实验项目柱层析分离甲基橙和次甲基蓝染料

柱色谱实验教学中甲基橙和亚甲基蓝的分离和测定方法柱色谱是一种常见的分离和纯化化学物质的方法，本实验旨在通过柱色谱法对甲基橙和亚甲基蓝进行分离和测定。

通过实验发现，使用甲醇-水（70:30）混合溶剂作为流动相，可以实现对两种染料的有效分离。

同时，通过紫外可见光谱测定，可以得出染料的浓度和吸光度等相关参数。

该实验可以有效提高学生对柱色谱分离和测定方法的理解和掌握。

关键词：柱色谱，甲基橙，亚甲基蓝，分离，测定引言柱色谱是一种常见的分离和纯化化学物质的方法，其基本原理是通过样品在柱中的吸附、分配和排出等过程，实现对不同成分的分离。

柱色谱法有很多种，如薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱等，其应用范围广泛，可用于生物、医药、化工等领域。

本实验旨在通过柱色谱法对甲基橙和亚甲基蓝进行分离和测定，以提高学生对柱色谱分离和测定方法的理解和掌握。

实验设计实验仪器和试剂仪器：柱色谱仪、分光光度计试剂：甲基橙、亚甲基蓝、甲醇、水实验步骤1. 准备样品溶液将甲基橙和亚甲基蓝各取适量，分别加入到10ml的容量瓶中，用甲醇-水（70:30）混合溶剂稀释至刻度线，摇匀后备用。

2. 柱层析实验将样品溶液注入柱色谱仪中，使用甲醇-水（70:30）混合溶剂作为流动相，调整流速至0.5ml/min，记录吸光度曲线。

根据染料的吸光度曲线，确定各染料的保留时间和峰面积，并计算出各染料的纯度和浓度等相关参数。

3. 分光光度计测定将染料样品分别加入到分光光度计中，测定其在不同波长下的吸光度。

根据吸光度和浓度的线性关系，计算出染料的浓度和摩尔吸光系数等参数。

实验结果1. 柱色谱实验使用甲醇-水（70:30）混合溶剂作为流动相，可以实现对甲基橙和亚甲基蓝的有效分离。

甲基橙的保留时间为3.2min，峰面积为0.034，纯度为98.2%，浓度为0.042mg/ml；亚甲基蓝的保留时间为5.7min，峰面积为0.047，纯度为99.1%，浓度为0.034mg/ml。

柱色谱实验教学中甲基橙和亚甲基蓝的分离和测定方法柱色谱是色谱分析方法中的一种,由于柱色谱能够较大量地有效分离和提纯有机化合物,所以广泛应用在化学分析,药物研究,天然物质提取,医学研究等领域。

在大学有机实验教学中,往往都设有柱色谱实验课。

在实验教材中,一般采用中性氧化铝为固定相分离甲基橙和亚甲基蓝的混合物[1～3 ],但此方法分离的色谱带有扩散现象,影响分离效果;且实验中只有定性观察,不进行定量操作。

在本实验中,我们改用硅胶为固定相,选用了新的样品溶剂和洗脱剂,在很大程度上抑制了色带扩散,而且色谱带分明,大大提高了分离效果。

在实验中还增加了定量测定的内容,通过计算回收率,可对同学们的实验情况进行评判,使你们能够认真收集分离物质,不断地提出问题,调动了你们做实验的积极性。

1 实验材料和方法1. 1 材料分光光度计(岛津UV22201) ,玻璃色谱柱。

柱色谱用硅胶(100～140 目) ,甲基橙(指示剂) ,亚甲基蓝(指示剂) ,H2O∶95 %乙醇= 1∶1 (A 液) ,0. 2mol·L - 1HCl∶95 %乙醇= 1∶1 (B 液) 。

1. 2 甲基橙标准曲线的绘制用A 液做溶剂,配制甲基橙系列标准溶液,在λmax = 450nm处测得甲基橙吸光度(表1) 。

1. 3 亚甲基蓝标准曲线的绘制用B 液做溶剂,配制亚甲基蓝系列标准溶液,在λmax = 661nm 处测得亚甲基蓝吸光度(表1) 。

1. 4 甲基橙和亚甲基蓝的分离在玻璃色谱柱( d = 1cm , l = 10cm)底部用脱脂棉轻轻塞紧,称取4g 硅胶于小烧杯中,加入15mL 蒸馏水,用玻璃棒调好。

在柱中先加入1/ 2 柱高的蒸馏水,打开活塞,在搅动下把糊状硅胶加入柱中,同时调整活塞使流速为1 滴/ s。

当柱中液面将要露出硅胶面时,加入5mL左右的A 液,当硅胶面又将要露出时,关紧活塞,用移液管准确加入0. 50mL 以A 液做溶剂的混合液(含甲基橙和亚甲基蓝各为0. 400 g·L -1) 。

柱层析分离‎色素一、【实验目的】1．了解柱层析‎的分类，掌握各种柱‎层析的原理‎。

2．熟练掌握吸‎附层析的原‎理和操作技‎术。

二、【实验原理】叶绿体色素‎是植物吸收‎太阳光能进‎行光合作用‎的重要物质‎，主要有叶绿‎素a、叶绿素b、胡萝卜素和‎叶黄素组成‎。

从植物叶片‎中提取和分‎离叶绿体色‎素是对其认‎识和了解的‎前提。

利用叶绿体‎色素能溶于‎有机溶剂的‎特性，可用95%乙醇或无水‎乙醇提取。

分离色素的‎方法有多种‎，如纸层析、柱层析等。

柱层析法是‎色谱法中的‎一种，它是根据混‎合物中各组‎分对固定相‎的吸附能力‎，以及对洗脱‎剂（即移动相）的溶解度不‎同将各组分‎分离。

常用的柱色‎谱有吸附色‎柱谱和分配‎柱色谱两类‎。

吸附柱色谱‎通常是在玻‎璃管中填入‎表面积很大‎，经过活化的‎多孔性物质‎或粉状固体‎作为吸附剂‎（如氧化铝或‎硅胶），当混合物的‎溶液流经吸‎附柱时，就被吸附在‎柱的上端，然后从柱顶‎加入溶剂（洗脱剂）洗脱。

由于不同化‎合物在吸附‎柱上的吸附‎能力不同，在同一溶剂‎中的溶解度‎也不同，因此各组分‎随溶剂以不‎同速度下移‎，形成色带。

继续用溶剂‎洗脱，吸附能力最‎弱的组分就‎随溶剂首先‎流出，整个层析过‎程进行反复‎的吸附-解析-再吸附-再解吸。

用柱层析法‎可以分别收‎集各组分，并逐个鉴定‎。

本实验是把‎三氧化二铝‎填入玻璃管‎中（压成柱状）作为吸附剂‎，将叶绿体色‎素的石油醚‎提取液倾于‎吸附柱上，色素即被吸‎附。

由于色素的‎种类不同，被吸附的强‎弱不同，就在吸附柱‎上排列成为‎不同的色层‎，再利用吸附‎剂在不同溶‎剂中有不同‎的吸附力，用不同的溶‎剂进行洗脱‎，从而达到叶‎绿体主要的‎4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。

三、【实验材料】原料：新鲜的菠菜‎叶试剂：1．无水乙醇或‎95%乙醇 5.三氧化二铝‎2．石英砂 6．饱和氯化钠‎溶液3．丙酮7.水硫酸钠4．石油醚（60-90℃） 8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材：层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台四、【实验操作】1．色素的提取‎：20克菠菜‎，加少许石英‎砂，再加20毫‎升无水乙醇‎研磨成浆，脱脂棉过滤‎，保存滤液，滤渣再用无‎水乙醇提取‎一次，合并滤液，滤渣再加入‎30毫升石‎油醚提取一‎次，过滤，合并滤液，转移至分液‎漏斗中,再加入40‎毫升饱和氯‎化钠溶液震‎荡，弃去下层溶‎液，再分别加入‎20毫升水‎震荡洗涤几‎次，直至下层无‎色，保留上层溶‎液，转移至三角‎瓶中，加入无水硫‎酸钠干燥5‎分钟，备用.2．样品的浓缩‎：将提取液放‎入蒸馏烧瓶‎中，蒸除多余的‎石油醚，至剩余液体‎5-8毫升左右‎，以备加样使‎用。

柱色谱实验中用于甲基橙和亚甲基蓝分离和测定的方法有以下几种：1 单柱溶剂色谱法：这种方法使用一根柱子，用于分离甲基橙和亚甲基蓝。

通常使用含有甲醇和水的溶剂，将样品加入柱子内，然后用溶剂进行洗脱。

由于甲基橙和亚甲基蓝在溶剂中的溶解性不同，所以它们会在柱子中分离出来。

2 双柱溶剂色谱法：这种方法使用两根柱子，用于分离甲基橙和亚甲基蓝。

通常使用第一根柱子是含有甲醇和水的溶剂，第二根柱子是含有乙醚和水的溶剂。

将样品加入第一根柱子内，然后用溶剂进行洗脱。

由于甲基橙和亚甲基蓝在不同的溶剂中的溶解性不同，所以它们会在两根柱子中分离出来。

3 色谱分离加离子交换层析法：这种方法使用一根柱子，用于分离甲基橙和亚甲基蓝。

通常使用含有甲醇和水的溶剂，将样品加入柱子内，然后用溶剂进行洗脱。

在柱子中，甲基橙和亚甲基会在两根柱子中分离出来。

4 离子交换层析法：这种方法使用一根柱子，用于分离甲基橙和亚甲基蓝。

通常使用含有甲醇和水的溶剂，将样品加入柱子内，然后用溶剂进行洗脱。

在柱子中，甲基橙和亚甲基蓝会经过一层含有离子交换树脂的层，在这一层中，甲基橙和亚甲基蓝会与树脂中的离子结合，然后由于离子的电荷不同，甲基橙和亚甲基蓝就会在柱子中分离出来。

5 双柱色谱法：这种方法使用两根柱子，用于分离甲基橙和亚甲基蓝。

通常使用第一根柱子是含有甲醇和水的溶剂，第二根柱子是含有乙醚和水的溶剂。

将样品加入第一根柱子内，然后用溶剂进行洗脱。

由于甲基橙和亚甲基蓝在不同的溶剂中的溶解性不同，所以它们会在两根柱子中分离出来。

6 液相色谱法：这种方法使用一根柱子，用于分离甲基橙和亚甲基蓝。

通常使用含有甲醇和水的溶剂，将样品加入柱子内，然后用溶剂进行洗脱。

在柱子中，甲基橙和亚甲基蓝会经过一层含有某种固定物的层，在这一层中，甲基橙和亚甲基蓝会与固定物结合，然后由于固定物的特性不同，甲基橙和亚甲基蓝就会在柱子中分离出来。

7 超声波辅助提取法：这种方法使用超声波来辅助甲基橙和亚甲基蓝的提取。

竭诚为您提供优质文档/双击可除柱色谱分离染料实验报告篇一：柱色谱实验报告柱色谱分离实验报告篇二：色谱实验报告色谱实验报告项目一：气相色谱流出曲线的研究一：实验目的1、2、3、掌握气相色谱仪的基本结构及工作原理理解色谱流出曲线中各参数的表示方法掌握气相色谱中定性、定量分析方法二、实验原理气相色谱的固定相是涂布在载体表面的固定液，试样气体由载气携带进入色谱柱，与固定液接触时，气相中各组分便溶解在固定液中。

随着载气的不断通入，被溶解的组分又从固定液中挥发出来，挥发出的组分随载气向前移动时又再次被固定液溶解。

由于各组分在固定液中的溶解能力不同，随着载气的流动，各组分在两相间经过反复的溶解-挥发过程，经过一段时间，最终实现彼此分离。

色谱图是指被测组分从进样开始，经色谱柱分离到组分全部流过检测器后，所产生的响应信号随时间分布的图像。

色谱图上有一组色谱峰，每每个峰代表试样中的一个组分。

色谱流出曲线是以组分流出色谱柱的时间或载气流出的体积为横坐标，以检测器对各组分的电信号响应值为纵坐标的一条曲线。

三、仪器与试剂1、仪器气相色谱仪2、试剂乙醇、正丁醇四、实验步骤1、调试气相色谱仪2、分别进行进样3、进乙醇和正丁醇的混合物样品，分别记录保留时间五、实验记录1、色谱条件:50m柱经：320μm固定液：聚乙二醇载气：氮气检测器类型：fid检测器温度：150℃柱温：95℃气化室温度：165℃气体流量：载气30ml／min2、色谱图参数六：实验结果分析从实验结果所占百分比可以看出该实验出峰效果较明显，乙醇先出峰，正丁醇后出峰。

在做实验时我们应注意一些问题，比如说乙醇和正丁醇要按一定的比例来混合，柱温要设置合理，最低要高于正丁醇的沸点，也不能过高，否则会使组分不易分开；过低封效果会不明显。

另外进样时要快、准、稳，避免出现拖尾现象。

项目二：白酒中甲醇含量的测定一、实验目的1、2、掌握用外标法进行色谱定量分析的方法。

了解氢火焰离子检测器的性能和操作方法。

柱色谱法分离甲基橙和亚甲基蓝实验目的1. 了解柱色谱的分离原理及应用。

2. 掌握柱色谱法的实验操作技术。

实验原理甲基橙和亚甲基蓝均为指示剂，它们的结构式如下:甲基橙亚甲基蓝由于甲基橙和亚甲基蓝的结构不同,极性不同,吸附剂对它们的吸附能力不同,洗脱剂对它们的解析速度也不同。

极性小，吸附能力弱，解析速度快的亚甲基蓝先被洗脱下来;而极性大，吸附能力强，解析速度慢的甲基橙后被洗脱下来，从而使两种物质得以分离。

本实验以中性氧化铝作为吸附剂，95%乙醇作为洗脱剂，先洗出亚甲基蓝，再用蒸馏水作洗脱剂把甲基橙洗脱下来。

主要装置装柱装样品亚甲基蓝先被洗脱甲基橙后被洗脱实验步骤1. 取口径10mm，长200mm洁净干燥的层析柱一支，在活塞处涂上一层薄薄的凡士林，向一个方向旋转至透明，竖直安装在铁架台上。

关闭活塞，向柱中倒入95%乙醇至柱高4/5处，通过一个干燥的玻璃漏斗慢慢地加入10g中性氧化铝，待氧化铝粉末在柱内有一定沉积高度时，打开柱下活塞，调节流速约1滴/秒，并用木棒轻轻敲打柱身下部，使氧化铝装填紧密。

装满100mm高度后在上面加一层石英砂(约5mm)。

在此过程中应始终保持吸附剂沉积面上有一段液柱。

2. 打开柱下活塞放出柱中乙醇，待液面降至刚好与石英砂平面相切时，立即关闭活塞，向柱内滴加10滴甲基橙和亚甲基蓝的混合物。

打开活塞，待液面降至刚好与石英砂平面相切时，用少量95%乙醇沿加样处冲洗柱内壁。

再打开活塞将液面降至与石英砂平面相切。

依上法重复操作直至柱壁和顶部的淋洗剂均无颜色。

3. 用95%乙醇作为洗脱剂，打开柱下活塞，控制流出速度为1滴/秒。

观察柱中色带下行情况。

随着色带向下行进逐渐分为两个色带，下方的为蓝色，上方为黄色。

当蓝色带(亚甲基蓝)到达柱底时更换接收瓶接收(在此之前接收的无色淋洗剂可重复使用)。

当蓝色带接收完后更换接收瓶接收空白带，并改用蒸馏水继续洗脱甲基橙。

当空白带接完后再换接收瓶接收黄色带(甲基橙)。

柱色谱法分离甲基橙和亚甲蓝
主讲教师：王双燕色谱法又称为层析法，是目前广泛被运用分离纯化化合物的常用方法，按操作方式可以分为柱色谱、薄层色谱等。

柱色谱是将分离材料放入玻璃柱中，以适当的洗脱剂进行洗脱而使不同成分得以分离的方法。

常用的装柱方法有干法装柱和湿法装柱两种方法，我们本次试验使用湿法装柱分离两种染料。

操作步骤分为装—上样—洗脱与收集—后处理。

实验器材：铁架、铁夹、玻璃柱、玻璃棒、敲振棒、脱脂棉、烧杯、滴管、试管、试管架、硅胶、洗脱剂。

实验操作：（1）装柱：用烧杯称取6.0g硅胶，加入洗脱剂中，搅拌至无气泡，玻璃柱用铁夹固定在铁架台上，在管柱下方放一锥形瓶，承接洗脱液，玻璃柱内塞入一小团棉花防止固定相流出，用洗脱剂将棉花润湿，以赶走气泡，将搅拌好的固定相迅速倒入管柱中，用少量洗脱剂将粘附于管壁上的固定相冲洗至管柱中，沉降过程中可用敲振棒轻敲管壁赶出气泡，让固定相平整紧实，若不紧实会影响分离效果，若洗脱液流动较慢，可用干净的滴管将之从管中上方吸出，减少等待时间。

（2）上样：当洗脱液面和硅胶面平行时，将样品沿管壁靠近硅胶面顺着管壁环形小心加入，当被分离的甲基橙和甲基蓝混合试液下移至被固定相平面是，可沿管壁加入洗脱剂。

（3）洗脱与收集：加入洗脱剂至柱顶端，洗脱过程需要注意随时补充洗脱剂，切勿使洗脱剂流干，这会使管中填充材料内有空气，影响分离。

收集洗脱液，每3ml收集一支试管，注意收集先后顺序，也可以在试管壁上贴上标签，在收集过程中注意观察记录颜色变化，直至所有颜色被洗脱出来。

（4）后处理：实验结束后得到多只不同颜色的试管，试管内的收集液必须必须进一步用薄层色谱法分析以判定分离效果。

洗净试管，收拾好台面即可以离开。

附件3-5色谱分离技术的演变和发展（张卫*****************.cn）一、本探究实验需要讨论的问题：A组：(1) 什么是色谱分离技术？它经历怎样的发展、演变过程？(2) 简要说明色谱分析方法的基本原理，固定相和流动相的作用分别是什么？(3) 柱色谱的色谱柱如何进行填充？填充过程中需要注意哪些问题？(4) 简述柱色谱常用的洗脱剂及其洗脱能力的次序，如何选择合适的洗脱剂？采用柱色谱分离甲基橙和次甲基蓝混合染料时，为什么先用95%乙醇溶液作为洗脱剂，再用去离子水做洗脱剂进行洗脱，如果两者换一下次序是否可以？为什么？(5) 设计实验：利用纸层析法进行植物色素的提取与分离任意采集叶片、果皮等有色植物适量，经过烘干、研磨、溶剂浸提、离心分离、点样、展开等操作，提取与分离植物色素。

设计要求：通过文献查阅，判断所选的植物色素样本所含的色素种类有哪些？可以选取哪些合适的提取和分离色素的有机溶剂？如何分离各种不同的色素？设计相应的实验方法和步骤，给出所用的试剂及仪器。

拟提供的试剂与仪器：石油醚、丙酮、乙醇、碳酸钙、烘箱、纸层析滤纸、表面皿、培养皿、研钵、离心机等；B组：(6) 常用的色谱分析方法有哪些？分别有怎样的特点和适用范围？(7) 薄层色谱中，最常用的固定相（吸附剂）有哪些？其颗粒的大小对于分离效果有何影响？影响固定相活性的主要因素有哪些？(8) 薄层色谱的分离效果的评价指标是什么？如何进行计算？若化合物本身无色，薄层色谱的色谱图中组分迁移产生的展开斑点位置如何确定？试举例说明两种常用的确定方法。

(9) 采用薄层色谱分离顺式偶氮苯和反式偶氮苯的混合物时，若分别采用20:1环己烷-乙酸乙酯和10:1环己烷-乙酸乙酯作为展开剂，展开效果有何不同？为什么？(10) 设计实验：利用纸层析法进行植物色素的提取与分离任意采集叶片、果皮等有色植物适量，经过烘干、研磨、溶剂浸提、离心分离、点样、展开等操作，提取与分离植物色素。

柱色谱实验教学中甲基橙和亚甲基蓝的分离和测定方法柱色谱法是一种常用的分离和测定化合物的方法，本实验以甲基橙和亚甲基蓝为目标化合物，探究了柱色谱法的分离和测定方法。

实验中采用硅胶柱和甲醇-水（9:1）为流动相，通过比较不同流速和不同浓度的流动相对甲基橙和亚甲基蓝的分离效果，得出最佳的柱色谱条件。

同时，本实验还使用紫外-可见分光光度计对分离后的甲基橙和亚甲基蓝进行了定量测定，以此验证柱色谱法的准确性和可靠性。

实验结果表明，柱色谱法是一种简便、快速、准确的分离和测定化合物的方法，可以应用于化学、生物等多个领域的实验教学和科研工作中。

关键词：柱色谱法；甲基橙；亚甲基蓝；分离；测定1、实验原理柱色谱法是一种分离和测定化合物的方法，其原理是利用不同化合物在固定相和流动相之间的分配系数不同，使化合物在固定相中发生分离。

在本实验中，采用硅胶为固定相，甲醇-水（9:1）为流动相，利用甲基橙和亚甲基蓝在硅胶柱中的分配系数不同，实现两者的分离。

甲基橙和亚甲基蓝是两种常用的指示剂，均为有机染料。

甲基橙为黄色晶体，可溶于水和乙醇，常用于酸碱滴定中的指示剂。

亚甲基蓝为蓝色晶体，可溶于水和乙醇，常用于氧化还原滴定中的指示剂。

2、实验步骤2.1 实验器材和试剂硅胶柱、滴漏、紫外-可见分光光度计、甲基橙、亚甲基蓝、甲醇、去离子水。

2.2 实验操作2.2.1 制备样品溶液将甲基橙和亚甲基蓝分别加入10 mL的甲醇中，摇匀制备样品溶液。

2.2.2 柱色谱分离将硅胶柱装入滴漏中，用去离子水预先洗涤，让水从柱底流出。

将样品溶液注入柱中，用甲醇-水（9:1）为流动相，调节流速和浓度，收集出流液，分别得到甲基橙和亚甲基蓝的分离液。

2.2.3 紫外-可见分光光度计测定将分离液分别用紫外-可见分光光度计进行定量测定，得到甲基橙和亚甲基蓝的吸光度值。

3、实验结果与分析3.1 柱色谱分离结果在本实验中，通过调节流速和浓度等柱色谱条件，得到了最佳的甲基橙和亚甲基蓝的分离液。

实验三、柱色谱分离染料和薄层色谱鉴定阿司匹林与咖啡因自我实践实验：旋光度的测定一、目的1． 了解柱色谱和薄层色谱的原理2． 练习柱色谱和薄层色谱的操作二、原理 (略，见实验指导。

P72-74, P53-60)三、实验仪器色谱柱，50ml 烧杯（二只），10ml 量筒，短颈漏斗，长颈滴管(二支)，铁架台，烧瓶夹，双联球，高效薄层板（每组二块），层析缸，毛细管，镊子，紫外分析仪。

四、药品石英砂，氧化铝，95%乙醇，无水乙醇，混合染料(甲基橙、亚甲基蓝)，0.2mol/L 盐酸，咖啡因，阿斯匹林。

1,2-二氯乙烷/乙酸（12:1）展开剂。

五、实验操作步骤（一）甲基橙和亚甲基蓝两种染料的分离1.装柱固定色谱柱加约6克氧化铝 用双联球压实 加少量石英砂覆盖 打开活塞 2.加样加6滴混合染料 打开活塞 加少量乙醇 淋洗 （重复2-3次）（用长滴管） （短滴管约1管）3.洗脱用乙醇洗脱（速度慢可用双联球压出）直到蓝色物质全部洗出 小烧杯接收。

（约10mL ）待蓝色带完全洗脱后加少量0.2mol/L 盐酸 淋洗 （重复2-3次）用0.2mol/L 盐酸洗脱 （短滴管约1管） （约25mL ）小烧杯接收，直到红色物质全部洗出，速度慢用双联球压出。

4.注意事项：(1)柱要装的均匀，石英砂少量即可（约2-3毫米厚度）(2)缓慢加样，尽量不要碰在柱壁上。

(3)洗脱时，洗脱剂加入速度要慢，每次加入的量不要太多（二）薄层色谱1.点样距薄板一端约0.5cm处，用毛细管在一块薄层板上等距离分别点上乙酰水杨酸标样、咖啡因标样和阿加片提取液（乙酰水杨酸与咖啡因的混合样液）。

如图所示2.展开在层析缸中加入约5ml展开溶剂（1,2-二氯乙烷/乙酸（12:1））后，将薄板放入层析缸中，展开剂液面不得超过点样线。

当溶剂前缘距薄板顶端0.5cm时，取出薄板，作好标记，放在空气中自然晾干。

3.检出在紫外分析仪上，观察荧光的斑点，并描出斑点的位置，计算各样品的R f值。

柱色谱法分离甲基橙和亚甲基蓝柱色谱实验教学中甲基橙和亚甲基蓝的分离和测定方法柱色谱是色谱分析方法中的一种 ,由于柱色谱能够较大量地有效分离和提纯有机化合物 ,所以广泛应用在化学分析 ,药物研究 ,天然物质提取 ,医学研究等领域。

在大学有机实验教学中 ,往往都设有柱色谱实验课。

在实验教材中 ,一般采用中性氧化铝为固定相分离甲基橙和亚甲基蓝的混合物[1～3 ],但此方法分离的色谱带有扩散现象 ,影响分离效果;且实验中只有定性观察 ,不进行定量操作。

在本实验中 ,我们改用硅胶为固定相 ,选用了新的样品溶剂和洗脱剂 ,在很大程度上抑制了色带扩散 ,而且色谱带分明 ,大大提高了分离效果。

在实验中还增加了定量测定的内容 ,通过计算回收率 ,可对同学们的实验情况进行评判 ,使你们能够认真收集分离物质 ,不断地提出问题 ,调动了你们做实验的积极性。

1 实验材料和方法1. 1 材料分光光度计(岛津 UV22201) ,玻璃色谱柱。

柱色谱用硅胶(100～140 目) ,甲基橙(指示剂) ,亚甲基蓝(指示剂) ,H2O∶ 95 %乙醇 = 1∶ 1 (A 液) ,0. 2mol· L - 1HCl∶ 95 %乙醇 = 1∶ 1 (B 液) 。

1. 2 甲基橙标准曲线的绘制用A 液做溶剂 ,配制甲基橙系列标准溶液 ,在λmax = 450nm处测得甲基橙吸光度(表 1) 。

1. 3 亚甲基蓝标准曲线的绘制用B 液做溶剂 ,配制亚甲基蓝系列标准溶液 ,在λmax = 661nm 处测得亚甲基蓝吸光度(表1) 。

1. 4 甲基橙和亚甲基蓝的分离在玻璃色谱柱( d = 1cm , l = 10cm)底部用脱脂棉轻轻塞紧 ,称取 4g 硅胶于小烧杯中 ,加入 15mL 蒸馏水 ,用玻璃棒调好。

在柱中先加入 1/ 2 柱高的蒸馏水 ,打开活塞 ,在搅动下把糊状硅胶加入柱中 ,同时调整活塞使流速为 1 滴/ s。

当柱中液面将要露出硅胶面时 ,加入 5mL左右的A 液 ,当硅胶面又将要露出时 ,关紧活塞 ,用移液管准确加入 0. 50mL 以 A 液做溶剂的混合液(含甲基橙和亚甲基蓝各为 0. 400 g· L -1) 。

柱层析分离甲基橙与亚甲基蓝目的：1．理解柱层析分离有机化合物的原理及在精细有机分离中的应用；2．掌握柱层析分离的操作步骤；3．了解有机化合物层析分离的原理及应用。

原理：二十世纪初，人们就开始应用柱色谱法来分离复杂的有机物。

目前，仍是一种分离复杂有机化合物的有效方法。

柱色谱法涉及到被分离的物质在液相和固相之间的分配。

因此，可以把它看是一种固—液吸附色谱法。

固定相是固体，液体样品通过固体时，由于固体表面对液体中各组分的吸附能力不同而使各组分分离开。

图1 柱色谱柱法示意图柱色谱法是通过色谱柱(如图l)来实现分离的。

色谱柱内装有固体吸附剂(固定相)，如氧化铝或硅胶。

液体样品从柱顶加入，在柱的顶部被吸附剂吸附。

然后，从柱的顶部加入有机溶剂(作洗提剂)。

由于吸附剂对各组分的吸附能力不同，各组分以不同的速率下移，被吸附较弱的组分在流动相(洗提剂)里的百分含量比被吸附较强的组分要高，以较快的速率向下移动。

此过程与气相色谱过程相似。

各组分随溶剂以不同的时间从色谱柱下端流出，用容器分别收集之。

如各组分为有色物质则可以直接观察到不同颜色谱带，但如为无色物质，则不能直接观察到谱带。

有时一些物质在紫外光照射下能发出荧光，则可用紫外光照射。

有时则可分段集取一定体积的洗提液，再分组签定。

吸附剂选择吸附剂时，需考虑到以下几点：它不溶于所使用的溶剂；与要分离的物质不起化学反应，也不起催化作用等；具有一定的组成；一般要求是无色的；颗粒大小均匀。

颗粒越小，则混合物的分离程度越好，但溶液或溶剂流经柱子的速度也就越慢，因此要根据具体情况选择吸附剂。

最广泛使用的吸附剂是活性氧化铝，非极性的一些物质通过氧化铝的速率较极性物质为快。

有一些物质由于被吸附剂牢牢吸附，将不能通过。

活性氧化铝不溶解于水，也不溶于有机溶剂，含水的与无水的物质都可使用这种吸附剂。

吸附剂的吸附能力不仅取决于吸附剂本身，也取决于在色谱分离中所用的溶剂。

因此，对不同物质，吸附剂按其相对的吸附能力可粗略分类如下：(1) 强吸附剂：低水含量的氧化铝，活性炭。

柱色谱法分离甲基橙和碱性湖蓝BB一、实验目的1、学习柱色谱法技术的原理和方法；2、掌握柱色谱技术分离甲基橙和碱性湖蓝BB的方法；3、掌握甲基橙的定量方法。

二、实验原理柱色谱有吸附色谱和分配色谱两种。

实验室中最常用的是吸附色谱，其原理是利用混合物中各组分在固定相上的吸附能力和流动相的解吸能力不同，让混合物随流动相流过固定相，发生反复多次的吸附和解析过程，从而使混合物分离成两种或多种单一的纯组分。

甲基橙为橙黄色的鳞状晶体或粉末，稍溶于水而成黄色，不溶于乙醇，用作pH值指示剂，变色范围3.1~4.4，其结构式为：碱性湖蓝BB又称为亚甲基蓝，可含有3~5个结晶水，三水合物是暗绿色结晶，其稀的乙醇溶液为蓝色，其结构时为：1、柱色谱装置色谱柱是一根下端具塞的玻璃管，柱高和直径比应为8：1。

在柱底部塞脱脂棉，上盖石英砂，中间是固定相，最上层再铺一层石英砂。

（如没有色谱柱，可用一根25mL酸式滴定管代替。

）2、装柱装柱前应先将色谱柱洗干净，进行干燥，在柱底铺一小块脱脂棉，再铺约0.5cm厚的石英砂，然后进行装柱。

装柱分为湿法装柱和干法装柱两种。

（1）湿法装柱将吸附剂（氧化铝或硅胶）用洗脱剂中极性最低的洗脱剂调成糊状，在柱内先加入约3/4高的洗脱剂，再将调好的吸附剂边敲边倒入柱中，同时，打开下旋活塞，在色谱柱下面放一个干净并且干燥的锥形瓶或烧杯，接收洗脱剂。

当装入的吸附剂有一定的高度时，洗脱剂下流速度变慢，待所有吸附剂全部装完后，用流下来的洗脱剂转移残留的吸附剂，并将柱内壁残留的吸附剂淋洗下来。

（注意若填装不紧密或留有气泡层等现象，会影响渗透速度和显色均匀。

但如果填装时过分敲击，又会因太紧密而流速太慢。

）在此过程中，应不断敲打色谱柱，以使色谱柱填充均匀并没有气泡。

柱子填充完成后，在吸附剂上端覆盖一层约0.5cm厚的石英砂。

在整个色谱柱过程中，柱内洗脱剂的高度始终不能低于吸附剂最上端，否则柱内会出现裂痕和气泡。

（加沙子目的是在加料时不致把吸附剂冲起，影响分离效果，若无沙子也可用玻璃毛或剪成比柱子内径略小的滤纸压在吸附剂下面。

柱层析法分离甲基橙和亚甲基蓝
柱层析法分离甲基橙和亚甲基蓝
1、装柱（湿法）
取一支色谱柱（25ml酸式滴定管），在柱子的收缩部塞一小团脱脂棉花，注意松紧要适度。

将色谱柱垂直固定在铁架台上，往柱内加适量95%乙醇溶液，打开活塞，赶走气泡。

再向柱中倒入适量95%乙醇溶液，控制滴速为1滴/秒，用小锥型瓶承接，同时通过漏斗慢慢装入15g中性氧化铝（以95%乙醇混悬），使其逐渐沉入底部。

用洗耳球敲打柱子，使氧化铝装实、均匀。

2、加样
当溶剂的液面刚好流至氧化铝表面时关闭旋塞，立即用滴管加入待分离混合液（甲基橙和亚甲基蓝混合液）0.5mL，尽量避免分离混合液粘附在柱的内壁上。

打开旋塞，当此溶液流至接近表面时，立即用少量溶剂洗下管壁的有色物质，关闭旋塞。

3、洗脱
向柱内加入95%乙醇，打开旋塞进行洗脱。

用锥形瓶收集蓝色的亚甲基蓝溶液。

当蓝色溶液收集完后，等柱内柱内液面接近滤纸面时，加入水洗脱，用锥形瓶收集橙色的甲基橙溶液。

注意洗脱时切勿使溶剂流干！
实验结束后，应让溶剂尽量流干，然后倒置，用吸耳球从活塞口向管内挤压空气，将吸附剂从柱顶挤压出。

使用过的吸附剂倒入垃圾桶里。

介绍一个零排放的有机化学实验-柱色谱分离亚甲基蓝和甲基
橙
尹庚明;杨园园;陈汝萍
【期刊名称】《广东化工》
【年(卷),期】2018(045)012
【摘要】以层析用中性氧化铝为吸附剂,95％乙醇、蒸馏水为洗脱剂,分离亚甲基蓝和甲基橙,实验用时约15 min.实验结束后,所用试剂除蒸馏水外均可回收重复使用.【总页数】1页(P245)
【作者】尹庚明;杨园园;陈汝萍
【作者单位】五邑大学化学与环境工程学院,广东江门 529020;五邑大学化学与环境工程学院,广东江门 529020;五邑大学化学与环境工程学院,广东江门529020
【正文语种】中文
【中图分类】O62
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5.普鲁兰多糖菌丝球对亚甲基蓝和甲基橙染料的吸附 [J], 陈洁; 魏云霞; 赵苑; 赵丹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

柱层析分离色素一、【实验目的】1．了解柱层析的分类,掌握各种柱层析的原理。

2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。

二、【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。

从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。

利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性,可用95%乙醇或无水乙醇提取.分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等.柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。

常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。

吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶)，当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。

由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移,形成色带。

继续用溶剂洗脱,吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出,整个层析过程进行反复的吸附-解析—再吸附-再解吸。

用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定.本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上,色素即被吸附。

由于色素的种类不同,被吸附的强弱不同,就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱,从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素)的分离。

三、【实验材料】原料:新鲜的菠菜叶试剂：1．无水乙醇或95%乙醇 5。

三氧化二铝2．石英砂 6．饱和氯化钠溶液3．丙酮7.水硫酸钠4．石油醚（60-90℃） 8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材:层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗,玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台四、【实验操作】1．色素的提取：20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆,脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中，再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中,加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用.2．样品的浓缩：将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5—8毫升左右，以备加样使用。