80 能 更稳定乳液 , 提高 包封率。表面活性剂浓度高 , 有利于获得高的包封率和 窄的粒径分 布。但超过一 定量时 , 对包 封率影 响不明 显 , 而 粒径及粒径分散指数增大。溶剂脱除速率适中有利于获得较高的包封率、 较小的粒径和粒径分散指数。 关键词 表面活性剂 R318 08 溶剂 包封率 粒径 A 文章编号 1001 5515( 2009) 01 0116 06 中图分类号 文献标识码径、 PDI 和 EE%
3. 1 油相表面活性剂的影响 3. 1. 1 的影响 由预实验发现 , 油相中不加表面活性剂时, 操作过程中肉眼可见大块的红色 H b 沉降下来, 大 部分 H b 未包封进微球。整个乳液不稳定, 溶剂挥 发完后底部有大量沉淀。分析原因是壳材 PCL 疏 水性强 , 油 水界面张力大。为克服界面张力 , 一般 在初乳 ( W1/ O ) 阶段采用强力分散设备 , 如匀浆机 10 000 r/ min 以 上的输 出功率。由于 W1/ O 阶 段 H b 处于未包封状态 , 容易导致 H b 氧化。我们尝试 加入一定 量的表面 活性剂来 降低油 水 界面张 力。 作为注射用 血代品, 其 表面活性剂选 用原则: # 无 毒 ; ∃ 两种或以上的混合表面活性剂比单一表面活 性剂能配比出 范围较宽 的亲水 亲油 平衡 ( H ydro phile lipophile balance, H L B) 值, 有利于 筛选合 适 的表面活性剂配比。据此我们选用 Span80( H L B= 4. 3) 和 Po loxam er188( H L B= 29) 作为油相混合表 面活性剂, 这两种表面活性剂常被用于制备体内药 物输送 体 系。 固定 表 面 活性 剂 在 油相 中 的 浓 度
世界范围出现血源严重短缺, 血液代用品的研
* 十五 863 纳米专项基金资助项目 ( 2004 A A 302050) ; 上海 市 科委纳米专项基金资助项目 ( 0452nm022) 通讯作者。E mail: liucs@ ecust . edu . cn
第1 期
章晓兰等。
复乳法制备载牛血红蛋白纳米微球型血液代用品中表面活性剂、 溶剂对包封率和粒径的影响
。另外, 相对于天
然红细胞( 直径约 7~ 8 m ) , 小尺寸微球更易穿过 血管狭窄或血栓等原因引起的血管阻塞 , 在中风或 心脏病治疗中显示较强的优势[ 5] , 因此粒径是微球 型血代品制备过程控制的关键因素之一。 近年来 , 复乳化方法包载蛋白/ 药物成为研究热 点。 Cedrat i 等[ 6] 采用复乳法制备载 H b 微囊 , 获得 80% 以 上 的 EE% , 但 微 囊 尺 寸 大, 约 150
Zhang Xiaolan1, 2 Yuan Yuan1 Shan Xiaoqian1 Sheng Yan1 Xu Feng1 Liu Changsheng1
1( Eng inee ri ng R esearc h Ce nter f or Bi ome di cal M at er ial s of M i ni str y of Edu cati on, East Chi na Uni v ersi ty of S ci ence and T echnol og y , Sh anghai 200237, China) 2( S hang hai M ate ri al Eng i neeri ng S chool , Shan ghai 200231, Ch ina)
[ 7]
m。
Meng 等 改变 壳材及溶剂把 微囊尺寸降 到约 10 m 。Chang 研究组获得约 200 nm 的微囊, 但 EE% 低, 只有 13% ~ 29% [ 8] 。诸多研究显示 , EE% 和小 粒径很难兼顾 , EE% 高, 往往粒径大 , 反之, 为了获 得纳米级微囊, 通常采用较强的机械分散措施破碎 乳滴。但乳滴在破碎过程 中, 内含药 物易流失 , 使 EE% 降低。此外强大的机械剪切力易使一些生物 大分子失活、 变性而失去应有的生物功能 , 如 H b 在 强的机械剪切力作用下易氧化而失去携氧 释氧性 能。 本研究组采用改性复乳法制备载牛 H b 纳米微 球型血代品( H bP) , 获得 87 35% 的 EE% 。为减小 粒径 , 在复 乳化步骤 采用 10 000 r/ min 匀浆 3 min 的强力分散 [ 9 ] 。但实验过程发现 , H b 在高强度的 匀浆剪切力作用下, 易氧化使其部分携氧 释氧性能 丧失。鉴于此, 在前研究基础上 , 我们免去匀浆强力 分散措施, 初乳和复乳步骤均采用超声波低输出功 率的温和分散, 力求获得 EE% 高的 H bP。着重考 察了表面活性剂、 溶剂对 EE% 和粒径的影响。
Abstract
On t he basis of prev ious r esear ches, w e hav e prepared Bov ine hemog lo bin loaded nano pa rticles
( H bP ) , using the do uble emulsion metho d. M o re m ild dispersing treatment was emplo yed during the primary and secondary emulsio n; o ver 97% encapsulation efficiency ( EE% ) and an aver age size abo ut 286 nm w ere achieved by u sing sur factants, screening so lvents, as w ell as av oiding the t raditio nal stro ng dispersing process. T he value o f Hy dro phile lipophile balance in oil phase ex erted a signif icant effect o n EE% and led to higher EE% w hen matched wit h the surfactants in outer aqueous phase. W hen compared w ith the so le solvent Span80, the mixed sur factants such as Polox emer188/ Span80 stabilized the emulsion mor e efficiently and incr eased the EE% . T he hig her co ncentration of surfactants resulted in higher EE% and narr ow er size distributio n. But ov er some amo unt, the surfactants had no significant effect on EE% , resulting in la rger size and polydispersity index ( P DI) . T he appro pr iate r emoval r ate of so lv ents contr ibutes to hig her EE% , smaller size and P DI. Key words Surfactant Solv ent Encapsulat ion efficiency Size
2
材料与方法
牛 H b 冻干粉购自上海源聚生物公司。聚己内
酯( P oly[ capro lact one] ( P CL , M w 80 KD) ) 购于 Sig ma A ldrich 公 司。 P olox amer188 购 自 美 国 BASF 公司。 PVA( 聚合度 : 1750 ! 50) , 国药集团化 学试剂有限公司。明胶 , 上海润捷化学试剂有限公 司。其他试剂为国产分析纯。 2. 1 载牛 Hb 纳米微球的制备 采用溶剂扩散 挥发复乳化( W1/ O/ W2) 制备工 艺, 具体实施如下: 内水相 ( W1) : H b 溶于等渗 PBS 缓冲溶液中; 油相 ( O) : 壳材 PCL 与表面活性剂溶 于一定量的 有机溶 剂二氯 甲烷 ( dichlo romet hane,
第 26 卷 第 1 期 2009 年 2 月
生物医学工程学杂志 Journal of Biomedical Engineering
Vol. 26 No. 1 February 2009
复乳法制备载牛血红蛋白纳米微球型血液代用品中 表面活性剂、 溶剂对包封率和粒径的影响*
章晓兰1, 2 袁 媛1 单晓茜1 盛 燕1 徐 锋1 刘昌胜1
117
的载药微球很难达到这种要求, 因此对于血代品只 能做到尽可能延长其血循环停留时间。研究表明, 粒径为纳米级的微球在体内具有隐性颗粒的特征, 能躲避网状内皮系统及单核巨噬细胞吞噬系统的识 别、 清除, 显著延长血循环时间
[ 4]
DCM ) 中 ; 外水相 ( W2) : 0. 5% P VA 或明胶 ( Gelati n) 溶液。0. 5 ml W1 注射到 5ml O 相中 , 27w 超声 波作用 12 s 形成 W1/ O 初乳液。 W2 相分步加入到 W1/ O 中 70 w 超声波作用 12 s 形成 W1/ O/ W2 复 乳液, 然后倾入 200 ml P BS 缓冲溶液 , 搅拌挥发溶 剂。最后离心收集微球, 冻干储存备用。具体制备 工艺过程参见前文研究[ 10] 。 2. 2 包封率 ( Encapsulation Efficiency, EE%) 测定 方法 EE% 是包在微 球中的 H b 量占总投料量 的百 分比, 是表 征制备 效率的 重要指 标, 可按式 : EE% = ( H b 总投料量 - H b 游离 ) / H b总投料量 ∀ 100% 计算。其 中 H b 总投料量 为 H b 投料总量 , H b 游离 则是离心后上清 液中游离的未被包埋的 H b 量。由于悬浮液或离心 后的上清液中助剂的干扰, 无法直接用分光光度法 定量 H b 。根据每个 H b 分子含 4 个铁原子的定量 关系, 借鉴临床上硫氰酸钾法测定血清铁的方法来 提取 H b 中的铁原子从而间接定量 H b [ 10] 。 2. 3 粒径测定 把冻干微球悬浮在等渗 P BS 缓冲溶液 , 采用纳 米粒度及 ZET A 电位分析 仪 ( Zet asizer Nano ZS, M alvern Inst rum ent s) 测定平均粒径及粒径分散指 数 ( Po lydispersit y index, PDI) 。
