ELISA定量检测新生牛血清中乙脑抗体方法的初步验证

ELISA法检测疫苗中残余牛血清蛋白含量的方法学验证董小曼;田博;杨冰;潘殊男;栗妍;沈淑琴;王晋【期刊名称】《现代仪器与医疗》【年(卷),期】2006(012)006【摘要】为验证ELISA法检测病毒性疫苗中残余牛血清蛋白方法的可靠性,由2个部门对12个样品进行4人连续3天的验证.结果表明:4人连续3天的12次检测结果均满足牛血清白蛋白ELISA法(BSP-ELISA法)标准曲线成立的条件,建立合格标准曲线的成功率为100%;对5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL浓度的牛血清白蛋白(BSP)标准品,不同实验人员间测定结果的变异系数在2.87%～6.33%之间,精密度较好;回收率在92.9%～103.1%之间,说明不同人的测定结果准确度高.分别采用该方法与已上市的牛血清白蛋白试剂盒对7种疫苗中100个样品的残余BSP含量进行检测,二者的检测结果合格符合率为100%,用该方法对已上市的检测BSA试剂盒中的4个标准品进行检测,回收率在90.0%～117.1%,检测灵敏度为2.5ng/mL,表明BSP-ELISA法可以敏感、准确地定量检测BSA,可用于目前我公司疫苗制品中残余牛血清白蛋白的质量控制.【总页数】5页(P21-25)【作者】董小曼;田博;杨冰;潘殊男;栗妍;沈淑琴;王晋【作者单位】北京天坛生物制品股份公司,北京,100024;北京天坛生物制品股份公司,北京,100024;北京天坛生物制品股份公司,北京,100024;北京天坛生物制品股份公司,北京,100024;北京天坛生物制品股份公司,北京,100024;北京天坛生物制品股份公司,北京,100024;北京天坛生物制品股份公司,北京,100024【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.ELISA法检测干细胞溶液中残留牛血清白蛋白含量 [J], 宛莹;聂德志;贲亮;黄若洋2.ELISA法检测组织工程产品中残留牛血清蛋白含量 [J], 方玉;冯晓明;奚廷斐;杜晓丹;陈震3.三种检测猪瘟疫苗中牛血清蛋白含量的ELISA试剂盒的性能对比 [J], 曹玉美;方茜;陆江;孙如水;孙龙4.应用ELISA竞争法检测疫苗制品中残余的牛血清白蛋白 [J], 李长贵;周铁群;王剑锋;邱平5.检测疫苗残余牛血清ELISA试剂的质量控制 [J], 潘殊男;刘保奎因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

收稿日期:2006-01-23;修回日期:2006-04-06作者简介:潘殊男(1974-),男,硕士,助理研究员,主要从事检测方法研究。

E L I S A 法检测疫苗中牛血清残留量的适用性研究潘殊男,杨冰,刘保奎,董小曼(北京天坛生物制品股份有限公司,北京100024)摘　要:为了验证E L I S A 法对病毒性疫苗中残余牛血清蛋白检测的适用性,用牛血清蛋白E L I S A 测定法与牛血清白蛋白E L I S A 测定法、牛血清I g G -E L I S A 测定法对麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗洗涤前病毒培养液、洗涤后病毒收获液以及多种成品疫苗中的残余牛血清蛋白含量进行了测定。

结果显示,麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗洗涤前病毒培养液中牛血清白蛋白含量依次为I g G 含量的70.5倍、65倍、84.3倍,洗涤后病毒收获液中两者比值分别为4.2、1.8和8.1;牛血清白蛋白E L I S A 法和牛血清蛋白E L I S A 法均能检测出疫苗中牛血清白蛋白,但前者测不出牛血清I g G ,而后者可准确检测牛血清I g G 。

牛血清蛋白E L I S A 测定法可同时检测牛血清白蛋白和牛血清I g G ,更适用于疫苗残余牛血清蛋白含量的测定。

关键词:牛血清;E L I S A ;适用性中图分类号:R 446.61文献标识码:A文章编号:1005-5673(2006)03-0023-04I n v e s t i g a t i o no na p p l i c a b i l i t y o f E L I S Ai nd e t e c t i o no f r e s i d u a l b o v i n e s e r u m c o n t e n t s i nv i r a l v a c c i n e s P A NS h u -n a n ,Y A N GB i n g ,L I UB a o -k u i ,e t a l .(B e i j i n gT i a n T a nB i o l o g i c a l P r o d u c t s C o .,L T D ,100024,C h i n a )A b s t r a c t :T o v a l i d a t e t h e a p p l i c a b i l i t y o f E L I S Ai nd e t e c t i o n o f r e s i d u a l b o v i n e s e r u mc o n t e n t s i n s o m e v i r u s v a c c i n e s ,b y w h i c hi n c l u d e d m e a s u r e m e n t o f r e s i d u a l p r o t e i n s f r o m b o v i n e s e r u m i nc u l t u r e s b e f o r e w a s h i n g a n dh a r v e s t e d c u l t u r e s a f t e r w a s h i n g i n p r e p a r a t i o no f v a c c i n e s f o r m e a s l e s ,m u m p s a n d r u b e l l a .T h r e e k i n d s o f E L I S Am e t h o d s c o u l d b e u s e d i nd e t e c -t i o no f b o v i n e s e r u mp r o t e i n s ,b o v i n e s e r u ma l b u m i n a n d b o v i n e I g Gr e s p e c t i v e l y .T h e r e s i d u a l c o n t e n t s o f b o v i n e s e r u ma l -b u m i n a r e 70.5、65a n d 84.3f o l d s a s t h o s eo f b o v i n e I g Gi n v i r u s c u l t u r e s b e f o r ew a s h i n gi nm e a s l e s ,m u m p s a n dr u b e l l a v a c c i n e s ,w h e r e a s a f t e r w a s h i n g i nh a r v e s t e d c u l t u r e s t h e r a t i o s o f b o t ho f t h e ma r e r e d u c e d t o 4.2,1.8a n d 8.1f o l d s r e -s p e c t i v e l y .B o v i n e s e r u mp r o t e i n s -E L I S Ac a nb e u s e di nd e t e c t i o no f B S Aa n db o v i n eI g G i nah i g h l y s e n s i t i v ew a y ,b u t B S A -E L I S A i s o n l y c o n d u c t e d o n d e t e r m i n a t i o n o f B S A .T h e f o r m e r i s m o s t a p p l i c a b l e t h a n t h e o t h e r t w o o n d e t e c t i n g r e s i d -u a l b o v i n e s e r u m a l l e r g e n si nv i r u s v a c c i n e s ,b e c a u s eB S A a n db o v i n eI g G a r eb o t hp r i m a r yr e s i d u a l a l l e r g e n si nt h e s e p r e p a r a t i o n s .K e yw o r d s :B o v i n e s e r u m ;E L I S A ;A p p l i c a b i l i t y 《中国生物制品规程》2000年版规定,疫苗中残余的牛血清蛋白残留量不得超过50n g /m l 〔1〕。

牛结节性皮肤病ELISA检测试剂盒验证试验
牛结节性皮肤病（Bovine Nodular Dermatosis）是一种常见的牛类皮肤病，主要由多义鼠天著病毒（Duboisia Species Poxvirus）引起。

该病在全球范围内都有报道，对养殖业造成了严重的经济损失。

目前，依靠临床症状来进行诊断的方法并不准确，快速、灵敏、特异性的实验方法是关键。

ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的生物学实验技术，能够在较短的时间内检测到血清中的抗体或抗原。

对于牛结节性皮肤病的检测，ELISA可以用于检测牛体内特异性
的抗体，以确诊和追踪流行病学数据。

为了验证牛结节性皮肤病ELISA检测试剂盒的准确性和可靠性，我们进行了一系列的
试验。

我们收集了不同地区患有牛结节性皮肤病的牛的血清样本，并对其进行了处理和稀释。

然后，将处理后的血清样本添加到已经涂有特异性抗原的微孔板中，使抗原与抗体结合。

随后，将酶标记的二抗加入孔中，与特异性抗体结合。

经过洗涤，添加底物后，酶活
性会产生颜色反应，反应的强度与样本中抗体的浓度成正比。

通过对一系列样本的检测，我们发现牛结节性皮肤病ELISA检测试剂盒具有较高的敏
感性和特异性。

我们的结果表明，该试剂盒可以可靠地检测到牛结节性皮肤病抗体的存在，并可用于流行病学调查和疾病诊断。

在验证试验中，我们还比较了该试剂盒与其他相关试剂盒的结果。

结果表明，牛结节
性皮肤病ELISA检测试剂盒的结果与其他试剂盒的结果一致，且具有较高的一致性和可重
复性。

这进一步验证了该试剂盒的准确性和可靠性。

牛结节性皮肤病ELISA检测试剂盒验证试验牛结节性皮肤病是一种常见的皮肤疾病，主要由牛结节性皮肤病病毒（Bovine Papular Stomatitis Virus，BPSV）引起。

该疾病主要通过接触感染传播，造成牛群中的经济损失。

早期诊断和有效的防控策略对于牛群的健康和生产至关重要。

目前，牛结节性皮肤病的诊断方法主要包括临床症状观察、病原学检测和免疫学检测等。

ELISA检测方法因其高灵敏度和高特异性而广泛应用于牛结节性皮肤病的诊断。

为了保证ELISA检测试剂盒的准确性和可靠性，需要进行验证试验。

验证试验需要准备阳性和阴性样品。

阳性样品是已确诊感染牛结节性皮肤病的牛血清，阴性样品是未感染牛血清。

这些样品可以通过实验室收集或者通过与兽医机构合作获得。

确保样品的来源可靠和可追溯。

验证试验需要按照说明书中的操作步骤进行，确保操作的准确性和规范性。

将阳性和阴性样品稀释成相同浓度。

然后，取一定量的稀释样品加入试验板中，进行一系列的洗涤、染色和显色操作。

根据试验板中反应产生的颜色强度，判断样品中是否存在BPSV抗体。

验证试验的结果需要进行数据分析和统计学处理。

可以使用标准曲线法将样品的OD值与阳性和阴性对照品的OD值进行比较，计算出相对OD值或者抗体滴度。

通过比较阳性和阴性样品的结果，可以确定ELISA检测试剂盒的准确性和可靠性。

验证试验的结果需要验证机构进行评估和批准。

评估机构将根据验证试验的结果和数据分析，评估ELISA检测试剂盒是否符合标准要求。

只有经过评估和批准的ELISA检测试剂盒才能在临床实验室中使用。

牛结节性皮肤病ELISA检测试剂盒的验证试验是确保检测结果的准确性和可靠性的重要步骤。

通过准备样品、规范操作、数据分析和评估等步骤，可以保证ELISA检测试剂盒在诊断牛结节性皮肤病中的应用价值和有效性。

牛结节性皮肤病ELISA检测试剂盒验证试验牛结节性皮肤病是一种常见的牛类皮肤疾病，由牛结节性皮肤病病毒引起。

该疾病主要通过接触传播，对牛群的健康和生产都会造成严重影响。

对于牛结节性皮肤病的检测和诊断是非常重要的。

ELISA检测试剂盒是目前常用的一种诊断方法，然而对于其准确性和稳定性的验证试验是至关重要的。

本文就牛结节性皮肤病ELISA检测试剂盒的验证试验进行介绍和讨论。

一、试验目的本次试验的主要目的是对牛结节性皮肤病ELISA检测试剂盒进行验证，评估其准确性、灵敏度和特异性，为该检测试剂盒的临床应用提供科学依据。

二、试验样品本次试验选取了来自不同地区的50份牛血清样品，其中包括25份阳性样品和25份阴性样品。

阳性样品经过病毒分离鉴定，确诊为牛结节性皮肤病，而阴性样品则经过临床检测及相关实验，排除了患有该疾病的可能。

三、试验方法1. ELISA检测方法将阳性和阴性样品进行ELISA检测，按照试剂盒说明书进行操作。

根据检测结果，评估该检测试剂盒的准确性和稳定性。

2. PCR检测方法对所有样品进行牛结节性皮肤病病毒的PCR检测，作为对ELISA检测结果的对照和验证。

四、试验结果经过ELISA检测后，阳性样品的OD值明显高于阴性样品，且阳性样品出现阳性反应，而阴性样品未出现阳性反应。

通过比对ELISA检测结果和PCR检测结果，发现两种方法的检测结果一致，验证了ELISA检测试剂盒的准确性和稳定性。

本次验证试验结果表明，牛结节性皮肤病ELISA检测试剂盒具有较高的准确性和稳定性，能够准确检测牛结节性皮肤病的阳性和阴性样品。

该检测试剂盒可以作为牛结节性皮肤病的临床诊断工具，为防控该疾病提供了重要的技术支持。

六、试验注意事项在进行本次验证试验时，我们需要特别注意以下几点：1. 严格按照试剂盒说明书进行操作，确保操作的准确性和一致性。

2. 样品的选择要具有代表性，能够充分反映实际检测的情况，以保证试验结果的可靠性。

乙型脑炎病毒ELISA抗原检测方法的建立与应用梅 力，李么明，陈 龙，朱碧波，叶 静，陈焕春，曹胜波（华中农业大学动物医学院，武汉，430070）摘 要：乙型脑炎（乙脑）是一种严重的人畜共患性疾病，建立一套快速、灵敏并同时可用于多种临床样品中乙脑抗原检测的方法具有重要意义。

本文以乙脑E蛋白单克隆抗体为一抗，以乙脑兔源多克隆抗体为二抗，建立了一种可用于检测猪、人、蚊子中乙脑抗原的双抗体夹心ELISA诊断方法。

实验结果表明，该方法灵敏度高，特异性强，稳定性好，通过对60份临床样品的检测，显示出其与RT-PCR方法具有较高的符合率。

关键词：乙型脑炎病毒；ELISA；抗原乙脑是由乙型脑炎病毒（JEV）引起的一种危害严重的虫媒病毒性疾病，近年来其在东南亚的流行分布范围正在不断扩大。

该病毒主要经过蚊子进行传播，猪是该病毒的扩增宿主和传染源，感染后可引起母猪流产、死胎、木乃伊胎及公猪发生睾丸炎，对公众健康及畜牧业的发展都造成了严重的影响。

迄今，国内外用于乙脑检测的方法可以分为抗原检测和抗体检测两大类。

对抗原的检测主要包括病毒的分离鉴定、分子生物学方法如RT-PCR等。

该类方法检测周期长、操作繁琐、对实验条件要求严格，不适用于临床大规模检测。

针对抗体的诊断方法主要指血清学检测方法，如ELISA、乳胶凝集实验、补体结合试验、血凝抑制试验等，但这些传统的抗体检测方法也仅能用于疫苗免疫效果的评价，不能用于对病毒感染情况的监测。

因而建立一种快速、简便、特异、灵敏的病原检测方法，并能够同时应用于临床患者及感染动物的诊断，就成为了乙型脑炎防治技术研究中的一项重要课题。

已证实，利用乙型脑炎病毒囊膜E蛋白制备的单克隆抗体具有很高的中和活性，它可以与乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位发生特异性的结合。

而利用病毒多个抗原表位制备的多克隆抗体则具有结合力更强、反应效果更好的特性，因此，本文利用这两种抗体建立了乙型脑炎双抗体夹心ELISA抗原诊断方法，并可用于猪、蚊子和人的临床样品检测，这将为乙型脑炎的诊断和防治提供有效的工具。

ELISA方法详细过程及步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。

它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。

此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

(一) 原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。

即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。

比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

(二) 操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

(简称洗涤，下同)。

2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤。

(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+ ”、“-”号表示。

牛呼吸道合胞体病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立李艳婷;侯喜林【摘要】In order to develop a double antibody sandwich assay (DAS-ELISA) for detecting bovine respiratory syncytial virus (BRSV),New Zealand white rabbits and BALB/c mice were immunized with the purified G protein as an antigen to prepare anti-G protein polyclonal and monoclonal antibodies.The antibody concentration and reaction conditions of DAS-ELISA were optimized by square titration,and its sensitivity,specificity,and coincidence rate were validated.Five hybridoma were stably secreting Mab which subclass belonged to IgG1κ.Western blot and IFA test showed that PcAb and Mab could react specifically with G protein and BRSV.The PcAb and Mab as the capture antibody and detection antibody respectively,and their optimal worki ng concentrations were determined to be 2.5 μg/mL and 10μg/mL,the critical value 0.22 and the detection limit of 1.43μg/mL,batch,inter-assay coefficient of variation less than 10 ％.The DAS-ELISA had no cross-reaction with several pathogens which often caused bovine respiratory disease.When 45 nasal swabs of clinical samples were simultaneously detected by the DAS-ELISA and RT-PCR,thesensitivity,specificity and coincidence rate were92.0 ％,100 ％,95.6 ％,respectively.It' s indicated that the established DAS-ELISA detection method can be used to detect a large number of clinical samples.It was the foundation of monitoring and quick diagnosis for BRSV.%目的建立牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法.方法以重组纯化的BRSV-G蛋白免疫家兔和小鼠,制备抗G蛋白的多克隆抗体(PcAb)和单克隆抗体(MAb),方阵滴定法优化DAS-ELISA方法抗体工作浓度及反应条件,并对其敏感性、特异性、符合率进行验证.结果获得5株稳定分泌抗G蛋白MAb 的杂交瘤细胞株,分泌抗体亚类均为IgG1型κ链,Western blot、IFA试验表明PcAb和MAb均与G蛋白和BRSV发生特异性反应,MAb作为捕获抗体的最佳包被浓度为2.5 μg/mL,PcAb作为检测抗体最佳工作浓度为5 μg/mL,判定临界值为0.22,最低检测限为1.43 μg/mL,批内和批间重复性试验变异系数均小于10％,与常引起牛呼吸道疾病的几种病原均无交叉反应,与RT-PCR的敏感性、特异性、符合率分别为92.0％、100％、95.6％.结论建立的检测BRSV的DAS-ELISA方法可用于临床样品的大规模检测,为BRSV疫情的监测和快速诊断奠定了基础.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2017(033)007【总页数】9页(P628-636)【关键词】牛呼吸道合胞体病毒;G蛋白;多克隆抗体;单克隆抗体;DAS-ELISA【作者】李艳婷;侯喜林【作者单位】黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆 163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆 163319【正文语种】中文【中图分类】R373.1牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)是引起犊牛呼吸道疾病的主要病原[1]。

ELISA原理及步骤ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量特定抗原或抗体的方法。

ELISA技术可广泛应用于医学、生物学、农业和环境科学等领域，具有高灵敏度、高特异性和高通量的优点。

直接ELISA是最简单的一种ELISA形式，其中将特异性抗体直接固定在微孔板上，然后加入样品，特异性抗原与固相抗体结合，并使用标记的二抗或酶偶联的二抗进行检测。

标记的二抗与样品中的抗原结合，从而实现抗原的检测。

间接ELISA类似于直接ELISA，但使用的是一种抗体，该抗体不与待检测抗原直接结合，而是与特异性抗体结合。

首先，特异性抗体被固定在微孔板上，然后样品中的抗原经过结合，在该阶段，非特异性蛋白质将被洗掉。

接下来，加入与待测抗原特异性结合的二抗。

最后，使用标记的二抗或酶偶联的二抗进行检测，以确认待测抗原的存在。

竞争ELISA用于检测分析物，如细胞因子、激素或抗生素等。

在该方法中，待检测抗原被固定在微孔板上，标记的分析物样品添加到孔中，这些样品中的分析物会与待测抗原竞争结合到固定的抗体上。

最后，通过测量分析物与固定抗体的竞争程度，来确定分析物的浓度。

间接竞争ELISA则结合了间接ELISA和竞争ELISA的原理，主要用于检测抗体的含量。

在该方法中，先固定检测抗体在微孔板上，再加入不同浓度的标准抗体或待测抗体样品。

标准或待测抗体与固定的检测抗体竞争结合，最终通过测量标准或待测抗体与检测抗体的竞争程度，来确定抗体的含量。

1.用特异性抗体涂覆固定在微孔板上，这可以通过免洗、半干燥或吸附方式实现。

2.加入样品，让待测抗原与固定在板上的特异性抗体结合。

3.洗涤板子以去除非特异性蛋白质，以减少干扰。

4.添加二抗或酶偶联的二抗，它会与待测抗原特异性结合。

5.再次洗涤板子以去除未结合的二抗。

6.加入底物，底物受酶的作用而发生颜色变化。

7.加入终止液以停止反应。