相对定量和绝对定量

相对定量的数据处理

•管家基因校准(Normalization Gene)

–得出每个细胞中的[目的基因]

–目标基因vs. 管家基因

•对照样品校准(Calibrator Sample)

–得出相对于某个样品的基因表达量, 1X sample.

–处理的vs. 未处理的，6hr vs. 0 hr, 病理vs. 正常….

相对标准曲线法计算示例

相对定量：ΔΔCT法

依据：平均相对含量% = 2 –平均ΔΔCT好处：不做标准曲线

ΔΔCT=ΔCTUnknown-ΔCTCalibrator=

%与ΔΔCT的关系

平均相对含量= 2 –平均ΔΔCT

%与ΔΔCT的关系

平均相对含量 = 2 –平均ΔΔCT

ΔΔCT法计算示例

注意：如果反应效率不高，则差别被高估。

–当ΔΔCT= -1.2 >E=1，2.3 倍差别

>E=0.9，2.2倍差别

>E=0.5，1.6倍差别

ΔCT与相对定量

Relative Quantification PCR

1. 使用相应试剂提取待检标本Total RNA。(不同的组织样本提取方法不一样，由于定量PCR对RNA质量要求比较高，因此要选取一种适合自己样本的提取方法)

2. 将RNA逆转成c-DNA, （RNA，c-DNA均极易降解，应放于-80℃保存）

3. 对欲研究的基因（A）和管家基因（B）分别设计跨外显子引物（避免基因组DNA污染）

4. 配制反应体系（20 ul）

RNA 1 ul

F-primer 0.4 ul

R-primer 0.4 ul

SYB 10 ul

H2O 8.2 ul

注：根据相对定量试剂结果（通常以CT<35,为可用结果）调整c-DNA量。

5. 设计好反应板，

6. 先配好未加RNA的Mix，然后再根据实验设计将Mix分装至测序板各孔中。（每个引物都需要至少一个阴性对照）

7. 再加入待测标本c-DNA。

8. 将测序板贴封膜，３０００转／分钟离心１分钟。

9. 将测序板放入ＡＢＩ ７５００荧光定量ＰＣＲ仪中（注意测序板的方向，缺口在右上角。

10. 1.打开SDS软件。

2. 选择 File （文件） > New （新建）。

3. 在 New Detector （新建探针）对话框中，为探针输入一个名称。

4. 在 Reporter Dye （报告基团荧光）和Quencher Dye

（淬灭基团荧光）下拉列表中，为探针选择适当的荧光。

5. 单击 Color （颜色）框，在 Color （颜色）对话框中选择一种颜色来代表探针，然后单击 OK （确定）。 6. 此外，也可单击 Notes （注释）字段，然后输入对该探针的任何附加说明。

7. 单击 OK （确定）以保存探针，并返回Detector

Manager （探针管理器）窗口。

8. 重复步骤 2 至 8 创建剩余探针。

荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制

1. 绝对定量定义

绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。

将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。

* Log(起始浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系

* 由样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量

2.

绝对定量标准品

标准品的一些标准 * 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同

* 标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）

* 标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数）

* 在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值

标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是基因组DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。

3. 标准品的制备

一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。

倍比梯度稀释方法：

1v原液（标准品i）+9v稀释缓冲液，得标准品ii

1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii

1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv

1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v

依次倍比稀释

拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算

4. 实例

标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700 测得其拷贝数1.55×108copy /ul

标准曲线的绘制（1cycle=1min） 设置对照：浓度为1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、1.55×101的标准样品各一个，设空白对照

２Ｏ１　７年第０４期　

（总第３０１期）　中阊高新技术企－业　

ｌ　ｃ　Ｈ　Ｔ…ｆ　ｓ“　ｔ　ｅ　Ｈ￡Ｈｔ￡　Ｉ；Ｅ：　ＮＯ．０４．２０１　７　

（ＣｕｍｕｌａｔｉＶｅｔｙＮＯ．３９１）　

绝对体积法和相对密度法检验定量　

包装商品净含量对比　

彭　慧　

（东阿县市场监督管理局，山东东阿２５２２０１）　

摘要：由于商品定量包装的特殊性，包装的选择给消费者、销售者和生产者带来不便商品计量的准确性，这　

引起了许多纠纷，为确保消费者的合法权益，国家质检总局组织净含量检定规程。文章介绍了检验定量包装　

商品净含量中的绝对体积法和相对密度法，并对二者进行了对比。　

关键词：绝对体积法；相对密度法；定量包装商品；净含量对比；测试结果　文献标识码：Ａ　

中图分类号：ＴＨ７１５　文章编号：１００９－２３７４（２０１７）（）４一ｏｏ６４—０２　０ＯＩ：１０．１３５３５／ｊ．ｃｎｋｉ．１１—４４０６／ｎ．２０１７．０４．０３３　

随着经济的发展和市场的繁荣，包装商品正日益成　

为人们日常消费的主要商品，一些很好的休闲食品不仅　

美味而且携带方便，被广大消费者喜欢。然而，由于商　

品定量包装的特殊性，包装的选择给消费者、销售者和　

生产者带来不便商品计量的准确性，这引起了许多纠　

纷，为确保消费者的合法权益，国家质检总局组织净含　

量检定规程。　

由于商品的定量包装是各种各样的包装，从食品、　

化妆品到洗涤用品、建材等超过ｌｏｏｏｏ￣，所以不可能为　

每一种包装都制定规则，而国家质检总局制定的商品检　

验细则，对定量包装净含量检验规则、商品净含量测量　

通用技术条件给出了实验原理。货物净含量的测量和检　

验方法，包括绝对体积法、相对密度法两种测试方法，　

虽然绝对体积法是常用的，但是相对密度法定量包装净　

含量定量检测的优点也很多。　

１绝对体积法　

该方法的原理是直接导入产品。该方法简单、易于　

操作。液体从容器中观察，因此，该方法仅适用于流动　

性好、透明度好、不挂墙液产品，如饮用水、酒等生产