RIPA高质量WB蛋白制备试剂盒

WB 实验步骤1 组织蛋白裂解（使用试剂盒：索莱宝高效RIPA 组织细胞裂解液，SIb-R0010；PMSF ） 使用方法：按照说明书，每25mg 组织样本+300uL RIPA+3uL PMSF ,放置于tube 中，使用剪刀剪碎，匀浆机匀浆，离心（4℃，15000 r ，20-30,min ），取上清。

2 蛋白定量（试剂盒：碧云天G250染色液，P0006-1） （1）在96孔板上进行加样。

第一列 第二列（2）加入200ul G250考马斯亮蓝，静置五分钟，使用酶标仪检测。

（3）酶标仪选定，检测吸光设置：波长是595nm ，3-5。

Shaking 设置：duration10s.(4) 根据标准曲线求出蛋白浓度，所有样本的蛋白使用DDW 稀释到同一浓度后与Lane Marker Loading Buffer/5x 蛋白示踪上样缓冲液/还原混合（混合比列按照说明书确定），混匀，掌上离心机离心。

（5）100℃水浴加热8min ，室温放置，冷却后使用或者-20℃储存待用。

3 制胶根据蛋白大小选择分离胶浓度 胶浓度大小 6% 8% 10% 12% 成分 H2O 5.3ml 4.6ml 3.9ml 3.3ml 30%丙烯酰胺 2ml 2.7ml 3.4ml 4.0ml 1.5M Tris 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 10%SDS 100ul 100ul 100ul 100ul 10%APS100ul100ul100ul100ulDDW(高压灭菌双蒸水) BSA(蛋白标准品) DDW 裂解后的蛋白 孔1 20ul 0ul 5ul 15ul 2 19ul 1ul 5ul 15ul 3 18ul 2ul 5ul 15ul 4 16ul 4ul 5ul 15ul 5 12ul 8ul 5ul 15u[ 6 8ul 12ul 5ul 15ul 7 4ul 16ul 5ul 15ul 80ul20ul5ul15ulTEMED 6ul 6ul 6ul 6ul浓缩胶4%H2O 2ml30%丙烯酰胺0.5ml1.5M TRIS 0.5ml10%SDS 40ul10%APS 30ulTEMED 4ul总体积3ml4 电泳，低电压80V跑至marker分离，后改成大电压（100-120V）电泳液Running bufferTris 3.03g甘氨酸18.77gSDS 1.0gDDW 1000ml5转膜：大电压100V，转膜蛋白是40KD以上蛋白，转膜时间（1.0胶）40min-50min；小电压90V，转膜蛋白小蛋白。

Western blot 之蛋白提取（protocol）一、蛋白提取准备：冰浴盒、冰、小烧杯、EP管（1.5ml）、小镊子、RIPA裂解液（4℃保存，试剂盒中含PMSF，-20℃保存）、蛋白酶抑制剂（protease inhibitor tablets）、磷酸酶抑制剂（phosphatase Inhibitor cocktail 3）、15ml离心管(裂解液)、移液器、超声粉碎机、低温高速离心机、BCA蛋白定量试剂盒、96孔板、酶标仪、4×蛋白上样缓冲液（分装1ml/管，-20℃保存）、二、蛋白提取操作：1. -80℃取出组织，冰上复温；由冻存管移入1.5mlEP管，并重新编号；（1、2、3、4、5、6分别为sham、3h、12h、24h、3d、7d）2. 加裂解液;a、裂解液配制：(10mlRIPA（4℃）+100ulPMSF（-20℃）+100ul蛋白酶抑制剂（4℃ 10×、1×）+1-2ul磷酸酶抑制剂)注：磷酸酶抑制剂作用是保护已磷酸化蛋白，避免其降解破坏，所以加之有益无害。

b、加入EP管，1mg：10-20ul；（400ul/EP管，不要求精确）3. 匀浆；机械（电动匀浆机）；超声粉碎机√附：超声粉碎机操作：a、打开电源；b、确认设置；（默认）c、蒸馏水清洗机头；（每次换样本均要清洗、避免污染、并擦干）d、匀浆；（电源键控制机头启停，装有标本的1.5mlEP管置入小烧杯冰浴中，匀浆过程反复上下活动，充分匀浆组织）4. 冰浴静置30分钟；（再加裂解液600ul至总量1000ul；）5. 预开机制冷，12000rpm，4℃，离心20分钟；离心结束后，取上清至新1.5mlEP管；附：低温高速离心机操作：a、开机；b、设置speed、time、temp，注意ROTOR内外对应；12154（1.5ml或2mlEP管）c、温度降至预设温度后，配平，开始；6. BCA试剂盒蛋白定量a．配制工作液；BCA试剂：CU试剂=50:1（5mlBCA+100ulCU）；（标准品数量+样品数量）×200ul；充分混匀，24小时室温稳定；b．各孔加BCA工作液200ul；c、稀释标准品；（0.5mlEP管）①90ulPBS稀释液+10ulBSA标准品（-20℃），至100ul，浓度0.5mg/ml；②加稀释后的标准品至96微孔板标准孔中：20、16、12、 8、 6、 4、 2、 0 ul加PBS补足至20ul：0、 4、 8、12、14、16、18、20 ul实际浓度：0.5、0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.05、0mg/mld、样品稀释；（0.5mlEP管）（尽可能让样品点落在标准线1/2后）,样品量不能少于2ul，否则误差太大。

Western blotting实验步骤1．蛋白质的样品制备：取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。

将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。

2 .测定蛋白浓度：2.1 按50：1配置BCA工作液。

2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。

2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。

2.4 分别加PBS定容至20ul。

2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。

2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。

3 SDS-PAGE电泳：3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。

同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。

吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。

3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。

（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。

3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。

WB实验组织总蛋白提取方法总蛋白提取是生物学实验中常用的一种方法，主要用于从细胞或组织中提取所有蛋白质。

提取总蛋白的目的是为了进一步分析蛋白质的功能和结构，例如Western blot分析等。

下面是一种常用的总蛋白提取方法。

实验材料和试剂：1.已培养的细胞或组织样品2. RIPA裂解液：含有非离子界面活性剂（Tween-20或Triton X-100）、蛋白酶抑制剂（如苯甲砜）和磷酸酯酶抑制剂（如磷酸酯酶）3.低温高速离心管4.超声波细胞破碎仪或机械研磨器5.10%SDS-凝胶电泳试剂6.蛋白加载缓冲液7.高压电泳设备实验步骤：1.将细胞样品从培养皿中用PBS缓冲液洗涤一次，用PBS轻轻冲洗组织样品。

2.吸去PBS缓冲液，加入足够的RIPA裂解液使细胞或组织完全浸没。

注意：RIPA裂解液的加入量需根据样品的大小进行调整。

3.将细胞或组织样品转移到低温高速离心管中。

4.使用超声波仪器或机械研磨器对样品进行破碎。

这一步旨在使细胞或组织的细胞膜破裂，释放出胞浆中的蛋白质。

5.离心样品以除去细胞碎片和细胞核等大颗粒。

将离心管置于低温离心机中进行离心，离心条件需根据实验需要进行调整。

6. 将上清液转移至新的离心管中，得到总蛋白提取物。

可以根据需要进行蛋白质浓度的测定，常用的方法有BCA法、Lowry法等。

7.将总蛋白提取物加入相应的蛋白加载缓冲液，并在沸水中加热变性。

8.蛋白质经过热变性后，将其进行SDS-凝胶电泳分离。

9. 将凝胶中的蛋白质转移到PVDF或NC膜上，通过Western blot分析来检测目标蛋白质。

总蛋白提取方法的关键是裂解液的配方和破碎细胞或组织的方式。

裂解液中的各种成分旨在破坏细胞膜、解离蛋白质和保护蛋白质不被降解。

破碎细胞或组织的方式可以选择超声波破碎、机械研磨或冷冻-解冻法等。

总蛋白提取方法的优化可根据实验需要进行调整。

例如，在一些情况下，可以添加磷酸酯酶抑制剂、蛋白酶抑制剂或还原剂等成分来保护蛋白质的完整性。