突变型人胰岛素原基因的克隆及其腺病毒载体的构建

基因工程生产人胰岛素的技术路线人胰岛素是一种重要的药物，用于治疗糖尿病等疾病。

传统的人胰岛素生产方法是从猪胰腺中提取，但存在感染风险和胰岛素结构与人体有差异等问题。

为了解决这些问题，科学家们利用基因工程将人胰岛素基因克隆到大肠杆菌等微生物中，通过基因表达、突变、筛选、纯化等步骤，生产出高质量的人胰岛素。

技术路线如下：1. 克隆人胰岛素基因：从人胰岛细胞中分离出mRNA，利用反转录酶将其转录成cDNA。

通过PCR扩增，将人胰岛素A、B链合成成一个完整的人胰岛素基因。

在该过程中，要注意选择合适的启动子、终止子、信使RNA起始和终止密码子等。

将该基因插入到载体中，如大肠杆菌质粒pBR322中的限制性内切酶位点，使其能够在大肠杆菌中表达。

2. 基因表达：将含有人胰岛素基因的重组质粒经过转化技术，导入到大肠杆菌中，利用细胞自身的代谢活性，让其经过转录、翻译等步骤，表达出人胰岛素前体蛋白(Proinsulin)。

Proinsulin蛋白由A、B两个多肽链组成。

其中A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸。

A链和B链由两个酯键连接在一起，形成Proinsulin。

Proinsulin在细胞内被剪切成人胰岛素A、B链和C肽。

其中C肽并无生理作用，被细胞内酶降解分解。

3. 突变筛选：由于大肠杆菌系统中表达的人胰岛素前体蛋白形成的Proinsulin无法自行成熟转化为人胰岛素，因此必须人为帮助B链成熟多肽链的脱落。

突变技术可以改变Proinsulin分子内酶解的敏感性和特异性，使B链多肽链和C肽之间的酯键能够被限制酶特异性水解，得到纯度较高的人胰岛素。

4. 纯化：通过离心、层析、过滤等技术，将发酵液中的人胰岛素纯化提取。

常用的纯化方法包括离心、酸性沉淀、离子交换层析、有机溶剂沉淀、逆流层析、凝胶过滤等。

整个生产过程包括基因克隆、表达、突变、筛选、纯化，一般需要经过6-7天的培养过程。

通过基因工程生产人胰岛素，不仅能够解决传统人胰岛素来源的问题，而且能够生产高质量、高效率的人胰岛素。

类人胰岛素原多拷贝重复基因原核表达载体的构建与表达罗联忠;陈仲巍;叶子坚【期刊名称】《南昌大学学报（理科版）》【年(卷),期】2014(000)003【摘要】The human pre-insulin gene was redesigned for optimal expression in Escherichia coli through the alteration of its codon bias to reflect were redesigned according to the Codon Preference Parameter of Esch-erichia coli codon preference,and the C peptide of human preinsulin was replaced with Lys-Lys.Then the redesigned human pre-insulin gene (hINS)was cloned using Polymerase Chain Reaction (PCR),and fur-ther performed as a template on which based the multi-copy genes of hINS (hINS-M)was cloned by PCR with several couples of specialprimers.Besides,sequences of both the Restriction Enzyme and Trypsin cut-ting sites were included in the primers.Accordingly,restriction Endonucleases were employed to cut the PCR products,and T4 DNA Ligase was then employed to tape the cut PCR produces to the differently de-signed multi-copies of the hINS-M.The prokaryotic expression vectors of these multi-copies genes were constructed and transformed into host Escherichia coli strains for expression.Furthermore,dodecyl sufate, sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE),coomassie brilliant blue staining,photodensi-tometry,and mass spectrometry were employed to analyze the the expression products of the hINS-M.Our results indicatedthat the expression efficiency of the 4-copies gene of hINS-M was significantly higher than that of the others.The ratio of the expression product of the 4-copies gene hINS-Mthe human preinsulin to the total expression proteins of the host strains was over 28.0%.The ratio was about 3 times of that of the expression product of the 1-copy gene of hINS-M.Moreover,the expression products from the different mutil-copes genes of hINS-M were all indentified to be the re-designed human preinsulin.Therefore,the prokaryotic expression vectors of the multi-copies genes of hINS-M could be used to improve the expres-sion efficiency of the recombinant human preinsulin.%根据大肠杆菌密码子偏好性，优化人胰岛素原基因序列，同时用2个赖氨酸取代 C链。

携带可调控人胰岛素基因的腺病毒载体的构建和鉴定徐美东;张轶群;沈坤堂;姚礼庆;秦新裕【期刊名称】《中国临床医学》【年(卷),期】2006(013)002【摘要】目的:构建携带葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)启动子控制下的人胰岛素基因的腺病毒载体.方法:将GIP-hIns基因自pCDNA3-GIP-hIns质粒中酶切下来,克隆至切除CMV启动子的pCA13-△CMV质粒中,形成转移质粒pCA13-GIP-hIns,然后与质粒pBHGE3共转染至293细胞株,在其中同源重组形成腺病毒颗粒.采用PCR方法对重组体进行鉴定,同时测定病毒滴度.体外转染STC-1细胞,并采用RT-PCR检测感染腺病毒的细胞内有无hIns mRNA的转录.结果:由pCA13-GIP-hIns和pBHGE3共转染至293细胞后,可得到阳性重组体Ad.GIP-hIns,经PCR检测表明已含有GIP-hIns基因.纯化所得腺病毒滴度约为1×1011pfu/ml.RT-PCR 证实在感染重组体腺病毒Ad.GIP-hIns的细胞中有相应mRNA的转录.结论:成功构建了携带GIP启动子控制下的人胰岛素基因的腺病毒载体,为进一步胰岛素基因治疗糖尿病的实验研究奠定了基础.【总页数】3页(P246-248)【作者】徐美东;张轶群;沈坤堂;姚礼庆;秦新裕【作者单位】复旦大学附属中山医院普外科,上海,200032;复旦大学附属中山医院普外科,上海,200032;复旦大学附属中山医院普外科,上海,200032;复旦大学附属中山医院普外科,上海,200032;复旦大学附属中山医院普外科,上海,200032【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.人端粒酶逆转录酶启动子调控的携带胞嘧啶脱氨酶基因腺病毒载体的构建 [J], 黄淑华;彭芝兰;王和2.携带人白细胞介素10和肝细胞生长因子双基因的重组腺病毒载体构建与鉴定[J], 邱红;朱月蓉;邢继成;江淑芳;苏长青;曹祥荣;方琳3.携带Egr-1基因调控序列的TK基因的腺病毒载体的构建 [J], 刘金龙;郭仕英;刘训良;李朝军;杜青;郭治源;夏建国4.携带人血管内皮生长因子165基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定 [J], 周炜;冯进波;王旭平;刘春喜;姜虹;王荣;丁士芳5.携带KGF基因重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 贾庆华;哈小琴;吕同德;刘春杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达吴岚晓;李明;王萍;陈白虹【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2002(023)001【摘要】目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1),构建hIGF-1原核表达载体,并进行表达与纯化.方法以pUCIGF质粒为模板,PCR 扩增了hIGF-1基因.经适当酶切后,构建表达载体pRSET-IGF,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化.结果带有重组质粒pRSET-IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后,以可溶性形式表达7.8 kD大小的蛋白,其表达量占菌体总蛋白量的10%～20%,纯化后目的蛋白纯度达95%以上,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF-1抗原活性.结论构建了pRSET-IGF重组质粒,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达,为获得大量基因工程产品奠定了基础.【总页数】3页(P1-3)【作者】吴岚晓;李明;王萍;陈白虹【作者单位】第一军医大学,珠江医院,血液科,广东,广州,510282;第一军医大学,热带病研究室,广东,广州,510515;第一军医大学,热带病研究室,广东,广州,510515;第一军医大学,热带病研究室,广东,广州,510515【正文语种】中文【中图分类】Q78;R977.15【相关文献】1.人胰岛素样生长因子Ⅱ基因的克隆与表达 [J], 王保莉;王凤泽;张涌;郭蔼光2.人胰岛素样生长因子-1基因克隆及其真核表达载体的构建 [J], 牛嗣云;岳凤鸣;陈志宏;高维娟;高福禄3.人胰岛素样生长因子-1基因的克隆、表达及生物活性分析 [J], 祁雅慧;王雅梅;孙丽翠;司杨;闫豫东;张静宜;邴国英4.人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及在真核细胞的表达 [J], 周海斌;郑祖根;董启榕5.大肠杆菌偏嗜性人胰岛素样生长因子1基因的克隆及表达 [J], 梁东春;左爱军;郭刚;张镜宇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

关于人OAZ突变基因的克隆构建及重组蛋白表达【摘要】目的构建人鸟氨酸脱羧酶抗酶（OAZ）突变基因，重组至原核表达载体中并表达出重组蛋白。

方法采用基因定点突变技术在OAZ基因TCCTGATG(199～206)位置造成第202位碱基T碱基缺失，使核糖体的阅读框+1移位，连续表达OAZ基因的ORF2部分。

测序鉴定后，重组质粒转化BL21菌，进行突变基因的蛋白表达。

结果重组质粒经测序后确认202位碱基T缺失，其余碱基序列无变化。

重组的突变基因转入BL21后在IPTG诱导下表达OAZ全长蛋白，SDS-PAGE分析在相对分子质量45 900左右出现新的蛋白条带。

结论成功构建人OAZ突变基因重组质粒，转化BL21后表达出融合的OAZ全长蛋白，为进一步研究其临床应用打下基础。

【关键词】鸟氨酸脱羧酶抗；突变；蛋白表达鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）是多聚胺生物合成中的关键酶，催化多聚胺生物合成途径中的第一步――鸟氨酸向腐胺的转变。

随后，腐胺再转变为亚精胺、精胺。

ODC是该代谢途径的限速酶，在此过程中扮演着重要的调控酶角色，其活性可在转录、翻译和翻译后水平受到精确的调控。

鸟氨酸脱羧酶抗酶（ornithine decarboxylase antizyme，OAZ）是在翻译后水平的一种调控形式，它可以连接到ODC蛋白上，抑制其催化活性并靶向地促使26S蛋白酶降解ODC，从而负性调控细胞内多聚胺含量。

有研究表明，细胞内OAZ的过度表达在降低细胞内多胺水平的同时还能抑制细胞的生长。

由此推测，OAZ在细胞的生长与分化过程中担任着重要的角色［1~3］。

OAZ蛋白的表达有一个非常有趣的移位翻译现象，其表达受到精胺的一个称之为frame-shifting的核糖体移位的调控。

多聚胺通过这种较罕见的调控机制诱导OAZ蛋白的生成，又反向抑制多聚胺在细胞内的浓度，使细胞在一个稳定的多聚胺水平进行正常生长分化。

基因工程生产人胰岛素的技术路线胰岛素是一种重要的激素，用于调节血糖水平。

由于胰岛素在治疗糖尿病等疾病方面的重要作用，因此研究和生产人胰岛素的技术一直备受关注。

基因工程技术是目前生产人胰岛素的主要方法，下面介绍人胰岛素的基因工程生产技术路线。

1. 克隆人胰岛素基因首先，需要从人体中分离出胰岛素基因。

通过采用PCR技术或在体或外体克隆技术，可以将人的胰岛素基因插入到大肠杆菌等微生物的基因组中。

2. 制备重组质粒将人的胰岛素基因插入到大肠杆菌等微生物的基因组中，需要用重组质粒来完成。

重组质粒包含了胰岛素基因的DNA序列，以及许多调节基因表达的序列。

通过此步骤，可以使大肠杆菌等微生物能够表达人胰岛素。

3. 培养重组菌在制备重组质粒之后，需要将其导入到菌体中。

将大肠杆菌等微生物的菌体在特定的培养条件下进行培养，使其表达人胰岛素。

此过程中，需要加入适当的培养基、培养条件等条件，以确保菌体生长和表达人胰岛素的效率。

4. 提取人胰岛素在重组菌培养后，需要将其分离出来。

此过程中，需要适当的人胰岛素提取方法。

可以通过离心、铵硫酸沉淀、膜过滤等方法来净化提取的人胰岛素。

5. 人胰岛素的纯化和结晶提取的人胰岛素需要进行进一步的纯化和结晶。

人胰岛素的纯化和结晶可以通过酸碱提取、透析、逆流层析等方法来完成。

6. 人胰岛素的检测和质量控制最后，需要对生产的人胰岛素进行检测和质量控制。

这包括对人胰岛素的活性、纯度、结晶度等进行检测，以确保生产的人胰岛素质量符合要求。

以上就是基因工程生产人胰岛素的技术路线。

通过这一技术路线，可以高效地生产出质量优良的人胰岛素，为糖尿病等疾病的治疗提供有力支持。

大鼠FXYD5基因的克隆及重组腺病毒载体的构建的开题报告一、研究背景和意义FXYD家族蛋白是一类调节离子通道和转运蛋白质的本体蛋白，FXYD5是其中一员，也称为dysadherin或者prostate-associated androgen-regulated gene 1 (PAGE-1)。

FXYD5在多种癌症中的异常表达与患者的预后密切相关，包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、肾癌等。

对于FXYD5的研究能够揭示其在肿瘤发生和发展中的作用，为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路。

重组腺病毒作为一种传统基因工程技术，因其高效性、低毒性、大载荷和广谱转染等特点，已成为研究FXYD5功能和机制的重要工具，同时也为临床基因治疗提供了新的方法和途径。

因此，本研究旨在克隆大鼠FXYD5基因，并构建重组腺病毒载体，从而为深入研究FXYD5的功能和机制提供工具和手段。

二、研究内容和方法1. 克隆大鼠FXYD5基因：从大鼠基因组中设计引物，扩增大鼠FXYD5基因，将其克隆至质粒载体中，利用测序进行基因确认。

2. 构建重组腺病毒载体：将FXYD5基因与重组腺病毒载体进行重组，在适当的细胞中进行病毒包装和扩增，最终得到高纯度的重组腺病毒载体。

3. 鉴定重组腺病毒：通过PCR和Western blotting等方法对重组腺病毒进行鉴定和表达检测，确定重组腺病毒的纯度和活性，为后续的细胞转染和动物实验提供可靠的实验基础。

三、预期结果和意义1. 成功克隆大鼠FXYD5基因，为FXYD5功能和机制的研究提供了工具和手段。

2. 成功构建重组腺病毒载体，为进一步探究FXYD5在肿瘤发生和发展中的作用提供了新的思路和方法。

3. 通过鉴定和表达检测，确定重组腺病毒的纯度和活性，为后续的细胞转染和动物实验提供可靠的实验基础。

论著【收稿日期】2005-03-03;【修回日期】2005-05-25【作者简介】侍晓云(1966-),女,副主任医师,现为天津医科大学在读博士。

葡萄糖调控的胰岛素原真核表达载体的构建侍晓云1,畅继武2,邱明才1(11天津医科大学总医院内分泌科,天津300052;21天津医科大学第二医院、天津市泌尿外科研究所肿瘤免疫室,天津300211)摘　要:　【目的】构建胰岛素原真核表达载体,在肝细胞内实现葡萄糖调控下的成熟胰岛素的表达。

【方法】(1)RT 2PCR 方法从胎儿胰腺获取野生型人胰岛素原cDNA ;(2)重叠延伸PCR 法在人胰岛素原cDNA 上制造两个点突变,该胰岛素原cDNA 片段命名为胰岛素/furin (INS/furin );(3)将INS/furin 亚克隆至含葡萄糖反应元件(G lRE )的p (G lRE )3BP 21Luc 的多克隆位点上。

【结果】Hind Ⅲ和EcoRV 酶切及测序均证实载体p(G lRE )3BP 211×furin 构建成功。

【结论】含葡萄糖反应元件的点突变胰岛素原基因真核表达载体p (G lRE )3BP 211×furin 有望成为糖尿病基因治疗理想的候选载体之一。

关键词:葡萄糖反应元件;胰岛素/furin ;胰岛素原;表达载体【文章编号】　100825041(2005)0420252204　【中图分类号】　Q782　【文献标识码】　AConstruction of eukaryotic glucose 2regulated insulin expression vectorSHI Xiao 2yun ,CHANG Ji 2w u ,QU Ming 2cai (The G eneral H ospital of Tianjin Medical U niversity ,Tianjin 300052,China)Abstract :【Objective 】A eukaryotic expression vector was constructed in order to realize glucose 2regulated mature insulin gene express in hepatocytes.【Methods 】Native human promisulin cDNA was obtained from fetus pancreas by RT ing site 2directed mutagenesis (overlap extension PCR ),furin consensus cleavage sequence was introduced into proin 2sulin cDNA ,and the new sequence was named INS/furin ,which allowed for the recognition and processed of furin and efficient proteolytic maturation of proinsulin to insulin within most of the cells containing furin.Subquently ,INS/furin was subcloned into the multiple clone sites of plasmid p (G lRE )3BP 21Luc ,which containing glucose reaction element G lRE in its promotor.【R esults 】Double digestion with Hind Ⅲand EcoRV ,as well as sequencing verified the vector containing target gene in specific sites.【Conclusion 】The recombinant mammalian ex pression vector p (G lRE )3BP 211×furin ,containing glucose reaction element and site 2mutated proinsulin ,is a novel ideal candidate vector for diabetic gene therapy.K ey Words :G lucose reaction element ;Furin ;Proinsulin ;Ex press vector 糖尿病是以糖代谢异常为主的代谢性疾病,无论何种类型的糖尿病,为控制晚期并发症的长期的血糖控制均需使用胰岛素。

人胰岛素样生长因子-1基因克隆及其真核表达载体的构建牛嗣云;岳凤鸣;陈志宏;高维娟;高福禄【期刊名称】《解剖学杂志》【年(卷),期】2008(031)005【摘要】目的:从胎儿肝组织中克隆人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因,并构建真核表达载体pCI-neo/hlGF-1.方法:提取胎儿肝总RNA,RT-PCR法扩增IGF-1 cDNA片段,重组于pUCM-T载体,测序正确后构建表达载体.结果:扩增得到710bp 带有Kozak序列的IGF-1 cDNA片段,成功构建了真核表达载体pCI-neo/hlGF-1.结论:通过RT-PCR的方法克隆了人IGF-1 cDNA,并成功构建了真核表达载体pCI-neo/hIGF-1,为IGF-1基因治疗糖尿病创造了条件.【总页数】3页(P646-648)【作者】牛嗣云;岳凤鸣;陈志宏;高维娟;高福禄【作者单位】承德医学院基础医学研究所,承德,067000;承德医学院基础医学研究所,承德,067000;承德医学院基础医学研究所,承德,067000;承德医学院基础医学研究所,承德,067000;承德医学院基础医学研究所,承德,067000【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.人骨形成蛋白2和人骨形成蛋白7成熟肽编码区基因克隆和真核表达载体的构建[J], 吉建新;廖伟娇;刘利东;卢春生;朱伯平;范婷婷2.人胰岛素样生长因子-1真核表达载体的构建及在神经干细胞中的表达 [J], 朱登纳;王军;贾延劼;牛国辉;张博爱;吴值荣3.人LDH-B基因克隆及其真核表达载体的构建 [J], 胡湘麟;卿鑫;曾凡才4.人可溶性血管内皮生长因子受体1基因克隆及真核表达载体的构建 [J], 吴荣耀;郑冬;郑朝旭5.人神经生长因子β基因克隆及其真核表达载体的构建 [J], 邓兴力;杨智勇;董坚;王廷华;冯忠堂;徐丹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人类胰岛素基因的克隆及其真核表达载体的构建索剑飞;雷雪芹;徐廷生;赵绍杰;韦光辉【期刊名称】《河南科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(031)002【摘要】从胎儿胰腺细胞中提取出总RNA作为模板,用特异性引物和RT-PCR法扩增INS基因的cDNA,PCR产物T-A克隆到T载体构建中间重组体pUC57-INS,其测序结果和Genbank 公布的序列一致.Hind III和BamH I双酶切pUC57-INS 后,将INS基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,经PCR扩增、酶切分析和序列测定后证实了重组表达质粒pEGFP-N1-INS构建成功.这将为转人类胰岛素基因动物模型的建立及人类糖尿病的基因治疗奠定必要的基础.【总页数】4页(P77-80)【作者】索剑飞;雷雪芹;徐廷生;赵绍杰;韦光辉【作者单位】河南科技大学动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学第二附属医院,河南,洛阳,471003;河南科技大学动物科技学院,河南,洛阳,471003【正文语种】中文【中图分类】Q782;Q819【相关文献】1.人胰岛素样生长因子-1基因克隆及其真核表达载体的构建 [J], 牛嗣云;岳凤鸣;陈志宏;高维娟;高福禄2.人CD34抗原胞外区cDNA的克隆、真核表达载体的构建及在基因免疫制备CD34单克隆抗体中的初步应用 [J], 孙玉英;奚永志;王丽英;崔建武;刘楠;梁飞3.人类TSLC1基因克隆及真核表达载体的构建 [J], 李文涛;周闯;赵永福;马秀现;张水军4.狂犬病病毒CVS株G基因和IFN-α基因的克隆及双基因真核表达载体的构建[J], 李江涛;殷相平;柳纪省;李宝玉;李学瑞;杨彬;兰喜;胡永浩5.PRRSV SD2株ORF5/ORF6基因克隆及双基因真核表达载体的构建 [J], 李俊;王金宝;袁小远;崔尚金;李曦;符芳;周艳君因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

胰岛素前体基因克隆及其原核表达载体的构建
李德玲;张前军;顾巍
【期刊名称】《汕头大学医学院学报》
【年(卷),期】2014()1
【摘要】目的:构建胰岛素前体基因的原核表达载体。

方法:以重叠PCR方法扩增获得胰岛素前体基因片段,并将片段克隆入zero pCR4 Blunt-TOPO载体内,获得胰岛素前体中间载体;随后将胰岛素前体克隆到Pet23表达载体中。

结果:双酶切鉴定结果显示,成功构建了胰岛素前体基因的原核表达载体。

结论:本实验成功构建了胰岛素前体基因的原核表达载体,为后续实现大规模的实验室表达和胰岛素的工业化生产奠定了坚实的基础。

【总页数】4页(P5-8)
【关键词】胰岛素;PCR扩增;原核表达
【作者】李德玲;张前军;顾巍
【作者单位】汕头大学医学院病理生理学实验室
【正文语种】中文
【中图分类】Q785
【相关文献】
1.抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因的克隆及其原核表达载体的构建 [J], 温儒民;张俊杰;陈家存;薛松;胡书群;孙亚峰;裴冬生
2.抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因的克隆及其原核表达载体的构建 [J], 陈
家存;张俊杰;温儒民;薛松;胡书群;孙亚峰;裴冬生
3.抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因的克隆及原核表达载体的构建 [J], 温儒民;张俊杰;陈家存;薛松;胡书群;孙亚峰;裴冬生
4.抗菌肽Fa-AMP基因的克隆及其原核表达载体的构建 [J], 李蒙;刘璞;张芝星
5.中华蜜蜂GABARAP基因克隆、生物信息学分析及原核表达载体的构建 [J], 于慧敏;吴鹏杰;李南南;谭静;徐书法;武江利
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人胰高血糖素样肽-1突变体基因的克隆及表达张志珍;刘智慧【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】2004(14)3【摘要】目的 :克隆人胰高血糖素样肽 - 1突变体 (2 Gly -hGLP - 1)基因 ,高效表达GST - 2 Gly -hGLP - 1融合蛋白。

方法 :在获得重组hGLP - 1基因工程菌基础上 ,利用定点突变技术改造其第 2位丙氨酸为甘氨酸 ,经酶切克隆于pGEM - 7z(+)载体中 ,构建pGEM - 7z(+) / 2 Gly -hGLP - 1克隆载体 ,双酶切鉴定后把2 Gly-hGLP - 1基因定向插入pGEX - 4T - 3多克隆位点 ,构建pGEX- 4T - 3/ 2 Gly-hGLP - 1融合表达载体 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)并进行诱导表达。

结果 :经双酶切鉴定和测序分析 ,证明2 Gly-hGLP - 1基因已克隆到pGEX - 4T - 3载体中。

SDS -PAGE和凝胶扫描分析 ,融合蛋白以可溶形式存在 ,其表达量占菌体总蛋白的2 9.7%。

表达产物经亲和层析纯化后纯度在 95 %以上 ,免疫印迹证实 ,该融合蛋白可被特异性hGLP - 1(7- 37)抗体所识别。

结论 :为产业化规模制备hGLP -【总页数】3页(P4-6)【关键词】人胰高血糖素样肽-1;突变体;基因克隆;诱导表达;融合蛋白;SDS-PAGE;纯化【作者】张志珍;刘智慧【作者单位】山西大学生命科学与技术学院;太原市科学技术协会【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.人胰高血糖素样肽-1突变体基因的构建和表达 [J], 刘莉;胡红琳;丁振兴;王佑民2.人胰高血糖素样肽-1突变体基因原核表达质粒的构建 [J], 朱清;顾云;陆伟;刘梅3.人胰升血糖素样肽1突变体基因的克隆及在原核细胞的表达 [J], 朱清;秦红兵;顾锦华;朱红艳4.人胰高血糖素样肽-1类似物基因克隆及真核表达载体构建 [J], 李晓丽;刘振;张志珍5.人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达优化 [J], 顾娟;劳勋;金明飞;黄静;吴自荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

短C肽人胰岛素原突变体的设计与其编码基因的套叠PCR合成王倩;马建忠;王永刚;吴玉冰【期刊名称】《中国食品工业》【年(卷),期】2011(000)005【摘要】基因工程人胰岛素作为第一个基因工程药物，自其使用以来解决了许多糖尿病人的疾苦。

其后开展的一系列基因工程人胰岛素突变体的研究，发现了一些或长效或速效或高活性的突变体，丰富了治疗用胰岛素的类型。

本文根据NCBI数据库中人胰岛素原的一级结构与三级结构模型，设计了-C肽被缩短至4个氨基酸残基（GPGA）的胰岛素突变体，期望该短连接肽在不去除的情况下维持胰岛素活性。

依据大肠杆菌K12的密码子偏好性，设计了适宜大肠杆菌表达的该突变体的基因序列。

利用套叠PCR方法扩增并克隆了该突变体基因。

核苷酸序列测定结果表明，所克隆【总页数】2页(P81-82)【作者】王倩;马建忠;王永刚;吴玉冰【作者单位】兰州理工大学生命科学与工程学院;兰州理工大学生命科学与工程学院;兰州理工大学生命科学与工程学院;兰州大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】Q578【相关文献】1.PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体及其功能的研究 [J], 杨云霞;熊文碧;冯云;王伯瑶2.PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体及其功能的研究 [J], 杨云霞;冯云;王伯瑶3.小C肽人胰岛素原类似物(B-Arg-Arg-A)和人胰岛素原(B-C-A)A、B链重组条件的研究 [J], 陈来同;张明军;胡美浩4.利用套叠PCR技术合成人胰岛素原基因的临床研究 [J], 马建忠;周贤婧;王永刚5.带信号肽人胰岛素原突变体的构建及在COS-7细胞中的表达 [J], 兰丽珍;邓华聪;孙辽;郑丹;弓军胜;刘东方;郑宏庭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。