Trizol法提取RNA实验步骤与原理(新手详细注释版)

Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（in DEPC-treated water)RNase free水或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC是为了减少RNase 的降解) to 0.01% (v/v)。

静置过夜，然后高压灭菌。

0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]1、组织匀浆(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。

(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。

(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。

2、相分离加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心12,000× g，15 minutes ，2 - 8°C。

离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。

RNA 只存在于水相中。

水相占总TRIZOL的60%。

3、RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 rpm ，10 minutes，2 - 8°C。

离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。

4、RNA洗涤去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。

5、RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。

注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。

Trizol法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。

RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。

Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 Eppendorf管（RNase-free）、 Tips （RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。

它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。

用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。

它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。

RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。

一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。

取RNase-free的物品时必须戴手套。

1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。

对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。

处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为%。

注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。

2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

3）在通风柜中室温处理过夜。

4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。

5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。

置于干净处备用。

2、璃玻和金属物品250°C烘烤3小时以上。

四、从组织中提取总RNA1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。

Trizol 法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。

RNA 质量的高低常常影响 cDNA 库， RT-PCR和 Northern Blot等分子生物学实验的成败。

Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf 管（ RNase-free）、 Tips（ RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致 RNA 降解最主要的物质。

它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。

用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase 完全失活。

它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。

RNase 的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。

用用 DEPC配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。

取时必须戴手套。

一般情况下采RNase-free 的物品1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明 RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。

对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。

处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入 DEPC使 DEPC的终浓度为 0.1%。

注意： DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。

2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC 水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

3）在通风柜中室温处理过夜。

4）将 DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已 DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少 30 分钟。

5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。

置于干净处备用。

2、璃玻和金属物品250°C 烘烤 3 小时以上。

Trizoｌ法使用步骤一、分离纯化得基本原理研究基因得表达与调控时常常要从组织与细胞中分离与纯化ＲＮA。

ＲNA质量得高低常常影响cＤNA库,ＲT-PCＲ与Ｎorthern Ｂloｔ等分子生物学实验得成败。

Ｔrizol就是一种新型总ＲNＡ抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出得核酸酶。

二、用户需自备得试剂与材料无水乙醇、氯仿、Ｇlycｏgen(可能需要)、 1、５ｍｌ Eppeｎｄｏrf管(ＲNase-frｅe)、 Tips(ＲNase－free)三、准备工作RNａse酶非常稳定,就是导致ＲNＡ降解最主要得物质。

它在一些极端得条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。

用常规得高温高压蒸气灭菌方法与蛋白抑制剂都不能就是ＲＮase完全失活。

它广泛存在于人得皮肤上,因此,在与RＮA制备有关得分子生物学实验时,必须戴手套。

RNase得又一污染源就是取液器,根据取液器制造商得要求对取液器进行处理。

一般情况下采用用ＤEPC（焦炭酸二磷脂,一种ＲＮａse抑制剂)配制得7０％乙醇擦洗取液器得内部与外部,基本达到要求。

取ＲＮａｓｅ－free得物品时必须戴手套。

1、料制品得处理尽可能使用无菌,一次性塑料制品，已标明RNasｅ-Fｒee 得塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。

对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。

处理步骤如下:1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEＰＣ使DEＰC得终浓度为０、1%。

注意:DEP Ｃ为剧毒物,活性很强，小心在通风柜中使用。

2)处理得塑料制品放入一个可以高温灭菌得容器中,注入ＤEPC水溶液,使塑料制品得所有部分都浸泡到溶液中。

3)在通风柜中室温处理过夜。

4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已ＤEＰＣ水处理过得塑料制品得烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。

5）烘箱用合适得温度烘拷至干燥。

置于干净处备用。

2、璃玻与金属物品250°C烘烤3小时以上。

Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（in DEPC-treated water)RNase free水或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。

静置过夜，然后高压灭菌。

0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]1、组织匀浆(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。

(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。

(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。

2、相分离加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心12,000× g，15 minutes ，2 - 8°C。

离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。

RNA只存在于水相中。

水相占总TRIZOL的60%。

3、RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 × g ，10 minutes，2 - 8°C。

离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。

4、RNA洗涤去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。

5、RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。

注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。

Trizolxx使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCF和Northern Blot等分子生物学实验的成败。

Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen （可能需要）、 1.5ml Eppendof管（RNase- free ）、Tips（RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。

它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。

用常规的咼温咼压蒸气火菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。

它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。

RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。

一般情况下采用用DEPC焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂）配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。

取RNase-free的物品时必须戴手套。

1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。

对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。

处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。

注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。

2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

3）在通风柜中室温处理过夜。

4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。

5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。

置于干净处备用。

2、璃玻和金属物品烘烤3小时以上。

四、从组织中提取总RNA1）液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。

Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)一、实验步骤1. 涂布区域准备- 确保实验室台面干净整洁，并消毒工作区域。

- 准备所需的试剂和材料，包括Trizol试剂、异丙醇、70%乙醇、无菌乙酸纯水等。

2. 细胞样本处理- 从培养皿中收集所需的细胞样本，注意避免污染。

- 使用无菌PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基和细胞碎片。

- 加入适量的Trizol试剂至细胞样本中，充分悬浮细胞。

- 注意：为了保护RNA的完整性，在细胞样本处理过程中尽量迅速操作，避免长时间接触Trizol试剂。

3. 提取RNA- 将含有细胞样本和Trizol试剂的混合物转移到无菌离心管中。

- 加入适量的氯仿，摇匀混合，并静置15分钟，使混合物体相分离。

- 低速离心10分钟，将上层的无色透明液体转移到新的无菌离心管中。

4. 分离RNA- 加入等体积的异丙醇，轻轻倾斜离心管，使RNA沉淀形成。

- 低速离心10分钟以沉淀RNA，上清液中通常含有DNA。

- 倒掉上清液，并加入70%乙醇洗涤RNA沉淀，轻轻颠倒离心管以洗涤RNA。

- 低速离心5分钟，倒掉乙醇。

5. 干燥RNA- 用洗涤过的无菌乙酸纯水溶解RNA沉淀，轻轻颠倒离心管以溶解RNA。

- 将溶解的RNA转移至无菌离心管中。

- 在室温或37摄氏度下迅速干燥RNA，避免长时间曝露。

6. 储存RNA- 使用RNase-free水溶解RNA沉淀，测定RNA的浓度和纯度。

- 分配等量的RNA至多个RNase-free离心管中，储存在-80摄氏度的冰箱中。

二、实验原理Trizol法是一种常用于提取RNA的方法，其原理如下：1. 细胞破裂- Trizol试剂能够迅速破坏细胞膜，使细胞释放出RNA。

- Trizol试剂中含有酚和氯仿，酚用于破坏脂质，氯仿用于改变混合物的密度，从而使RNA与其他细胞成分分离。

2. 分离RNA- 经过破裂后，细胞内的DNA、RNA和蛋白质等成分被混合在一起，形成上清液。

trizol法提取rna的原理
Trizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理基于三种物质的作用：酚、异硫氰酸盐和氯仿。

这三种物质能够分别破坏细胞膜、蛋白质和DNA，从而将RNA释放出来。

具体步骤如下：
1. 细胞样品裂解
将细胞样品加入Trizol试剂中，通过离心等方式使细胞裂解，并释放出RNA。

2. 蛋白质沉淀
加入氯仿并离心，使细胞蛋白质沉淀到底部形成一个有机相。

3. RNA沉淀
将上层的水相转移至新管中，并加入异硫氰酸盐。

异硫氰酸盐能够溶解RNA，使其在水相中存在。

4. RNA纯化
通过离心等方式将RNA从水相中分离出来，并使用乙酸等试剂对其进行纯化和去除杂质。

最终得到的RNA可以用于后续实验，如逆转录PCR、Northern blotting等。

需要注意的是，在Trizol法提取RNA时要严格控制操作条件，避免污染和失去RNA。

同时也需要对不同类型的样品进行优化，以获得最佳的RNA提取效果。

Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)RNA提取是一种常用的实验技术，它可以用于研究基因表达、蛋白质合成等方面。

而Trizol法是一种常用的RNA提取方法，下面我将详细介绍该方法的实验步骤及原理。

一、实验材料和设备1. 细胞样本：如洋葱、酵母等植物或动物细胞；2. Trizol试剂盒：包括Trizol reagent、DMEM/F12培养基、异丙醇、氯仿等试剂。

3. 离心机：用于分离细胞和RNA;4. 紫外分光光度计：用于测定RNA的浓度和纯度。

二、实验步骤1. 取适量的细胞样本，加入适量的DMEM/F12培养基中，用离心机离心去除细胞碎片和杂质。

2. 将上清液转移到新的管子中，加入2 mL异丙醇，轻轻摇匀，使其与细胞充分混合。

3. 加入1 mL Trizol reagent,混匀后室温下静置10 min;4. 离心管中液体分为4层，从上往下分别是黄色(含有RNA)、白色(含有蛋白质)、透明(上清液)和红色(含有DNA)。

取出黄色层进行下一步处理。

5. 用吸头将黄色层的RNA吸取到一个新的试管中，加入适量的氯仿，轻轻摇匀。

6. 离心试管，将RNA和氯仿分离。

7. 用吸头将上层的白色RNA溶液吸出一部分，加入等量的异丙醇，混匀后离心。

8. 将上清液倒掉，留下含RNA的沉淀物。

9. 用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度。

三、实验原理Trizol法提取RNA的原理是利用Trizol reagent中的Trizol和氯仿对细胞进行裂解，使RNA释放出来。

具体来说，Trizol reagent中的Trizol是一种有机溶剂，它能够破坏细胞膜并将细胞内的RNA溶解在水中。

而氯仿则是一种脂溶性溶剂，它能够与RNA结合形成复合物，使得RNA更容易被提取出来。

在实验过程中，首先加入异丙醇的作用是破坏细胞膜，使RNA更容易释放出来。

然后加入Trizol reagent,使其与细胞充分混合并裂解细胞。

Trizol法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。

RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。

Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 Eppendorf管（RNase-free）、 Tips （RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。

它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。

用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。

它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。

RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。

一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。

取RNase-free的物品时必须戴手套。

1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。

对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。

处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为%。

注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。

2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

3）在通风柜中室温处理过夜。

4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。

5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。

置于干净处备用。

2、璃玻和金属物品250°C烘烤3小时以上。

四、从组织中提取总RNA1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。

Trizol 法提取RNA(赵桂红)一、准备工作：1、严格戴好口罩，手套。

2、实验所涉及的移液器杆，电泳槽，实验台面等均需75%的酒精处理，凝胶槽和梳子均需DEPC水浸泡。

3、准备试剂：Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇（DEPC水配制），RNase-Free水。

二、DEPC水的配制：配1L的DEPC处理水，加1mlDEPCA（共配8L）。

烧杯中放入转子，磁力搅拌器搅拌过夜。

第二天分装在培养瓶高压蒸汽灭菌（121℃,25min）（DEPC分解成CO2和乙醇）。

三、50×TAE 缓冲液(PH8.5)的配制组分浓度：2 M Tris-醋酸、100 mM EDTA配制量：1L配制方法：①称量下列试剂，置于1L烧杯②向烧杯中加入800ml去离子水，充分搅拌溶解③加入57.1ml的醋酸，充分搅拌④加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存五、植物材料的研磨1、将酒精倒入研钵点燃灼烧灭菌，重复三次(准备一个湿抹布)。

2、将离心管放入液氮，速冻，以防粘壁。

3、取0.1g幼嫩植物体放入研钵，倒入液氮速冻，待液氮将要挥发完时，迅速研磨。

4、从液氮中取出离心管，将研磨好的材料分装，再放入液氮六、RNA的提取：1、向装有研磨好的材料的离心管立即加入1ml的Trizol试剂(使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性)。

2、涡旋数秒，在4℃、12000×g条件下离心10min。

3、离心后将上清液转移至新离心管中。

（上层如出现脂质层，将其移去）4、加200µl的氯仿（有效的使有机相和无机相迅速分离），盖上盖子，涡旋15s，室温放置2-3min。

5、在4℃、12000×g条件下离心15min。

（一般分层，下层红色，中间交换层，及上清，上清一般占总体积50%）6、吸上清液移至新离心管。

（避免吸入中间层和下层）7、加500µl异丙醇（沉淀RNA），室温放置10min。

1.研磨制样：先向研钵中加入少量液氮，等液氮挥发使研钵预冷。

再向研钵内倒入适量液氮。

从-70度冰箱取出组织，用镊子从冻存管中夹取一小块放入研钵中。

迅速研磨组织块，成粉末时加入1ml的trizol，继续研磨，可看到粉末成浆，由浓变稀，直至组织样全部溶解，用移液枪吸到无酶EP管。

2. Trizol法提取RNA
1) 室温静置3-10min，使蛋白质变性；
2) 加入1/4~1/5体积的氯仿，颠倒震荡1min，室温静置3-5min，静置分层，然后4℃离心，12000rpm，5min。

（核蛋白复合体彻底裂解）
3) 吸取上清至无酶的EP管中，加入等体积的酚：氯仿，颠倒震荡1min，室温静置3-5min，静置分层，然后4℃离心，12000rpm，5min，取上清。

若是细胞RNA提取可只加等体积氯仿抽提一次，但对于组织一般都要重复该步骤，至没有蛋白层为止，一般抽提两次。

（离心后会分为三次：上层：水相，中间层：DNA，下层：蛋白。

为了降低水相和有机相分界处DNA污染，不要吸取水相的最下层）4) 加入等体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，冰上静置30min，然后4℃离心12000rpm，30min，弃上清。

（此步骤主要是充分沉淀RNA，然后收集。

故步骤中的冰置30min,也可以是在-20°放置半小时以上，甚至过夜）
5) 加入100ul 70%乙醇，将沉淀吹起来，注意不要吹散，然后4℃12000rpm，5min。

6) 弃上清，空气中挥发乙醇，至壁上无液滴。

7) 加入适量DEPC水，（一般为20ul）溶解。

8) 分光光度计检测RNA浓度和OD值，将Total RNA稀释至1ug/ul，备用。

Trizol法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。

RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。

Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 Eppendorf管（RNase-free）、 Tips （RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。

它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。

用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。

它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。

RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。

一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。

取RNase-free的物品时必须戴手套。

1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。

对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。

处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为%。

注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。

2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

3）在通风柜中室温处理过夜。

4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。

5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。

置于干净处备用。

2、璃玻和金属物品250°C烘烤3小时以上。

四、从组织中提取总RNA1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。

Trizol法提取RNA实验步骤及原理实验原理：Trizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是利用三种有机物（TRIzol、氯仿和异丙醇）的混合物，使细胞或组织中的RNA在低温下与TRIzol发生相互作用，形成RNA-TRIzol复合物。

加入氯仿后，RNA-TRIzol复合物会转移到有机相中，而DNA和蛋白质则留在水相中。

通过离心分离有机相和水相，可将RNA从有机相中分离出来。

最后，加入丙醇沉淀RNA，即可得到纯度较高的RNA。

实验步骤：1. 细胞或组织样品的收集：将细胞或组织样品收集到离心管中。

2. 加入Trizol试剂：向离心管中加入适量的Trizol试剂，按比例加入的量为1mL Trizol/100mg组织或1×10^7个细胞。

3. 细胞或组织样品的破碎：使用超声波或均质器等方法将细胞或组织样品破碎。

4. 加入氯仿：向离心管中加入适量的氯仿，按比例加入的量为0.2mL氯仿/1mL Trizol。

5. 混合离心：将离心管中的混合物混合均匀后，离心分离有机相和水相。

6. 收集RNA：将有机相转移到新的离心管中，加入适量的异丙醇，沉淀RNA。

7. 洗涤RNA：用75%乙酸酒精洗涤RNA。

8. 溶解RNA：用RNase-free水或DEPC水溶解RNA。

9. 检测RNA：使用比色法或琼脂糖凝胶电泳等方法检测RNA的纯度和浓度。

注意事项：1. Trizol试剂应保存在4℃下，避免阳光直射和冰冻。

2. 操作过程中要注意RNA的保护，避免RNA的降解。

3. 操作过程中要使用无菌技术，避免污染。

4. 操作过程中要注意个人防护，避免接触到有害物质。

5. 实验前要准备好所有所需试剂和设备，确保实验顺利进行。

6. 实验后要及时清洗和消毒实验器材，避免交叉污染。

Trizol 法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。

RNA 质量的高低常常影响cDNA 库，RT-PCR 和Northern Blot 等分子生物学实验的成败。

Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf 管（RNase-free）、Tips（RNase-free）三、准备工作RNase 酶非常稳定，是导致RNA 降解最主要的物质。

它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。

用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase 完全失活。

它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。

RNase 的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。

一般情况下采用用DEPC 配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。

取RNase-free 的物品时必须戴手套。

1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。

对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。

处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC 使DEPC 的终浓度为0.1%。

注意：DEPC 为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。

2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC 水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

3）在通风柜中室温处理过夜。

4）将DEPC 水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC 水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30 分钟。

5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。

置于干净处备用。

2、璃玻和金属物品250°C 烘烤3 小时以上。

详解Trizol提取RNA原理、步骤和注意事项Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和β-巯基乙醇等变性物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。

β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。

（一）试剂准备1．Trizol试剂。

2．氯仿3．异丙醇4．75%乙醇（DEPC水配制）5．DEPC水细胞裂解后，细胞释放出蛋白质、DNA、RNA等物质，再根据它们在不同的PH值和不同极性溶剂的溶解度不同而使得分开。

（二）操作步骤1．样品处理：（1）细胞：1）悬浮细胞：移入1.5ml离心管中，1200转，离心5min，弃上清，PBS洗，重复两次，最后弃ＰＢＳ，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。

２）贴壁细胞：PBS洗两次，最后弃ＰＢＳ，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。

（2）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml 离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。

2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置15min。

3．4℃离心，12000g×15min，取上清。

4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。

6．加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。

4℃，8000g×5min，弃上清。

7. 晾干，加入适量的DEP水溶解（65℃促溶10-15min）。

（三）注意事项1．样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。

2．实验过程必须严格防止RNsae的污染。

（四）总RNA定量RNA定量方法与DNA定量相似，RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。

Trizol法提取RNA实验步骤及原理RNA（核糖核酸）在基因表达、调控等生命活动中起着至关重要的作用。

Trizol 法是一种广泛应用于提取细胞或组织中总 RNA 的方法，其具有高效、稳定、适用性广等优点。

下面将详细介绍 Trizol 法提取RNA 的实验步骤及原理。

一、实验原理Trizol 试剂主要成分包括苯酚、异硫氰酸胍等。

异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，抑制细胞内源性核糖核酸酶（RNase）的活性，从而保持RNA 的完整性。

苯酚则能促使蛋白变性，并使核酸从蛋白中分离出来。

在酸性条件下，RNA 分子会溶于水相，而 DNA 和蛋白质则留在有机相。

通过后续的离心、沉淀等操作，可获得纯净的 RNA 样品。

二、实验材料与设备1、材料细胞或组织样本Trizol 试剂氯仿异丙醇75%乙醇（用无 RNase 的水配制）无 RNase 的水或 DEPC 处理水2、设备冷冻离心机移液器及枪头（均为无 RNase）涡旋振荡器恒温水浴锅冰盒三、实验步骤1、样本处理细胞样本：将培养的细胞收集到离心管中，离心弃去培养液。

组织样本：将新鲜组织在液氮中迅速研磨成粉末，然后加入适量Trizol 试剂。

2、加入 Trizol 试剂对于细胞样本，根据细胞数量加入适量的 Trizol 试剂，通常每10^6 10^7 个细胞加入 1 ml Trizol 试剂。

对于组织样本，每 50 100 mg 组织加入 1 ml Trizol 试剂。

3、匀浆用移液器反复吹打细胞悬液，使其充分裂解。

对于组织样本，继续研磨或用匀浆器匀浆，直至组织完全裂解。

4、室温静置将裂解液在室温下静置 5 分钟，使核酸蛋白复合物充分解离。

5、加入氯仿按每 1 ml Trizol 试剂加入 02 ml 氯仿的比例加入氯仿，盖紧盖子，剧烈振荡 15 秒，然后室温静置 2 3 分钟。

6、离心在 4℃下，12000 g 离心 15 分钟。

离心后，溶液分为三层：上层为无色的水相，含有 RNA；中间层为白色的蛋白层；下层为红色的有机相，含有 DNA 和蛋白质。