双孢蘑菇单孢分离与单孢杂交研究进展

单孢子分离法单孢子分离法是一种用于研究微生物的重要技术手段。

它主要用于分离和培养微生物的单个孢子，以便研究其特性和功能。

单孢子分离法广泛应用于微生物学、生物学和农业等领域，对于研究微生物的生态学、遗传学和进化学等问题具有重要意义。

单孢子分离法的步骤一般包括采样、处理、分离和培养等过程。

首先，需要在合适的环境中进行采样，例如土壤、水体或植物组织等。

采样时要保持无菌操作，以避免外源性微生物的干扰。

其次，采样物经过处理，如稀释、过滤或研磨等，以获得单个孢子。

处理过程中需要注意保持样品的无菌性和孢子的完整性。

然后，将处理后的样品在适当的培养基上进行分离，可以通过涂布、扩散等方法将孢子均匀分布在培养基表面。

最后，将分离得到的孢子进行培养，通过控制培养条件如温度、湿度和光照等，使孢子发芽并生长为单株菌落。

单孢子分离法的优点在于可以获得纯种的微生物菌株，避免了杂交和复杂性的影响。

通过单孢子分离，可以更好地研究微生物的特性和功能，如生长速率、代谢途径、抗性和生态角色等。

此外，单孢子分离还可以用于鉴定微生物的种类和亚种，为微生物分类学和系统学提供重要的依据。

然而，单孢子分离法也存在一些限制。

首先，该方法需要耗费较多的时间和实验操作，特别是在处理样品和分离孢子的过程中需要保持无菌操作，要求实验人员具备一定的技术和经验。

此外，由于一些微生物具有较低的产孢率或困难产孢，因此可能无法获得足够数量的孢子进行分离。

此外，单孢子分离得到的菌株可能存在一定的变异性，需要通过进一步的鉴定和验证来确认其纯度和一致性。

单孢子分离法是一种重要的研究微生物的技术手段，具有广泛的应用前景。

通过该方法可以获得纯种的微生物菌株，为微生物学的研究提供了重要的工具和平台。

随着分子生物学和生物技术的发展，单孢子分离法将进一步发展和完善，为微生物学研究提供更多的可能性和挑战。

常用菌种选育原理的种植方法今天给大家介绍一下常用菌种选育原理的种植方法！一、人工选种的方法：1.自然选种：该法是通过广泛异地引种、野生采集、孢子分离等途径获得菌种，将其进行驯化移栽，使其逐渐适应当地环境条件，并从中选优汰劣，选出性状优异的菌株。

在菌种生产以及试验性栽培中，反复进行比较和选择，最终确定优良的食用菌品种。

2.杂交育种：该法是通过将不同遗传性状的亲本之间进行交配，使遗传物质重新组合配对，通过双亲性状的优势互补或借助于以一个亲本的优点去克服另一亲本的缺点，产生具有其双亲优点的育种方法。

杂交育种一般有单孢杂交、多孢杂交、单双核杂交、原生质体融合等方法，一般科研、育种上多采用单孢杂交或原生质体融合，通过这些办法处理的菌种常常可表现出较强的“杂交优势”。

3.诱变育种该法是利用物理的或化学的方法处理细胞群体，促使菌种的细胞遗传物质发生性状的改变，然后从变异的菌种中选出具有优良性状的菌种的方法。

科研上常用的主要有辐射诱变育种，如紫外线照射、X射线等高能量射线，以及用一些化学药剂进行诱变育种。

4.基因工程育种该法是在基因分子水平上的遗传工程，又称基因操作、基因克隆、脱氧核糖核酸（DNA）重组技术等，基本原理就是把我们需要的目标基因通过载体DNA与原品种的DNA结合，然后人工导入一个受体细胞内，以让外来的遗传物质在其中“着生”，进行正常的复制，从而获得预先设计的新菌种。

二、菌种分离技术方法：多孢分离：该法是利用子实体弹射许多孢子在同一培养基上，让其萌发、自由交配，从而获得纯母种的方法。

该法简便易行，在食用菌选种中应用普遍。

（1）整菇孢子弹射法：该法适用于伞菌类的孢子采集。

在无菌室（箱）中，将经消毒处理的整只种菇插入无菌平皿孢子收集器里，之后使用透明玻璃钟罩将其罩住，于见光、适温下使菇自然弹射孢子。

24h后，将玻璃钟罩打开，从培养皿内获取孢子。

（2）试管插割法：在无菌箱内，迅速用无菌试管插割种菇有菌褶一侧，直至取下组织块。

基因枪法遗传转化双孢蘑菇菌褶河南农业大学生命科学学院，农业部农业微生物酶工程重点实验室，河南郑州450002以双孢蘑菇（Agaricus bisporus）2793为试材，采用基因枪法对其菌褶进行遗传转化，相对转化率为2.69%，转化子经PCR检测表明，外源潮霉素B抗性基因已经被转入到菌丝体中。

双孢蘑菇；基因枪；遗传转化；潮霉素B抗性双孢蘑菇（Agaricus bisporus）是世界上栽培最广泛、生产量和消费量最大的食用菌。

20世纪90年代初，许多研究者采用多种方法进行了双孢蘑菇的基因转化，包括对原生质体、菌丝或子实体等的PEG介导转化、电转化和基因枪转化等，但均未获得成功［1-4］。

1996年，V AN DE RHEE等以大肠杆菌潮霉素B 抗性基因为选择标记，应用原生质体电转化法建立了双孢蘑菇有效而稳定的转化系统［5,6］。

目前，双孢蘑菇最为常用的转化系统是CHEN等的农杆菌介导的菌褶转化法［7］。

该法比食用菌中常见的原生质体PEG介导转化和电转化简便，但比基因枪法繁琐。

本文报道的是应用基因枪法转化双孢蘑菇菌褶获得潮霉素B 抗性转化子的实验结果。

1 材料与方法1.1菌株与质粒双孢蘑菇（A. bisporus）2793菌株，由河南农业大学应用真菌实验室提供。

质粒PAN7-1，含构巢曲霉（Aspergillus nidulans）GPD启动子和潮霉素B抗性基因，由荷兰PUNT博士赠送。

1.2培养基PDA加富高渗培养基：200 g马铃薯，205 g蔗糖,20 g葡萄糖，2 g酵母膏，2 g MgSO 4，2 g KH 2PO 4，1 g胰蛋白胨，20 g琼脂，1000 mL蒸馏水。

1.3潮霉素适宜浓度筛选取在PDA平板中培养的双孢蘑菇菌落边缘菌丝块（直径9 mm），分别接种于含0、1、2、3、4、5 μg/mL潮霉素B的PDA平板中央，每处理3个重复，置于28 ℃的恒温培养箱中培养10 d，观察并记录菌块的生长情况。

第二章双抱蘑菇的遗传特性和育种双抱蘑菇栽培的产质量性状表现由基因（遗传物质）和环境（栽培条件）这两个因素决定。

菌株的生长表型和性状特点都是基因和环境互相作用的结果。

但遗传物质是基础、是内因。

本章将着重介绍双抱蘑菇的遗传特性及选育种技术与方法。

/ 第一节蘑菇的遗传学基础\一、遗传与变异双抱蘑菇遗传学是研究其遗传与变异的现象、本质和规律的科学。

和其他生物一样，双抱蘑菇也具有遗传性和变异性，通俗地讲遗传是指上一代个体性状传给下一代，使下一代与上一代间的性状保持相似性。

遗传学上指的是物种的遗传物质从上一代传递给下一代的现象。

生物的遗传性是相对稳定的，从而保证了生命在世代间的连续，比如蘑菇种出来的还是蘑菇，香菇种出来还是香菇。

但遗传并不意味着亲代与子代间的性状完全相似，同一亲本的子代之间或与亲代之间或多或少还有某种不相似之处，这就叫变异。

遗传和变异是对立统一的两方面，遗传中有变异，变异中有遗传。

短期看来是遗传的性状，长远来看又会发生变异。

从物种的角度来看，蘑菇的遗传是稳定的，不容易发生变异，但蘑菇的个别性状却会发生变异。

变异又区分为可遗传的变异和不可遗传的变异。

可遗传的变异是指外界因子如栽培条件相同而遗传物质改变所引起的某些性状发生改变，这种改变了的性状是可以遗传的。

双抱蘑菇栽培菌株的祖先是野生双抱蘑菇，这种野生种是棕色的而不是白色的（Jahn ,1949），后来分化出浅棕色和奶油色的变种。

1927年在栽培奶油色蘑菇的菇床上出了一丛纯白色、菌盖光滑的蘑菇，现在世界各国栽培的白色双抱蘑菇都是由这种偶然发生的蘑菇繁殖出来的（Kligman，1950）。

Lambert（1938）也报道，"雪白（Snown White）"蘑菇品系就是在白色蘑菇品种中发现的一个突变菌株。

控制双抱蘑菇色素的基因所发生的突变就遗传下来了。

近年，美国Amycel公司通过分析建立的近等位基因系还找到了一个与双抱蘑菇子实体颜色性状强度连锁的RAPD标记（Lottus等，1995）。

食用菌育种技术的研究进展作者：桂明英等来源：中国食用菌，2006（5）随着人们对食用菌营养价值和药用价值认识的提高以及食用菌生产所带来的经济效益的增加。

食用菌育种工作也成为食用菌科技工作者关注的热点之一。

现对食用菌育种工作的研究进展进行综述，以期为食用菌的育种工作提供参考。

一、野生食用茵驯化育种野生食用菌驯化栽培．是食用菌育种的重要内容．栽培的食用菌品种绝大部分是由野生食用菌驯化而来的。

例如：阿魏蘑的驯化工作．是中国科学院新疆生物土壤沙漠研究所于1983年开始的．当时曹玉清、牟川静、陈忠纯等在研究驯化分布于新疆托里地区的野生阿魏侧耳fP／eurotu~retainel时，对其形态特征、分类地位、氨基酸含量、生活条件(包括营养、pH值、温度、湿度、光照和通风)、菌丝培养特征、驯化栽培等进行了研究。

观察到分离的野生菌株K001、K002与K005在培养特征上的差异。

1986年他们又在新疆木垒采集到Kill标本．在进一步研究中发现．K005、Klll在子实体外部形态与菌丝培养特征上与阿魏侧耳显著不同。

经研究定名为阿魏侧耳托里变种[Pieurotus ervngii(DC．ex． Fr)0ueI．var．tuolie nsis Mou．n var]。

他们1983年对 K001、K002、K005菌株驯化栽培中．发现在有无寄主植物阿魏根屑添加在培养基中的情况下．用棉籽壳、云杉木屑、麸皮等原料组成的培养基上都相继长出了子实体．阿魏侧耳及托里变种自此得到推广．首先在新疆开始人工栽培。

已成为近年来大面积进行商业性栽培的一种食用菌新品种。

其菇体肥大、颜色洁白、菌肉细腻、质地脆嫩、久炖不绵、清爽滑润、味美可口、营养丰富．投入市场后深受人们的青睐。

目前我国引进和驯化栽培成功的食用菌已达80多个种。

二、孢子分离育种单孢分离就是将采集到的孢子群单个分开培养，让其单独萌发成菌丝而获得纯培养的方法。

曹裕汉通过对草菇有性分离选育种研究．表明草菇孢子分离菌株在菌丝形态、生长速率、产厚垣孢子能力、出菇、产量等性状上存在较大的差异。

双孢菇栽培技术研究【摘要】：进入上世纪八十年代以来，我国蘑菇栽培打破了传统习惯，原来认为北方产区气候干燥，气温较低，不适宜发展蘑菇，但是由于技术的进步及市场的需求，蘑菇产区己从长江以南扩大到青海甚至东北等省区，新的蘑菇产区逐年扩大。

作者根据自身实践，对适应北方生长的双孢菇栽培技术做了深入的研究分析。

【关键词】：双孢菇；栽培技术；菌种双孢蘑菇因其担子上通常仅着生２个担孢子而得名，在分类上隶属真菌门，担子菌纲，无隔担子菌亚纲，伞菌目，蘑菇科，蘑菇属。

它的拉丁学名为Agaricus bisporus(Lange) Sing,也有叫Agaricus brunnescens的，中文别名为蘑菇、洋菇。

欧美各国生产经营者常称之为普通栽培蘑菇(Common cultivated mushroom) 或纽扣蘑菇(Button mushroom),日本人称之为マシュルム或西洋松茸。

一、双孢菇菌种特性与育种研究我国栽培双孢菇的历史已有70余年，其菌种选育工作也进行了30余年，但由于长期以来忽视了对双孢菇的基础性工作，对其遗传性缺乏深入的了解，至今对我国现有双孢菇的种质资源还没有进行全面系统的整理分析。

我国不是双孢菇的发源地，现存的双孢菇种质都是从国外引进的，野生的双孢菇种植资源十分缺乏，给双孢菇菌种改良和选育工作带来了相当大困难。

我国9个主要双孢菇栽培菌株的遗传相似性程度很高，其遗传相似性系数在0.77以上。

这表明，目前我国双孢菇的主栽菌株来源是比较单一的，遗传基础十分狭窄，势必造成双孢菇菌种的抗逆性和对不良环境适应能力的降低，加速双孢菇菌种的退化，从而不利于双孢菇的栽培生产。

我国虽不是双孢菇的原产地，但有与双孢菇亲缘关系很近的四孢菇野生种质资源，柴达木野生群体正在驯化之中，今后还应继续加大研究力度，促进双孢菇菌种的改良和选育。

由于双孢菇属于二极性次级同宗结合类型，具有独创性的生活周期，加之菌丝体呈多核状态且缺乏琐状联合，因此，在双孢菇的育种实践中，对同核体和异核体的鉴别要比异宗体和担子菌的单核体与双核体的鉴别困难得多。

单孢分离的名词解释单孢分离是一种常见的微生物实验技术，用于从多菌株中分离出单一孢子。

这项技术的发展，对于微生物学领域的研究和应用，具有重要意义。

本文将从单孢分离的意义、操作步骤以及在实验室中的应用等方面进行论述。

单孢分离的意义在于能够生成纯种菌株，使研究者能够获得高质量的微生物材料，从而更好地开展相关实验。

在进行微生物生态学研究时，如果使用混合的多菌株作为研究对象，可能会导致结果的不确定性，难以获得准确的数据。

而通过单孢分离技术，可以分离出单一的菌株，确保研究结果的可靠性。

此外，单孢分离还可以用于研究微生物的种群分布、遗传多样性以及生物活性物质的生产等方面。

进行单孢分离的操作步骤主要包括样品准备、分离培养和筛选纯种菌株。

首先，将待分离的样品取自自然环境或已有的培养菌株，包括土壤样品、水样、生物组织等。

样品收集后，需要进行预处理，以去除可能存在的杂质和其他微生物。

然后，将预处理后的样品均匀涂抹在含有富含营养物质的培养基上，并进行恰当的温度和湿度条件下培养。

在培养的过程中，需要保持培养基的湿润，并定期观察是否有单个孢子出现。

最后，通过显微镜观察，筛选出单个孢子并进行分离培养，得到纯种菌株。

单孢分离技术在实验室中广泛应用于研究微生物的生理特性、代谢途径以及生物活性物质的生产等方面。

例如，通过分离纯种菌株，可以进一步研究微生物的生长特性、抗生素合成等。

此外，单孢分离还与基因工程技术相结合，可用于筛选出具有特定功能的菌株，从而在医药、农业、环保等领域中发挥重要作用。

除了实验室中的应用，单孢分离技术还具有生物技术产业化的潜力。

随着生物制药和生物农业的发展，纯种菌株的需求量不断增加。

利用单孢分离技术，可以从大量的菌株中筛选出高产、高效的菌种，为工业化生产提供可靠的菌株资源。

同时，单孢分离技术也可应用于微生物药物和农药的研发过程中，确保产品的安全性和有效性。

综上所述，单孢分离作为一种常见的微生物实验技术，具有重要意义和广泛应用。

单孢子分离法单孢子分离法是一种用于分离和培养单个真菌孢子的方法。

真菌孢子是真菌的重要生殖结构，通过分离和培养孢子，可以得到纯种的真菌菌株，用于研究其生物学特性、生理代谢和基因表达等方面。

单孢子分离法的步骤如下：1. 材料准备：首先准备含有真菌孢子的样品，可以是来自自然环境中的土壤、水体或植物组织等。

将样品处理成适合分离的状态，如将土壤样品均匀撒在琼脂平板表面。

2. 分离孢子：使用显微镜和鉴别性培养基，观察并分离出单个真菌孢子。

选择具有代表性的孢子，避免混入其他微生物的污染。

3. 培养孢子：将分离得到的孢子转移到含有适宜营养物质的培养基上，如琼脂平板、液体培养基或固体培养基。

培养条件应根据真菌的生长特性进行调整，如温度、pH值、光照等。

4. 纯化菌株：观察培养基上的菌落形态和生长特性，选择纯种的菌株进行进一步培养和研究。

通过连续传代、单菌传代或子孢子分离等方法，可以获得纯种的真菌菌株。

单孢子分离法的优点包括：1. 获得纯种菌株：通过单孢子分离法，可以获得纯种的真菌菌株，避免了菌落混杂和杂交等问题，有利于研究真菌的特性。

2. 丰富菌种资源：真菌菌种的多样性非常丰富，通过单孢子分离法，可以从复杂的样品中筛选出不同的菌株，丰富了菌种资源。

3. 研究真菌生物学：单孢子分离法为研究真菌的生物学特性提供了有效工具，可以研究真菌的生长规律、生理代谢途径、基因表达调控等方面。

4. 遗传分析：单孢子分离法为真菌的遗传分析提供了基础，可以通过研究不同菌株的遗传变异，揭示真菌的遗传多样性和进化机制。

单孢子分离法在真菌学研究中具有重要意义，但也存在一些局限性。

例如，某些真菌的孢子很难分离，需要借助其他方法进行增殖和分离；部分真菌的孢子具有休眠状态，需要特殊条件刺激才能萌发。

此外，单孢子分离法对操作者的技术要求较高，需要耐心和细致的操作。

单孢子分离法是一种重要的真菌分离和培养方法，可以获得纯种菌株用于研究。

通过该方法，可以深入了解真菌的生物学特性和遗传机制，为真菌学的研究提供了基础。

什么是食用菌菌种的孢子分离技术？如何操作？
食用菌菌种的孢子分离有单孢分离和多孢分离两种方法。

单孢分离主要用于孢子杂交育种研究；多孢分离多用于生产繁种。

孢子分离技术如下：
（1）钩悬收集法。

采集成熟的子实体（刚弹射孢子）菌盖 1 块，在无菌室经消毒处理后，将菌褶（伞菌）或菌孔（多孔菌））朝下悬吊于无菌容器内收集孢子。

在22～26℃下让其自然弹射孢子5～10 小时，容器底部出现颜色孢子印。

取无菌水，蘸取少量孢子制成孢子悬浮液，用灭过菌的注射器或滴管吸取孢子悬浮液，滴 1～2滴于试管斜面上，经25℃培养至孢子萌发，挑选无污染的斜面进行扩繁，经严格的出菇试验，择优用于生产。

（2）试管收集法。

在无菌条件下取一小块子实体组织，蘸少量无菌琼脂或糨糊，黏附于试管培养基斜面的对面玻壁上，子实层面朝向斜面培养基，加棉塞后在20℃左右静置，孢子会弹射到斜面培养基上，再去掉试管壁上的菌块，经进一步培养获得多孢子萌发的菌丝体。

经严格的出菇试验，择优用于生产。

分析检测HPLC法检测双孢蘑菇中的4种嘌呤赵祖云，高亚军（扬州大学，江苏扬州 225002）摘 要：目的：建立同时检测双孢蘑菇中4种嘌呤含量的高效液相色谱法。

方法：取0.25 g冷冻干燥后的双孢蘑菇粉，加入5%的乙醇溶液25 mL超声提取30 min，冷却至室温，用无水乙醇定容至25 mL，用中性滤纸过滤后再经0.45 μm膜过滤去除沉淀，滤液上机测定，分析双孢蘑菇中4种嘌呤含量。

结果：4种嘌呤能够完全分离，且在质量浓度0.1～20.0 mg·L-1时，4种嘌呤的响应峰面积与其浓度呈线性关系，r2＞0.995，相对标准偏差＜3%，回收率98.86%～103.25%。

结论：该分析方法简便、准确，可同时检测双孢蘑菇中4种嘌呤的含量。

关键词：嘌呤；双孢蘑菇；高效液相色谱法Determination of Four Purines in Agaricus bisporus by HPLCZHAO Zuyun, GAO Yajun(Yangzhou University, Yangzhou 225002, China)Abstract: Objective: To establish a high-performance liquid chromatography method for the simultaneous detection of four purines in Agaricus bisporus. Method: Take 0.25 g of freeze-dried Agaricus bisporus powder, add 25 mL of 5% ethanol solution and extract it by ultrasound for 30 min. Cool to room temperature, dilute to 25 mL with anhydrous ethanol, filter with neutral filter paper, and then pass through 0.45 μm membrane filtration, removal of sediment, determination of the filtrate on the machine, and analysis of the content of four purines in Agaricus bisporus. Result: Four purines can be completely separated, and in the mass concentration range of 0.1～20.0 mg·L-1, the response peak area of four purines is linear with their concentration, r2＞0.995, precision RSD＜3%, recovery rate 98.86%～103.25%. Conclusion: The method is simple and accurate, and can be used to simultaneously detect the contents of four purines in Agaricus bisporus.Keywords: purine; Agaricus bisporus; high performance liquid chromatography随着生活水平的提高，人们的饮食结构和生活习惯也发生着变化，痛风逐渐成为一种常见疾病，且发病率逐年上升，发病年龄也逐渐年轻化[1-2]。

单孢子杂交：育出优质食用菌品种
农作物育种中一个重要的方法就是杂交育种，像玉米、水稻等都是通过杂交手段选育出了新的优良品种，无论是在种植业，还是养殖业上杂交育种的优势十分明显，同样，杂交优势在食用菌育种上也能得到体现，金杂19就是典型的通过杂交方式选育出的金针菇品种，食用菌杂交育种主要的方式是单孢子杂交，单孢子杂交需要一定的设备技术才能实现。

食用菌单孢子杂交育种操作步骤：
1、获取单核菌丝
要想获取单核菌丝首先要获取单孢子，准备10支装有灭菌水的试管，将取得的孢子接入第1支试管，摇匀，然后用灭菌后的吸管吸取1滴，滴入第2支试管，然后重复，直到第10支后镜检，确定视野里只有零星单个孢子存在。

然后，将第10支试管的孢子溶液，在无菌状态下接种到平皿上，在22℃下恒温培养，菌丝萌发后，镜检确定没有锁状联合，即获得了单核菌丝。

用同样方法，获得同一品种两个品系的单核菌丝，为保证成功率，每个品系尽量取得多个单核菌丝。

2、杂交亲和
将获得的两个不同品系的单核菌丝接入同一平皿培养基上，当菌丝交汇后观察，如果产生对峙现象，说明两个品系不可亲和，否则说明是可亲和的，取交汇后的菌丝镜检，如果存在锁状联合，说明杂技成功，选取交汇处菌丝进行扩
繁。

3、验证
将杂交成功的菌丝和用来杂交的两个亲本同时接到一个平皿上，如果产生对峙，证明杂交成功。

4、出菇试验
杂交产生的新品种，可以同时遗传两个亲本的优点，也有可能遗传两个亲本的缺点，因此只有大量的重复试验工作才有可能获得需要的优良品种。