血红蛋白的分离和提取优秀课件

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度
蛋白质提取与分离的依据－－
蛋白质的物理化学性质差异：
1.分子的形状、大小 2.电荷性质和多少 3.溶解度 4.吸附性质
5.对其他分子亲和力
1.凝胶色谱法
（1）凝胶 一些微小多孔的球体 （内含许多贯穿的通道，具多孔的凝胶就叫分子 筛）
（2）概念： 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法
影响蛋白质分子运动速度的因素
决定
决定
运动方向 运动速率
电荷性质Biblioteka √电荷量√
分子形状
√
分子大小
√
缓冲溶液－－洗脱剂
（1）作用： 抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。
（2）配制： 由弱酸和相应的强碱盐溶解于水中。 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等
（3）在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液的原因？ 目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境， 保证血红蛋白的正常结构和功能。
3. 充分搅拌的目的是___加__速__红__细__胞__的__破__裂___________。
3.分离血红蛋白
分离过程
红细胞 混合液
脂类物质
高速离心 10min
滤纸 过滤
烧杯
离心 管
有机溶剂 血红蛋白
4.透析血红蛋白
透析的目的是什么？ 去除血红蛋白中的小分子杂质
1mL
1mL 20mmol/L磷酸缓冲液
血液组成成分
阅读思考： 1. 血液由_血__浆___和___血__细__胞_两部分组成。 2. 血细胞中_红__细__胞___细胞数量最多，细胞的含量
最高的化合物是___血__红__蛋__白____。 3. 该化合物是由 __2_条__α_-_肽__链____和__2_条__β__-_肽__链__构
注意：洗脱过程不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象， 否则重新填装。
1.调液面
2.加样
3.再调液面
4.洗脱
5.收集
缓冲液 凝胶
1.调液面 2.加样 3.再调液面
4.洗脱 、 5.收集
注意事项
1. 红细胞的洗涤：
洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 Why？
2. 凝胶的预处理： 沸水浴法，还能除去微生物和气泡
3.色谱柱的装填： 装填尽量紧密；无气泡；洗脱液不能断流。
4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。
知识总结
血 蛋白质分子的差异性
红
蛋 凝胶色谱法 白 凝胶电泳法 的
原理
分离过程
提
缓冲溶液
组成
作用
取
和
分 离
蛋白质的
样品处理
提取分离
粗分离
纯化
纯度鉴定
练习巩固
1、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋 白质的叙述，正确的是 A、 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对
纯化－－凝胶色谱法 1.凝胶色谱柱的制作： 教材图5－19 2.凝胶色谱柱的装填： 3.样品的加入和洗脱
注意： （1）凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀；凝胶装填时 尽量紧密；装填时不能有气泡存在：因为气泡会 搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
（2）装完后，立即用缓冲液洗涤，使凝胶装填紧密
3.样品的加入和洗脱
2）影响蛋白质分子运动速度的因素
3）常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时通常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳，使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同 时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利 用相关计算公式算出相对分子量
SDS 带负电荷多的 ，因而掩盖了不同种蛋白质 间的电荷的差别，使蛋白质迁移速率仅取决于分子 大小。
血红蛋白的分离和 提取
思考：
“课题1--DNA的粗提取与鉴定” 实验理想的材 料是什么？ “课题3--血红蛋白的提取和分离” 这实验理想的材料又是什么？原因是？
答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便 于进行DNA的提取，哺乳类动物成熟的红细胞 无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便 于提取血红蛋白。
成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和 CO2结合的亚__铁___血___红___素___________基团。
1.洗 涤 红 细 胞
阅读思考：洗涤的目的是什么？ 洗涤的方法是什么？ 洗涤干净的标志是什么？
3g柠檬酸钠
吸出血浆 5倍体积生理盐水
血液 100mL
低速短时 间离心
血浆 红细胞
红细胞
重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
分子质量较大的蛋白质 B、 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对
分子质量较大的蛋白质 C、 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对
分子质量较大的蛋白质 D、 二者根本无法比较
2.相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中 的进行过程可表示为图中哪一个 B
3.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用
一、基础知识：
（一）蛋白质分离原理
（二）蛋白质分离的方法
1）凝胶色谱法：又称分配色谱法 2）电泳法
（三）缓冲液的作用
二、实验操作－－实验步骤 注意事项
血液组成成分
1、样品 处理
（1）洗 涤 红 细 胞 （2）释放血红蛋白
2、粗分离
（3）分离血红蛋白 （4）透析血红蛋白
3、纯化
凝胶色谱法进行纯化
4、纯度鉴定
搅拌10min
阅读思考：
2.释放血红蛋白
释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了
哪些物质，有什么用？
目的分析： 1. 蒸馏水的作用是_____使__红__细__胞__大__量__吸__水__胀__裂_______。
2. 加入甲苯的作用是___溶__解__红__细__胞__的__细__胞__膜_________。
总结：大分子经过路程短，流动快； 小分子经过路程长，流动慢。
4、具体过程
混合物 洗 大分子流动快 上 柱 脱 小分子流动慢
收集 大分子
收集 小分子
洗脱：
从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
2．凝胶电泳法： 电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
1）原理： 不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、 分子形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、 方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方 向和运动速度不同。
3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时， （相对分子质量较小）的蛋白质容易进入凝 胶内部的通道，路程（ 较长），移动速度 （ 较慢 ），而（相对分子质量较大）的 蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 （ 凝胶外部）移动，路程（ 较短 ），移 动速度（ 较快 ），相对分子质量不同的 蛋白质因此得以分离。