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相对定量法

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Guide to Performing Relative Quantitation of

Gene Expression Using Real-Time Quantitative PCR

1Guide to Performing Relative Quantitation of Gene Expression Using Real-Time Quantitative PCR

Table of Contents

Section I: Introduction to Real-Time PCR and Relative Quantitation of Gene

Expression

1. Introduction 2. What is Relative Quantitation? 3. Terms and Acronyms 4. Relative Quantitation of Gene Expression Requires the Quantitation of Two Different Genes (Target and Endogenous Control) 5. Factors Affecting Accurate Real-Time PCR Results

6. What is PCR Amplification Efficiency? Section II: RNA Preparation and Reverse Transcription

1. Introduction 2. Quantifying Input RNA 3. Reverse Transcription (RT) for Relative Quantitation of Gene Expression 4. Selecting Reverse Transcription and Real-Time PCR Reagents 5. Determination of Input RNA Amounts for a Relative Quantitation Study 6. Identifying PCR Inhibition 7. How Much Genomic DNA Contamination can be Tolerated in a Relative Quantitation of Gene Expression Assay?

Section III: Assay Selection and Design for Relative Quantitation

Selecting or Designing Primers and TaqMan® Probes for Relative Quantitation of Gene Expression 1. TaqMan® Gene Expression Assays 2. Custom TaqMan® Gene Expression Assays 3. TaqMan® Pre-Developed Assay Reagents (TaqMan® PDARs) 4. Use of Primer Express® Software for the Design of Primer and Probe Sets for Relative Quantitation of Gene Expression 5. Design of Assays for SYBR® Green I Applications

Section IV. Identification and Selection of Endogenous Controls for Relative

Quantitation

1. Uniformity of Endogenous Control Expression. 2. Validation of Target and Control Genes for the Comparative CT Method 3. Multiplexing Endogenous Controls and Target Genes

Section V. Customized and Pre-Configured Relative Quantitation Gene Expression

Products

1. TaqMan® Low Density Arrays (7900HT Microfluidic Cards) 2. Pre-Configured TaqMan® Low Density Arrays (Immune Profiling) 3. TaqMan® Cytokine Gene Expression Plate 4. TaqMan® Human Endogenous Control Plate Section VI. Ordering Real Time PCR Reagents

2Section VII. Relative Quantitation of Gene Expression Experimental Design and

Analysis

1. Introduction 2. The Relative Standard Curve Method a. Example of the Standard Curve Method: Using an Independent Sample for a Standard Curve b. Standard Deviation Calculations Using the Standard Curve Method 3. The Comparative Ct Method (∆∆CT Method) a. A Validation Experiment is Necessary to Determine if your ∆∆CT Calculation is Valid b. Plotting the Results of the Validation Experiment c. Validation Experiment Results d. The Comparative CT Method (∆∆CT Method): Data Analysis Example e. What if a ∆∆CT Value is Positive? Appendix A Definitions

Appendix B Reagents, Protocols, and Supporting Documentation

3

Section I

Introduction to Real-Time PCR and

Relative Quantitation of Gene Expression

1. Introduction

Real-time quantitative PCR offers researchers a powerful tool for the quantitation of

target nucleic acids. To understand the value that real-time PCR provides over

traditional PCR methods and to obtain information on chemistries and strategies, you

can review: Real Time PCR vs. Traditional PCREssentials of Real Time PCR

This tutorial guides you through performing relative quantitation of gene expression

using real-time PCR technologies developed by Applied Biosystems. It assists you in

understanding the foundations of relative quantitation and provides guidance for

selecting assays, experimental strategies, and methods of data analysis. The

information presented is relevant for instrumentation, reagents, and consumables

provided by Applied Biosystems. This tutorial expands on many of the topics that are

introduced in User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression.

Throughout this tutorial there are many hyperlinks to external sites, documentation, and

links to pages within this document. After you go to one of these hyperlinks, click the back button on your browser to return to your original location in the document.

Applied Biosystems offers a variety of systems on which real-time quantitative PCR can

be performed. These real-time PCR instruments are:

• Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System

• Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System

• Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System

• ABI® PRISM 7000 Sequence Detection System

2. What is Relative Quantitation?

Methods for relative quantitation of gene expression allow you to quantify differences in

the expression level of a specific target (gene) between different samples. The data output is expressed as a fold-change or a fold-difference of expression levels. For

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相对定量和绝对定量

相对定量和绝对定量

相对定量和绝对定量

概述

在社会科学研究中，定量研究方法是一种非常重要的手段。其中，相对定量和绝对定量是两种常见的定量研究方法。相对定量研究方法着重考察事物之间的相对关系和差异，而绝对定量研究方法则重点关注事物本身的特性和数量。

相对定量

定义

相对定量研究方法是一种基于各项指标之间的相对大小或差异而进行分析和比较的方法。相对定量研究方法通过设定参照点或基准，将各项指标与之进行比较，进而得出相对大小或差异。

特点

• 相对定量研究方法注重指标之间的相对位置和比较，不关注具体数量的大小。

• 相对定量研究方法适用于无法直接量化的事物，如主观感受、态度等。

• 相对定量研究方法适用于涉及多个参与者或因素的研究，能够较为客观地反映事物之间的差异。

应用领域

相对定量研究方法广泛应用于社会学、心理学、教育学等领域。例如，通过对学生在不同科目中的相对表现进行比较和分析，可以了解各个学科之间的差异和相对重要性。 绝对定量

定义

绝对定量研究方法是一种基于具体数量和度量的方法。绝对定量研究方法通过明确的标准和度量方式，将事物进行具体化和数量化，以便于进行定量分析。

特点

• 绝对定量研究方法关注事物本身的特性和数量，注重精确的度量和计量。

• 绝对定量研究方法适用于能够直接量化的事物，如长度、重量、数量等。

• 绝对定量研究方法适用于需要精确分析和比较的情况，能够提供具体的数据支持。

应用领域

绝对定量研究方法广泛应用于统计学、经济学、自然科学等领域。例如，在经济学中，通过对不同地区的GDP进行绝对定量分析，可以了解各个地区的经济发展水平和差异。

相对定量 vs 绝对定量

相对定量和绝对定量是两种不同的定量研究方法，它们在研究对象、应用领域和研究手段上存在一定的差异。

研究对象

• 相对定量注重指标之间的相对位置和差异，适用于无法直接量化的事物，如主观感受、态度等。

• 绝对定量关注事物本身的特性和数量，适用于能够直接量化的事物，如长度、重量、数量等。

标准曲线法相对定量

标准曲线法相对定量

标准曲线法相对定量

标准曲线法是一种相对定量的分析方法，常用于测定样品中的目标物质含量。该方法基于样品与已知浓度的标准品之间的比较，通过建立标准曲线来推断未知样品中的目标物质含量。

实施标准曲线法的步骤如下：

1.

准备一系列已知浓度的标准品溶液。这些标准品的浓度应当覆盖待测物质的预计浓度范围。

2.

使用适当的分析方法（如吸光光度法、荧光法等）测定每个标准品的信号强度，例如吸光度或荧光强度。

3.

绘制标准曲线。将标准品的浓度作为横坐标，对应的信号强度作为纵坐标，在坐标图上绘制出标准曲线。通常使用线性回归或其他拟合方法对标准曲线进行拟合。

4.

测定待测样品的信号强度。使用同样的分析方法测定待测样品的信号强度。

5.

使用标准曲线推断待测样品中目标物质的浓度。根据待测样品的信号强度，在标准曲线上找到对应的浓度值。

相对定量是指通过比较待测样品与标准品之间的信号强度或峰面积来推断待测样品中目标物质的相对含量，而不是直接给出绝对浓度值。这是因为标准曲线法无法消除实验中的误差和变异性，因此只能提供相对的结果。

需要注意的是，标准曲线法的准确性和可靠性取决于标准品的准确性、分析方法的精确性以及实验条件的控制等因素。在使用标准曲线法进行定量分析时，应当严格按照标准操作程序和质控要求进行实验，以获得可靠的结果。

相对定量和绝对定量 2

相对定量和绝对定量 2

- 1 - 相对定量和绝对定量

相对定量和绝对定量都是科学研究中常用的方法，二者的差别在于相对定量是通过对比不同样本之间的差异来描述数据，而绝对定量则是通过确定样本中某种物质的量来描述数据。

相对定量是将不同的样本之间的相对含量进行比较，一般采用比值或者百分比的方式来表示。例如，在蛋白质组学研究中，可以通过比较两个不同组织或者不同病人的蛋白质组成来寻找新的生物标志物。相对定量的优点是可以快速比较不同样本之间的差异，但缺点是不能确定样本中物质的绝对量。

相反，绝对定量则是通过测定样本中某种物质的确切量来描述数据。例如，在分析蛋白质组成时，可以采用质谱技术来测定样品中某种特定蛋白质的绝对量。绝对定量的优点是可以准确地确定样品中物质的量，但缺点是需要更复杂的实验设置和数据处理方法。

在科学研究中，选择相对定量或绝对定量方法取决于研究目的和研究设计。相对定量适用于快速筛选或初步比较不同样本之间的差异，而绝对定量则适用于需要准确测定特定物质量的研究。

相对定量和绝对定量的区别

相对定量和绝对定量的区别

相对定量和绝对定量的区别

绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为 100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。

绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。

相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。

CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比，绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。相对定量的标准品容易在实验室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。