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实验六DNA 的定量测定（二苯胺法）一实验目的学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。
二实验原理强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。
其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。
DNA(脱氧戊糖基）H+HO CH2C CH2CH2蓝色化合物DNA在40-400μg范围内光密度与DNA浓度成正比。
在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。
当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。
三试剂和器材（一）器材1．粗制DNA。
2．坐标纸。
3．试管1.5 cm *15 cm （*7）4．吸管0.20 ml (﹡2) 、0.50ml(*3) 、1.0ml(*2)。
5．722 型（或7220 型）分光光度计。
6．恒温水浴锅。
（一）试剂1．DNA 标准液（200μg/ml）: 取DNA钠盐用5 mmol/L的NaOH配成200μg/ml 的溶液。
2．二苯胺试剂：称取纯二苯胺（如不纯, 需在70% 乙醇中重结晶2次）1克溶于100 ml 分析纯的冰醋酸中，再加入10ml 过氯酸（A.R., 60% 以上），混匀待用。
当所用药品纯净时，配成试剂应为无色，临用前加入1ml1.6% 乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱中，一周内可使用），贮于棕色瓶。
3．DNA样液：将实验所得的DNA粗品用蒸馏水溶解，定溶至50 ml，控制其DNA含量在100μg/ml左右。
四操作方法1．标准曲线的绘制按表1 加入各种试剂，混匀，于60 ℃恒温水浴保温45 min，冷却后，在595 nm波长下，于722型分光光度计比色测定，以吸光度对DNA浓度作图，制定标准曲线。
2．样品的测定吸取DNA样液1.0 ml，加入蒸馏水1.0 ml，混匀。
DNA的定量测定-二苯胺法一、实验目的1.学习和掌握用浓盐法从动物肝脏中提取DNA的原理和方法；2.学习和掌握用二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。
二、实验原理1．DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595nm）。
2．在DNA浓度为20-200μg/ml的范围内，吸光度与DNA浓度成正比，可用比色法测定。
三、实验仪器试管移液管7220分光光度计四、实验试剂1、DNA标准液（200ug/ml）：称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。
2、二苯胺试剂：A液：称取纯二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加浓硫酸1.5ml。
贮于棕色瓶中。
B液：称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制临用时，将20mlA液和0.1mlB液混合即可五、实验验步骤1.标准曲线的绘制加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，以吸光度对DNA浓度作标准曲线。
2.样品测定吸取DNA样液1.0ml，加入蒸馏水1.0ml，混匀。
然后加入二苯胺溶液4.0ml, 加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。
根据实验数据制得标准曲线如下：由上表可知样液的吸光度y=0.115，则由标准曲线得出DNA样液的浓度x=18.49μg/ml。
故样品中DNA的质量=18.49×6÷1.0=110.94μg七、实验分析1. 测定DNA含量的方法还有哪些原理?荧光法，用Pico Green荧光染料，测定DNA浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA，并且受其它杂质的影响不大，缺点要有专门的荧光检测仪器，试剂比较昂贵。
2. 实验中加入乙醛的目的?甲醛引起DNA的断裂损伤,DNA在酸性条件下加热，在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应灵敏度.。
⼆苯胺的使⽤DNA的鉴定 本实验中鉴定DNA的⽅法为⼆苯胺法(配⽅见下述的“药品配制”)。
⼆苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸⽣成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和⼆苯胺作⽤⽽显现蓝⾊(溶液呈浅蓝⾊)。
鉴定时溶液蓝⾊的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。
⼆苯胺试剂的配制A液： 15 g⼆苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,⽤棕⾊瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使⽤。
B液： ⼄醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制： 将0.1 mL B液加⼊到10 mL A液中,现配现⽤。
DNA粗提取与鉴定的另⼀种⽅法1.材料⽤具新鲜菜花(或蒜黄、菠菜)。
塑料烧杯,量筒,玻璃棒,尼龙纱布,陶瓷研钵,试管,试管架,试管夹,漏⽃,酒精灯,⽯棉⽹,三⾓架,⽕柴,⼑⽚,天平。
研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,⼆苯胺试剂,蒸馏⽔。
2.⽅法步骤(1)DNA的粗提取 ①准备材料 将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放⼊冰箱冷冻室,⾄少24 h。
②取材 称取30 g菜花,去梗取花,切碎。
③研磨 将碎菜花放⼊研钵中,倒⼊10 mL研磨液,充分研磨10 min 。
④过滤 在漏⽃中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤⼊烧杯中(有条件的学校可将滤液倒⼊塑料离⼼管中进⾏离⼼,⽤1000r/min的旋转频率,离⼼25 min,取上清液放⼊烧杯中)。
在4 ℃冰箱中放置⼏分后,再取上清液。
⑤加冷酒精 将⼀倍体积的上清液倒⼊两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并⽤玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。
沉淀35 min后,可见⽩⾊的DNA絮状物出现。
⽤玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上。
(2)DNA的鉴定 ①配制⼆苯胺试剂 取0.1 mL B液,滴⼊到10 mL A液中,混匀。
②鉴定 取4 mL DNA提取液放⼊试管中,加⼊4 mL ⼆苯胺试剂,混匀后观察溶液颜⾊(不变蓝)。
⽤沸⽔浴(100 ℃)加热10 min 。
二苯胺试剂：鉴定DNA。
二苯胺试剂的配制A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中，再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化，再使用。
B液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制:将0。
1 mL B液加入到10 mL A液中，现配现用。
DNA的粗提取与鉴定实验原理1。
DNA在NaCl溶液中的溶解度,是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
当NaCl的物质的量浓度为0。
14 mol／L时,DNA的溶解度最低。
利用这一原理,可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2。
DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液.利用这一原理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
3.DNA遇二苯胺(沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
注意事项1。
步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入.2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。
实验用具鸡血细胞液（5～10 mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0.1 g／mL 的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol／L和0．015 mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100 mL，1个，50 mL，500 mL，各2个），漏斗，试管(20 mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒(100 mL，1个），纱布，镊子,滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。
实验原理：1。
析出溶解在NaC1溶液中的DNA.2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。
3。
DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色.方法步骤：1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。
5 min2．溶解DNA:3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢4．过滤：取黏稠物5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢.3 min6．过滤：取滤液。
7．提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。
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二苯胺试剂的配制A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。
B液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制:将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。
DNA的粗提取与鉴定实验原理1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。
利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。
利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA 的试剂。
注意事项1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。
2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。
实验用具鸡血细胞液（5～10 mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0.1 g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol／L和0．015 mol ／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100 mL，1个， 50 mL， 500 mL，各2个），漏斗，试管（20 mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100 mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。
实验原理：1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。
二苯胺试剂鉴定DNA的原理二苯胺试剂鉴定DNA的原理一、定义二苯胺试剂（Diels-Alder Reagent）是一种有机化学试剂，用于识别DNA特定序列的定向性反应，也称为定向碱基异构酶（DBA）试剂。
该反应原理的应用有助于鉴定DNAsites的结构以及多段和复合份额的识别。
二、原理二苯胺试剂的反应受特定的DNA序列控制。
当两个特定的DNA序列（A和B）结合在一起时，二苯胺试剂不会发生反应。
当两个相邻的DNA同源片段（测序DNA被称为probe DNA）与目标DNA结合时，二苯胺试剂将发生化学反应，从而形成定向碱基异构化反应（DBAR）。
当两个DNA同源片段（A和B）以相反的方向连接在一起并且probe DNA与target连接在一起时，将发生相反的DBAR反应，从而允许研究人员确定多段复合份额结构和激活片段的位置。
三、步骤1. 准备试剂：用于鉴定DNA序列的二苯胺试剂主要包括：四氢三唑，苯胺试剂，deoxyuridine triphosphate（dUTP），十六烷基三甲基溴化氢，二硫代乙酸盐，硫酸铵，三氟异丙醇，氯化钠和氯仿。
2. 生物实验：首先，把一定量的DNA与二苯胺试剂，孵育物质以及制剂混合物一起混合搅拌，使其充分接触。
所得的混合物应放在微孔板的特定位置，经过30分钟的反应，可完成DNA的定向碱基异构化反应。
3. 检测结果：在用正片胶将实验测试物涂覆之后，用UV波长或紫外可见对应射线下照射，发现接受了二苯胺化学反应和定向碱基异构化反应的物质和连接物会吸收紫外线，通过经典的水滴检测法即可看到反应得到的结果。
四、应用二苯胺试剂技术可以用于鉴定DNA特定序列的结构，可以识别多复制份额DNA结构，可以用于对染色体进行谱系定向标记，可以用于精确的基因组生物学和染色体学研究。
二苯胺试剂鉴定DNA二苯胺试剂鉴定D N A Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】二苯胺试剂:鉴定DNA。
二苯胺试剂的配制A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。
B液:乙醛的体积分数为%的溶液。
配制:将 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。
DNA的粗提取与鉴定实验原理1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
当NaCl的物质的量浓度为mol／L时,DNA的溶解度最低。
利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。
利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA 的试剂。
注意事项1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。
2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。
实验用具鸡血细胞液（5～10 mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol／L 和0．015 mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100 mL，1个，50 mL， 500 mL，各2个），漏斗，试管（20 mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100 mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。
实验原理：1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。
2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。
在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。
方法步骤：1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。
5 min2．溶解DNA：3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢4．过滤：取黏稠物5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。
实验报告课程名称： 生物化学实验 实验名称： 真核生物基因组DNA 的提取和含量测定 指导老师： 同组学生姓名： 廖杰 成绩：__________________真核生物基因组DNA 的提取和含量测定【实验原理】 制备具有生物活性的大分子核酸，必需采取温和的制备条件，避免过酸、过碱的反应环境和剧烈的搅拌，防止核酸酶的作用，并要求在低温下进行操作 。
一、 真核生物基因组DNA 的提取本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法破碎组织细胞。
DNP 在L NaCl 中不溶解,而RNP 可溶解。
用无菌水溶解沉淀，加入蛋白酶消化液（含有蛋白酶K 和SDS ）。
１温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA 的完整性， ２可以变性Dnase ，３还可以去除部分的蛋白。
４使核蛋白体从DNA 上解离。
然后加RNase 以去除RNA ，再用苯酚:氯仿抽提法反复抽提提取DNA 苯酚:氯仿抽提法：酚、氯仿是有机溶剂，能有效地使蛋白质变性。
纯酚在与水混合时处于下层。
然而有机相和水相会难于分开。
专业： 药学 姓名： 阿卜杜合力力 学号： 56 日期： 地点： 生化实验室 装订 线若使用酚：氯仿混合物抽提，由于氯仿的比重较大，可在很大程度上解决这个问题，促进两相的分离。
异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。
变性蛋白一般集中在两相之间的界面层，而脂类则有效地分配在有机相中，核酸则被留于上层水相。
该法其具有操作条件比较温和，能迅速使蛋白质变性并同时抑制核酸酶的活性，可得到具有生物活性的高聚合度的核酸等优点。
但其操作步骤较为繁琐，去除蛋白质需要反复进行多次。
砷盐、氟化物、柠檬酸、EDTA等可抑制DNase的活性；皂土等可抑制RNase 的活性。
收集上清液后用乙醇沉淀DNA，最后用TE缓冲液溶解DNA，并用紫外吸收法测定DNA的含量及纯度。
二、紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度1．紫外分光光度法测定核酸含量：由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，吸光度A值为1相当于大约50μg /ml双链DNA。
