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响应面法优化恩拉霉素发酵培养基唐慧慧;杨淑慎;郭伟利;李清黎【摘要】Plackett-Burman experiment was used to evaluate the optimal level of 8 factors in Streptomyces fungicidious ERS42-101108 Enramycin initial fermentation medium production , results showed that cottonseed meal , gluten meal and KH 2 PO4 had significantly effect on enramycin production .Steepest ascent was used to approach the key factors of the maximum response region , and by central composite design and response surface , optimum fermentation medium was established .Following the above optimization process , fermentation unit Enramycin increased from 8300 u/mL to 10250 u/mL.%通过Plackett－Burman实验对杀真菌链霉菌Streptomyces fungicidious ERS42－101108产恩拉霉素初始发酵培养基中的8个因素的最佳水平进行评价，表明棉籽饼粉、麸质粉和磷酸二氢钾对恩拉霉素产量影响显著。
用最陡爬坡实验逼近关键因素的最大响应区域，通过中心组合实验和和响应面分析，确定了最佳发酵培养基。
经上述优化，恩拉霉素发酵单位从8300 u ／mL提高到10250 u／mL。
响应面法优化杏鲍菇液体发酵培养基翟宏伟;陈晓明【摘要】设计并通过响应面优化了一种适用于杏鲍菇(Pleuromse cryngii)液体发酵的新培养基TSM-1.以单因子试验筛选出指标具有显著影响的TSD-1微生物生长促进剂,液体多肽蛋白肥和NaCl,并通过Box-Behnken设计以及响应面分析得到了3因子最优添加量,形成TSM-1培养基的最优配方:葡萄糖40 g,酵母浸膏10 g,KH2PO41g,MgSO4·7H4O 0.5 g,NaCl 0.15 g,复合维生素B片1片(市售OTC 成药),添加TSD-1微生物生长促进剂0.3 g,钙蛋白2 g,蒸馏水1 000 mL,pH值6.4,121℃灭菌30 min.优化后TSM-1培养基中杏鲍菇菌丝生物量可达18.70±0.03 g·L-1.【期刊名称】《天津农业科学》【年(卷),期】2018(024)009【总页数】4页(P52-55)【关键词】杏鲍菇;培养基;优化;响应面【作者】翟宏伟;陈晓明【作者单位】天津科技大学,天津300457;天津科技大学,天津300457【正文语种】中文【中图分类】S646自1948年以来，利用液体层发酵技术培养各种食用菌引起人们的极大重视[1]。
相对于食用菌的固体培养而言，液体培养既可以缩短培养周期又提高了培养效率，特别适合于食用菌的规模化、周年化、工厂化生产，要实现杏鲍菇的大规模商品化生产，应用液体菌种是必然。
截至目前，有关杏鲍菇液体培养均集中于杏鲍菇对不同碳氮源的利用上，但有关生长促进剂在食用菌液体发酵培养基中的应用鲜有报道。
因此，笔者尝试设计并优化了一种新的适用于杏鲍菇的液体深层发酵培养基TSM-1，并添加了食用菌生长促进剂TSD-1、钙蛋白制剂、渗透压调节剂NaCl，以响应面法对TSM-1液体培养基中这3种特殊成分进行优化，以培养基中杏鲍菇菌丝的最大生物量为标准，确定了TSM-1液体培养基的最优配方，为食用菌生长促进剂在杏鲍菇液体深层发酵上的应用打下基础。
响应面分析法优化交沙霉素发酵培养基胡平;林开春【摘要】以交沙霉素产生菌R29为供试菌株,采用响应面法综合实验设计,利用SAS分析软件对交沙霉素发酵培养基进行了优化.结果表明:棉籽饼粉和豆油为主效应因素,且培养基中棉籽饼粉和豆油最佳比例分别为1.9％和0.405％时,预测交沙霉素的发酵效价为220.6 μg/mL.经验证试验,最优条件下交沙霉素的发酵效价为221.8 μg/mL,与预测值相近,比原始配方下交沙霉素的发酵效价提高了10.66％.说明优化的发酵配方确实比初始配方更有利于菌株R29的产素.【期刊名称】《湖北民族学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(031)002【总页数】4页(P138-141)【关键词】响应面分析法;交沙霉素;发酵培养基【作者】胡平;林开春【作者单位】恩施职业技术学院生物工程系,湖北恩施445000;华中农业大学植物科学与技术学院,湖北武汉430070;华中农业大学植物科学与技术学院,湖北武汉430070【正文语种】中文【中图分类】Q816;TQ92交沙霉素是那波链霉菌交沙霉素变种(Streptomyces narbonensis var. Josamyceticus)产生的一种十六元环大环内酯类抗生药物，于1964年由日本山之内制药株式会社研制而成，对葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎双球菌和百日咳杆菌、梭状芽胞杆菌、白喉杆菌、炭疽杆菌、布氏杆菌、军团菌、螺旋杆菌、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体等亦有较好抗菌作用[1]，临床用于呼吸道感染、支气管炎、肺炎、副鼻窦炎、中外耳炎、皮肤感染、术后创口感染、泌尿科、五官科、口腔科感染等，疗效确切.自诞生以来，它就在世界范围内广泛应用于临床了[2-3].但是在国内的应用仅处于起步阶段，目前尚无厂家生产原药，具有相当大的研发潜能.为尽快实现交沙霉素原料药的国产化，首先要提高交沙霉素产生菌的产素能力，而优化发酵培养基是其中的关键环节之一.近年来，国内外很多研究人员利用响应面分析法(Response Surface Analysis，RSA)在培养基优化方面取得了良好的效果[4-6].笔者以本实验室的交沙霉素产生菌R29为供试菌株，采用响应面法综合实验设计，利用SAS分析软件对发酵培养基进行了优化，为该菌的产业化开发提供现实依据.1.1 供试菌种交沙霉素产生菌那波链霉菌交沙霉素变种(Streptomyces narbonensis var. Josamyceticus)R29菌株，由武汉天惠生物工程有限公司提供.1.2 培养基1.2.1 斜面培养基土豆泥10%,麦片2.5%,精氨酸0.02%,琼脂2%,消前pH7.2～7.4.1.2.2 种子培养基葡萄糖1.0%,淀粉1.0%,黄豆饼粉1.5%,硫酸镁0.05%,酵母粉0.5%,碳酸钙0.3%,磷酸氢二钾0.5%.消前pH8.0.1.2.3 发酵培养基葡萄糖2.0%,棉籽饼粉2.0%,豆油1.0%,碳酸钙0.3%,玉米淀粉4.0%,磷酸二氢钾0.03%,面筋粉2.0%,硫酸镁0.05%,氯化钠0.1%,消前pH8.0.1.3 菌种发酵将保藏的斜面菌种用竹签打块接入种子培养基，28℃、180 r/min摇床培养34 h.将种子培养液接入发酵培养基，接种量8%，28℃、180 r/min摇床培养8 d.1.4 交沙霉素检测采用高效液相色谱法(HPLC)：色谱柱为C18反向柱(填料Hypersil ODS 25 μm，4.6 mm×250 mm)；柱温为室温；流动相为磷酸缓冲液(0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液，用1 mol/L的磷酸调节pH值为3)-甲醇(体积比为20∶80，pH 3)；流速为1.0 mL/min；紫外检测波长为232 nm；进样量为10 μL；交沙霉素参考品为杭州民生药业生产的交沙霉素糖衣片，含量200 mg/片.1.5 优化设计方法1.5.1 Placket-burman (PB)设计采用PB设计的两水平法对交沙霉素产生菌发酵培养基的9种成分进行试验，筛选交沙霉素发酵的主效应因素.1.5.2 最陡爬坡试验根据方法1.5.1中得出的一次拟和方程设计最陡爬坡试验.方程中变量的系数如果为正，则该水平应设计为递增，反之递减；变量系数的大小决定变化幅度，系数越大，变化的幅度越小，反之越大.1.5.3 Box-wilson中心组合设计和响应面分析以方法1.5.2中得到的中心点，根据Box-wilson中心组合设计原理设计响应面分析试验.根据响应面试验设计结果，运用SAS软件进行回归拟合，得到模型方程，根据所得模型的响应面分析立体图，结合回归方程，求得模型极值点，该点代表的主效应因子数据即为预测的最佳发酵培养基配方比例值.1.5.4 验证性试验分别在预测最优发酵条件和初始条件下进行发酵试验，重复5次，根据交沙霉素在预测最优发酵条件下的实际平均效价值，与初始条件下的结果进行比较，验证该模型的预见是否准确，从而确定交沙霉素的发酵培养基最佳配方.2.1 PB设计试验结果以R29为供试菌株进行PB设计的试验方案及结果见表1、表2.表1中棉籽饼粉和豆油的Pr>|t|分别为0.034和0.022，即表示这两个因素在95%的置信区间显著.用SAS软件对试验数据进行回归分析，得到一次回归方程：Y=427-32.0A+6.17B-7.00C-2.17D-40.2E+4.17F+4.83G-1.67H-2.50J.经过回归数据分析，R-Sq=97.5%，R-Sq(adj)=86.1%，系数数值大，表明拟合良好，P=0.048，小于0.05，表明回归方程拟合良好.根据表1中t-检验结果可知，棉籽饼粉和豆油为重要因素，在95%置信区间其可信度分别为96.6%和97.8%，可考虑作为主效应因子进行下一步的优化试验.2.2 最陡爬坡试验结果根据PB试验结果可知棉籽饼粉和豆油为重要因素，而葡萄糖、碳酸钙、玉米淀粉、磷酸二氢钾、面筋粉、氯化钠和硫酸镁均对交沙霉素的产出无显著影响，这些因素保持原始水平不变.根据PB试验得出的一次拟和方程对棉籽饼粉和豆油进行最陡爬坡试验，结果如表3所示.可知最优条件在处理6和处理7之间，故采用1.9%棉籽饼粉，0.4%豆油为后续响应面试验的中心点.2.3 中心组合设计及响应面试验设计结果保持发酵培养基配方中除棉籽饼粉和豆油以外的其它6个因素水平不变，以中心点(棉籽饼粉1.9%，豆油0.4%)，对棉籽饼粉和豆油两个因素进行中心试验组合设计.中心点重复5次，保证拟合方程具有旋转性和通用性，中心组合试验设计见表4，响应面试验设计及结果见表5.将相应面中得到的数据，利用SAS软件回归拟合，得到交沙霉素效价的二次经验模型为：Y=546.80+3.81A+7.21B-95.34A2-85.34E2+11.75AE；同时得到响应面分析立体图见图1，从图1可以看出，棉籽饼粉和豆油对交沙霉素产出的效应存在着一定的交互作用.对Y进行回归系数评估，结果表明A2和E2在大于F值的概率(Pr>F)分别为0.001、0.002，即A2和E2为显著影响项；变异系数的分析表明，2次项影响在大于F值的概率(Pr>F)为0.001，即2次项影响为显著影响项；方差分析数据表明在大于F值的概率(Pr>F)为0.005，说明回归方程有很高的可靠性和显著性；且拟合方程的决定系数R2值为0.959 9，表明该方程与实际有很好的拟合性，可用来进行交沙霉素发酵效果的分析和预测.根据回归方程结合响应面分析立体图，求得模型极值点为A=0，E=0.05，对应棉籽饼粉和豆油分别为1.9%和0.405%，此时预测交沙霉素的发酵效价为220.6 μg/mL.2.4 验证性试验结果选用菌株R29在预测最优条件即和发酵初始条件下进行发酵试验，得到实际平均交沙霉素发酵效价分别为221.8 μg/mL和200.4 μg/mL，最优条件下交沙霉素的发酵效价与预测值相近，说明该模型能准确的预见交沙霉素的实际发酵效价，同时优化得到的发酵培养基配方下交沙霉素的发酵效价比原始配方下交沙霉素的发酵效价提高了10.66%，说明优化的发酵配方确实比初始配方更有利于菌株R29的产素.通常发酵培养基的优化方法是采用单因素试验，但单因素试验因无法考察到各因素之间的交互影响而存在一定的局限性，因而该方法不是总能获得最佳条件[7].此外，若考察的因素较多，则实验次数会较多，周期长，为了弥补单因素试验的缺陷，许多研究人员在单因素试验的基础上采用了正交设计法[8-9]、二次正交旋转组合设计[10]、均匀设计法[11，12]、改进单纯形法[13-14]和响应面分析[15]等方法进行条件的优化工作.本试验首次将PB设计、最陡爬坡试验、中心组合设计和响应面分析等方法运用于交沙霉素产生菌发酵培养基的优化试验中，并借助SAS统计软件快捷可靠地获得了较优的发酵培养基配方，取得了较好的效果.因此，采用相应面法优化发酵培养基是一种行之有效的实验方法，但此研究仅限于摇瓶发酵，仍需上罐分批发酵进一步验证，而且，本试验并未对装料量、通气、起始pH值、温度、转速、诱导物、前体物质和补料等其他的发酵工艺参数进行研究试验，对这些发酵条件尚需进一步探索.【相关文献】[1] Richard E R, Robert B, Lola W G,et al. 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北方园艺２００９（２）：１２７～１２９・专题综述・响应面莹在发酵培养基优丫匕中的应用刘志祥，曾超珍（中南林业科技大学生命科学与技术学院，湖南长沙４１０００４）摘要：介绍了响应面法的原理和实验设计的方法，并对其在优化发酵培养基中的应用做了详细的综述。
关键词：响应面法；发酵培养基；优化中图分类号：ＴＱ９２０．１文献标识码：Ｂ文章编号：ｉ００１－－０００９｛２００９）０２－－０１２７－－０３响应面法（ＲＳＭ）是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对函数响应面和等高线的分析，能够精确地研究各因子与响应值之间的关系，寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法［１］。
它可用在描述单个试验变量对响应值的影响、确定试验变量之间的相互关系、描述所有试验变量对响应值的综合影响。
ＲＳＭ是一种适用性强的试验设计方法，不仅包括试验设计、建模、因子效应评估以及寻求因子水平最佳操作条件等功能，而且具有数据统计处理功能，显示出了其它试验方法如正交试验、因子试验、田口试验方法等所不具备的优点，该法不但具备试验次数少，周期短、精度高等优点［２］，而且可以建立连续变量曲面模型；同时，对影响试验指标的各因子水平及其交互作用进行优化和评价，可快速有效地确定多因子系统的最佳条件Ｃｓ－ｓ］。
ＲＳＭ已经在食品、医药、生物工程、农业、天然物提取等领域广泛的应用。
１响应面法在培养基优化中的试验设计利用微生物发酵生产各种有用代谢产物，其培养基成分种类繁多，各成分间的相互作用也错综复杂，因而，微生物培养基的优化工作就显得尤为重要。
数学统计中的多种优化方法已开始广泛地应用于微生物发酵培养基的优化工作中，其中以响应面法的效果最为显著。
响应面法优化培养基的试验设计步骤为：①利用Ｈａｃｋ—ｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ（ＰＢ）试验确定主要影响因素：ＰＢ设计法是一种两水平的试验设计方法。
它试图用最少的试验次数达到使因素的主效果尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素第一作者简介：刘志祥（１９７８－），男．在读博士，讲师，研究方向为天然产物提取与植物生物技术。
响应面法优化地衣芽孢杆菌A2发酵培养基为了提高地衣芽孢杆菌A2(Bacillus licheniformis A2)发酵液的活菌含量,采用Hackett-Burman设计法和响应面分析法对其发酵培养基进行优化。
先用Plackett-Burman 设计从8种原料中筛选出对活菌含量有显著影响的因素,再用最陡爬坡试验及Box-behnken 设计进一步优化。
结果表明,MgSO4·7H2O、酵母粉和尿素是影响发酵液活菌含量的显著因素,优化后的培养基为:可溶性淀粉5g/L,尿素1.29g/L,K2HPO46g/L,KH2PO43g/L,MnSO4·H2O 0.2g/L,MgSO4·7H2O 0.41g/L,豆粕10g/L和酵母粉0.99g/L。
在此条件下,发酵液中A2的活菌含量可以从优化前的4.73×10^10CFU/mL提高到1.30×10^11CFU/mL。
酵母菌的培养大多数酵母菌为腐生,其生活最适pH为4.5一6,常见于含糖分较高的环境中,例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。
酵母菌生长迅速,易于分离培养,在液体培养基中,酵母菌比霉菌生长得快。
利用酵母菌喜欢酸性环境的特点,常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液(这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长),然后在固体培养基上用划线法分离之。
常用的培养基有:(一)麦芽汁培养基的配制1.培养基成分新鲜麦芽汁,一般为10-15波林。
2.配制方法(1)用水将大麦或小麦洗净,用水浸泡6-12h,置于15℃阴凉处发芽,上盖纱布,每日早、中、晚淋水一次,待麦芽伸长至麦粒的两倍时,让其停止发芽,晒干或烘干,研磨成麦芽粉,贮存备用。
(2)取一份麦芽粉加四份水,在65℃水浴锅中保温3-4h,使其自行糖化,直至糖化完全(检查方法是取0.5ml的糖化液,加2滴碘液,如无蓝色出现,即表示糖化完全)。
(3) 糖化液用4-6层纱布过滤,滤液如仍混浊,可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清,加水20 m1,调匀至生泡沫,倒入糖化液中,搅拌煮沸,再过滤)。
