影响牛非手术法活体采卵效果因素的分析

影响牛非手术法活体采卵效果因素的分析

胡文举

【摘 要】Non-operation method of ovum pick-up combined with in vitro

fertilization and embryo transfer technology can fully utilize breeding

potential of thoroughbred cow, and also can enlarge for cows with genital

tract diseases, as well as make fully use of variety resources. Ovum pick-up

can provide nessary material for nuclear transfer, transgenosis and

embryonic stem cell transplantation. This paper summarized the effects of

age, estrus cycle, non-operation method ovum pick-up on bovine non-

operation method ovum pick-up, through exploring more effective ovum

pick-up program and method, which provided basis for improving

productivity of non-operation method ovum pick-up.%利用非手术法活体采卵技术结合体外受精技术和胚胎移植技术,能够更大限度的发挥良种母牛的繁殖潜力,并能够用于患有生殖道疾病良种母牛的扩繁,使良种资源得以充分利用;通过活体采卵技术还可以为核移植、转基因、胚胎干细胞移植等生物工程技术提供必要的材料。本文综述了年龄、发情周期、非手术法活体采卵方法等五个方面对牛非手术法活体采卵效果的影响,为探索更加有效的活体采卵程序和方法,提高非手术法活体采卵的生产效率提供依据。

【期刊名称】《畜牧兽医杂志》

【年(卷),期】2012(031)006

【总页数】4页(P29-32) 【关键词】牛;活体采卵;发情周期;外源激素

【作 者】胡文举

【作者单位】河南广播电视大学,河南郑州450008

【正文语种】中 文

【中图分类】S814.8

用非手术法活体采卵技术结合体外受精技术和胚胎移植技术，能够更大限度的发挥良种母牛的繁殖潜力，并能够用于患有生殖道疾病良种母牛的扩繁，使良种资源得以充分利用。通过活体采卵技术还可以为核移植、转基因、胚胎干细胞移植等生物工程技术提供必要的材料。目前，非手术法活体采卵技术主要应用在牛、水牛、马等大型家畜，但由于该技术卵母细胞采集率低、对动物伤害较大以及对操作人员和设备要求较高等原因，在实际生产中应用相对较少。本文从多个方面分析了影响牛非手术法活体采卵效果的因素。

1 年龄因素

牛在胎儿时期就有卵泡发生，在怀孕晚期的胎儿卵巢上就可检测到有腔卵泡的存在，犊牛2月龄时直径3mm的有腔卵泡数目最大可达到50个。Armstrang等利用激素处理2月龄犊牛后发现，卵泡发育数量随供犊牛周龄增加而显著增加。赵鹏（2010）等对16周龄和8周龄犊牛进行了激素处理，结果显示，16周龄左右犊牛平均获得可用卵数显著高于8周龄犊牛平均获得可用卵数。采用青年奶牛作供体活体采集卵母细胞，可充分利用青年奶牛的发育期，减少对成年母奶牛产犊和产奶的影响，同时青年奶牛卵母细胞发育能力较强，体外培养发育率较高。年龄对活体采卵效果的影响在奶牛已有报道，但结果不完全一致。周木青（2003）等的研究结果表明，青年奶牛、成年奶牛平均获取的可用卵数差异不显著，但卵母细胞的体外成熟率、体外受精率、受精卵囊胚率青年奶牛均高于成年奶牛。与苏雷等（2002）报道结论相似。而Bungartz等（1995）报道成年牛平均卵泡数多于老年牛和青年牛，从青年母牛卵巢上采集的卵泡数、卵母细胞的回收率、卵母细胞可用率以及体外成熟率、体外受精率、受精卵囊胚率均明显低于成年母牛。倪和民（1999）等的研究也得出了类似的结论，其对青年母牛和成年母牛进行活体采卵，每周一次青年母牛平均获卵2.4枚，成年1.9枚；每周两次青年4.4枚，成年5.4枚，差异显著。

2 发情周期

在牛的一个发情周期中，卵巢上不断有大量卵泡发育，但这些卵泡发育到一定阶段即发生闭锁，只有在最后一批开始发育的卵泡中才有一个发育成熟并排卵。一般认为一个发情周期中有3～4个卵泡波发育，以3个卵泡发育波为主，在一个发情周期中不同的卵泡发育波，卵泡的发育程度和多少也不完全一样。因此，在发情期的不同时期采卵，获得的卵母细胞数也不同，但是，对于哪一阶段采集的卵泡数最多，目前还没有定论。Pieterse等（1991）发现，母牛发情后第3或4d采集到的卵泡数明显多于第9或l0d以及第15或16d采集到的卵泡数。而倪和民（1999）等研究认为黑白花奶牛发情开始的第1天进行采卵，卵巢上可供采集的卵泡及采集的卵母细胞比发情周期中其他时间采集的卵母细胞多，且发情开始前后的卵巢有较多卵泡生长发育。而朱化彬等对24头奶牛进行活体采卵研究，发现发情周期的第7d和7～15d采集到的卵母细胞数均显著高于发情当天。

3 非手术活体采卵的方法

目前非手术法活体采卵主要有盲采法、内窥镜采卵法和B超引导采卵法三种。盲采法是通过直肠把握卵巢，凭手的感觉，利用采卵器对卵泡进行穿刺回收。盲采法完全依赖操作者的经验，对操作者技术熟练程度要求较高，并且对卵巢和阴道损伤较大。由于无法看到卵巢卵巢上的卵泡，只能凭手感，隔着直肠感觉卵巢表面的卵泡，所以穿刺刺中卵泡的效率较低，并且凭感觉进行穿刺容易遗漏较小的卵泡，造成卵母细胞的回收率偏低。卢晟盛等报道，利用自制采卵器，盲采法采集卵母细胞，每头牛每次平均获得1.5枚卵母细胞；朱化彬等用盲采法采集卵母细胞，回收率为49.2%，每头牛每次平均获得6.4枚卵母细胞。两者卵母细胞采集效果差异较大，可能和供体牛本身健康情况及操作者熟练程度有关。盲采法由于凭感觉进行穿刺卵泡，在穿刺过程中必然会对卵巢皮质造成损伤，卵巢恢复需要一定的时间，因此造成采卵间隔的延长，严重的可引起供体牛的繁殖障碍。

内窥镜法是通过直肠把握，经阴道穹窿穿刺，将内窥镜置于腹腔中，在内窥镜显示图像的引导下进行卵泡穿刺。该方法可直观，清晰地观察卵巢上的卵泡，观察到的卵泡越多，采集到的卵母细胞也相应的多，卵母细胞的回收率可达75%，与利用屠宰牛卵巢获取卵母细胞的回收率相当。而且利用内窥镜引导穿刺针穿刺卵泡，可以最大限度的提高穿刺的成功率，减少穿刺过程中对卵巢皮质的损伤，缩短采卵时间间隔。倪和民等应用内窥镜，每周2次对供体牛进行穿刺，每次平均获取卵母细胞5.4枚。同时研究还表明，应用内窥镜进行采卵时，对阴道穹窿造成的损伤，一般2～3d即可恢复。内窥镜法由于设备比较昂贵，对供体牛阴道穹窿损伤较大等原因，限制了该技术的广泛应用。

自1988年Pieterse等首次成功利用B超引导活体采卵法，经子宫壁采集牛卵母细胞以来，经过近几十年的不断改进，在牛上获得了广泛的应用，目前已成为牛活体采卵的主要方法。B超引导活体采卵法主要是利用卵泡和卵巢生其他组织对高频声波的吸收和反射能力不同，在荧屏上显示卵巢横截面图像，操作者根据图像，利用穿刺针通过阴道穹窿进行穿刺，抽吸获取卵母细胞。利用B超引导活体采卵操作快捷，一般20min可以采完一头母牛，并且采卵过程对母牛生殖道损伤较小，采卵后供体卵巢无粘连，无生殖道异常。Looney等对超声波导向法采集的5 986枚卵子进行体外受精后，分裂率为44.7%，可移植的胚胎率为16.4% ，胚胎移植怀孕率为40%。徐照学等应用B超导引法进行活体采卵，卵母细胞回收率为53.9%，头均获卵子6.1枚欣，卵裂率和囊胚发育率分别为75.2%和29.7%。马晓宁等的研究也获得了53.5%的卵母细胞回收率，每头牛每次获卵6.1枚，卵裂率为75%，囊胚率为40.4%。

4 活体采卵的频率

牛活体采卵的频率必须考虑两个问题，一是牛生殖道和卵巢创伤在进行下一次采卵时应基本恢复正常；二是采卵时卵巢上应有重新发育起来的可采卵泡。Pieterse等和Fujitani等对经过反复活体采卵的牛屠宰后观察发现，虽然卵巢出血和穿刺痕迹清晰可见，但卵巢与周围组织没有发生粘连，也没有发生卵巢囊肿等生殖疾病。此外，反复采卵的牛在采卵停止后，能很快发情并经人工授精而妊娠，也没有发生乳房炎。倪和民的研究也认为，虽然应用内窥镜进行采卵时，对阴道弯窿造成的创伤大，但只要不发生感染，一般经过2～3d即可恢复原状。但是长期高频率的进行活体采卵可能对牛的卵巢产生永久损伤。周兴海的研究认为，连续的长期的穿刺，会使一些供体牛会卵巢囊肿，进而干扰供体牛的内分泌系统，致使发情周期改变，发情程度减弱。倪和民等1998年对3头杂交黄牛进行了约半年左右时间的活体卵母细胞的采集。采集次数分别为138，63，104次。后将其屠宰后对卵巢进行观察，可见被膜增厚并包埋有脂肪层，经组织切片发现，采集次数越多者卵巢被膜增厚越严重，脂肪细胞明显增多，卵巢皮质部范围缩小，髓质部范围增加，卵巢皮质部卵泡数量明显减少，卵泡萎缩并且周围包围有大量的结缔组织，且有部分脂肪细胞浸润。

牛一个发情周期中一般有3～4个卵泡波，即发情后3～4d，9～10d，15～16d为卵泡发育成熟高峰期，3～4d的卵泡数明显多于9～l0d，15～16d的卵泡数。每周一次采卵，所获得的卵母细胞主要来自卵泡波中第7d的卵泡。此时卵巢上已有优势卵泡，优势卵泡的存在将使其余非优势卵泡处于闭锁早期，但是Salamone

D F等研究认为闭锁早期的卵泡仍具有较强体外胚胎形成能力。因此，徐照学研究认为发情后每隔7d重复采集卵母细胞较为合理。周兴海的研究认为，间隔5d采卵，卵母细胞均处于生长阶段，穿刺取出时，细胞内积累的能量物质不充分，因而卵母细胞发育能力较低。间隔10d采卵，卵泡已经处于晚期闭锁阶段，卵母细胞开始凋亡，会影响其发育能力。因而间隔7d采卵可获得较优质的卵母细胞。活体采卵后间隔3～4d，卵巢上就有可供采集的大量卵泡重新生长发育起来。倪和民等利用内窥镜进行采卵结果，青年母牛每周采卵1次，每周平均可获得2.4枚卵母细胞，每周2次可获得4.4枚，成年母牛每周1次采卵可获得1.9枚，每周2次可获得5.4枚，两者之间有极显著的差异，Gibbons等研究认为，按照1次／周和2次／周的频率进行活体采卵，头均获卵数和回收率差异不显著，但2次／周获得的卵母细胞质量比较高，经体外受精可获得较多可用胚。采用B型超声波方法对水牛进行活体采卵，对阴道弯窿和卵巢有一定创伤，但是恢复较快，不影响卵泡的正常发生和发育，间隔3d采卵1次是可行的，安全有效。采卵间隔时间还与奶牛的营养状况，卵巢机能等有关，而且随着高频率重复采卵次数的增加，卵巢上卵泡数量呈减少趋势，且不正常的卵母细胞有增加的趋势。因此，对牛连续采卵的次数与采卵的时间间隔和牛的个体状况，操作技术等均有关系，不可一概而论。

5 外源激素

外源激素可促进卵巢卵泡发育，使大卵泡数增多利于采卵，卵母细胞的回收率和质量也相应提高。但是外源性激素增加获卵数量和质量与动物接受外源激素的程序、时间、剂量等有关。Pieterse等（1988）在黄体期用PMSG处理供体母牛，2d后卵巢变大，直径为2～10mm的卵泡较多而利于采卵，卵母细胞的回收率是未处理组的2倍。刘长彬等（2008）利用FSH处理奶牛后进行活体采卵，平均获卵数处理组为8.56枚，显著高于未处理组4.50枚，优质卵母细胞率差异不显著。苏