纤维蛋白平板溶解试验

生物化学过程一种从细脚拟青霉中得到的新型高效的溶栓酶的纯化和鉴定摘要从昆虫病原真菌细脚拟青霉分离纯化得到一种溶栓酶。

由 SDS–PAGE 和纤维素酶的纯化PTEFP 的分析证明它大约是14 kDa 的一个单一蛋白质带。

纤溶模式显示溶栓酶的α-链紧接着β链迅速水解。

溶栓酶迅速溶解了人的人血浆纤维蛋白原的Aα-链但不水解Bβ-链或γ-链,表明它是一个α-纤溶酶。

N-末端序列是 AQNIGAVVNLSPPKQ，这是不同于其他已知的纤维蛋白溶解酶。

PTEFP 在温度为35◦ C 和 pH为5.0时拥有最大的酶活力，在温度低于 40 ◦C和 pH 为5.0–8.0 之间很稳定。

钙离子增强酶活性而 Zn2 + 抑制它的酶活性。

PMSF，被确定为丝氨酸蛋白酶，能够强烈抑制纤溶活性。

在以H-D-Val-Leu-Lys-ρNA为模板时溶栓酶表现出高度的特异性，以H-D-Val-Leu-Lys-ρNA为模板的Km and Vmax值分别是 0.17mM和 59 U/ml。

1.介绍心血管疾病是造成世界各地死亡的一个主要的原因。

由于心血管疾病的流行性预计将会对我们的社会情绪、社会和经济方面产生持续增加的影响。

血管内血栓形成，纤维蛋白在动脉聚集的后果，是造成心血管疾病的主要原因。

纤维蛋白是血凝块蛋白的主要组成部分，是借助酶凝血酶由纤维蛋白原形成的。

纤维蛋白原，糖蛋白包含两组三个多肽链。

在纤溶系统中不溶性的纤维蛋白纤维被纤维蛋白溶酶水解成纤维蛋白降解产物。

纤维蛋白溶酶是由纤溶酶原的活化剂从纤溶酶原中生成的，例如组织型纤溶酶原激活剂 (T-PA)，血管纤溶酶原激活物、血液纤溶酶原激活物、尿激酶、阿热曼因子与链激酶型纤溶酶原复杂。

通常纤维蛋白血栓的形成和纤溶在生物系统内能够很好的平衡。

然而，由于一些障碍当纤维蛋白不水解时，血栓形成，可能会发生。

心肌梗塞是这些血栓形成的最常见的现象。

目前，虽然 t 型纤溶酶原激活剂与尿激酶被常用在溶栓治疗方面，但还有他们一些大的缺点，如高成本，过敏反应，和口服时肠道内的内部出血的风险时。

纤维蛋白溶解的基本过程概述及解释说明1. 引言1.1 概述纤维蛋白溶解是一个重要的生物过程，指的是纤维蛋白在生物体中发生断裂与分解的过程。

纤维蛋白作为一种主要构成结缔组织的蛋白质，具有很高的机械强度和稳定性，在机体修复、再生以及各种疾病状态中起着至关重要的作用。

本文将对纤维蛋白溶解的基本过程进行全面概述和详细解释。

1.2 文章结构本文将按照以下结构展开内容：引言部分首先对纤维蛋白溶解进行概述；然后详述纤维蛋白溶解的基本过程，包括纤维蛋白的结构与特性、溶解过程触发因素以及涉及的分子机制；接着，通过从生理功能角度和疾病治疗角度来解释说明纤维蛋白溶解的重要性，并提供模拟实验与临床观察支持；随后探讨了纤维蛋白溶解过程在生物体中应用和影响，包括生物修复与再生领域中的应用前景、药物开发与治疗策略中的潜在效果探索以及对相关疾病预防和治疗策略的影响；最后给出结论，总结文章内容，并提出展望与研究方向，强调纤维蛋白溶解过程的重要性。

1.3 目的本文旨在全面了解和解释纤维蛋白溶解这一重要生物过程的基本过程和机制。

通过深入分析纤维蛋白溶解对生理功能和疾病治疗的重要性以及在生物体中的应用和影响，旨在为进一步研究和开发相关领域提供理论支持，并为相关领域的实际应用指明方向。

2. 纤维蛋白溶解的基本过程2.1 纤维蛋白的结构与特性纤维蛋白是一类重要的结构蛋白，存在于许多生物体中，包括人类。

它们具有长而纤细的形态，在维持细胞和组织的结构稳定性方面起着关键作用。

纤维蛋白主要由由肽链组成，这些肽链在特定条件下可以聚合形成纤维状结构。

结构上，纤维蛋白通常具有稳定、刚性和可拉伸的特点。

2.2 溶解过程的触发因素纤维蛋白溶解过程主要受到以下几个因素的调控：温度、pH值、离子浓度等环境因素能够改变溶解过程中阻碍或促进交联方式。

此外，酶活性也会对纤维蛋白溶解产生显著影响。

2.3 溶解过程中涉及的分子机制在纤维蛋白溶解过程中，可通过两种不同方式来破坏其结构：第一种方式是通过改变环境条件，如加热、改变pH值或离子浓度来扰乱纤维蛋白中的氢键、疏水作用和范德华力，破坏其三级结构和二级结构。

纤维蛋白降解产物FDP检测介绍纤维蛋白降解产物(Fibrinogen Degradation Products, FDP)是指纤维蛋白溶解或降解产生的多种小分子片段，通常包括D-二聚体 (D-dimer)、D-二聚体(E1)、D-二聚体(E2)、D-二聚体(E3)和一聚体(FDP)等。

这些降解产物的检测具有重要的临床意义，可以用于判断血栓和血管炎相关疾病的存在、严重程度和预后评估。

纤维蛋白是血液凝固过程中的关键蛋白质，它在血液凝固过程中形成纤维网，控制着血栓形成和溶解的平衡。

在炎症、血管损伤或血液凝固异常的情况下，纤维蛋白的降解增加，产生的降解产物FDP也相应增多。

因此，FDP的检测可以作为判断血栓和血管炎相关疾病的重要指标之一FDP的检测方法多种多样，常见的有凝固法、免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)等。

其中，凝固法是最早采用的方法。

凝固法是通过观察纤维蛋白降解产物对凝血过程的影响来进行检测的。

该方法具有简单、方便、经济等优点，但是操作容易受到人为因素的干扰，结果易出现误差。

免疫荧光法的原理是利用特异性抗体与FDP结合，并与荧光标记反应，然后通过荧光显微镜观察荧光标记的FDP。

该方法具有较高的敏感性和特异性，但是需要显微镜和专业技术支持。

ELISA和RIA是常用的定量分析方法，其原理是利用抗体与FDP结合，然后通过酶或放射性标记物来检测。

这些方法具有高度的灵敏性和特异性，可以进行定量分析，结果准确可靠。

FDP的检测在临床上具有广泛的应用。

首先，FDP的水平可以作为判断血栓相关疾病的依据。

例如在急性肺栓塞、深静脉血栓形成、心肌梗死、动脉硬化等疾病中，FDP的水平明显升高。

其次，FDP的检测可以用于评估治疗效果。

在应用抗凝剂治疗以及血栓溶解治疗后，FDP的水平会下降。

因此，通过监测FDP的变化可以判断治疗是否有效。

此外，FDP的检测还可用于预测疾病的预后。

研究表明，高水平的FDP与预后不良相关，可以作为预测疾病严重程度和预后的预测指标。

纤维蛋白（原）降解产物测定纤维蛋白降解产物（fibrinogen degradation produce，FDP）是反映原发性和继发性纤溶的重要指标。

（一）检验原理乳胶凝集法。

用抗纤维蛋白（原）降解产物抗体包被的乳胶颗粒与待检血浆混合，阳性者出现肉眼可见的凝集物。

（二）检验方法学1.试剂及器材（1）鼠抗人FDP单抗包被的乳胶颗粒悬浮液。

（2）甘氨酸缓冲液。

（3）FDP阳性、阴性对照溶液。

（4）专用纸片反应板。

（5）混匀用塑料小棒。

2.检验方法（1）标本稀释：待检标本需先作两个稀释度：①1∶2：血浆50μl加甘氨酸缓冲液50μl。

②1∶8：血浆50μl加甘氨酸缓冲液350μl。

（2）加待检标本：每个稀释度各取20μl，加于纸片板的相邻环形圈内。

（3）加对照品：各取20μl阴、阳性对照品于各自环形圈内。

（4）加单克隆抗体：每个环形圈内各加20μl单抗抗体。

（5）混匀：每个环形圈各取一根混匀搅拌棒将2液混合，然后轻轻地旋转纸片板3分钟。

3.观察结果待测标本与阴、阳性对照比较，若2个稀释度均与阴性对照一样不产生凝集，则纤维蛋白（原）降解产物小于5mg/L；若1∶2出现凝集而1∶8不凝集，则5～20mg/L之间；若2个稀释度均出现凝集，则大于20mg/L。

（三）方法学评价本法的纤维蛋白（原）降解产物检测的阈值为2.5mg/L，超过1∶8阳性时，则其浓度大于2.5×8（稀释倍数）；类风湿因子强阳性时可出现假阳性结果。

（四）质量保证1.试剂试剂应储存于2～8℃，用前取出置于室温5分钟方可使用；使用包被抗体的乳胶悬液用前须充分混匀。

2.标本保存待检血浆室温保存8小时，2～8℃24小时，-20℃1个月。

（五）参考范围＜5mg/L。

（六）临床意义FDP增高见于原发性纤溶亢进时，也可见于高凝状态、弥散性血管内凝血、肺栓塞、器官移植后的排异反应、妊娠期高血压疾病、恶性肿瘤、心、肝、肾疾病及静脉血栓、溶栓治疗等所致的继发性纤溶亢进。

原发性纤维蛋白溶解症应该做哪些检查？*导读：本文向您详细介原发性纤维蛋白溶解症应该做哪些检查，常用的原发性纤维蛋白溶解症检查项目有哪些。

以及原发性纤维蛋白溶解症如何诊断鉴别，原发性纤维蛋白溶解症易混淆疾病等方面内容。

*原发性纤维蛋白溶解症常见检查：常见检查：凝血酶时间、抗凝血酶-Ⅲ、纤维蛋白肽Bβ1～42、纤溶酶、心电图、CT检查、核磁共振成像(MRI)、便常规、血常规、尿常规*一、检查1、纤溶亢进的常用初筛试验(1)全血凝块溶解时间：为检测纤溶活性增强的最简单的试验。

正常情况下，血凝块在37℃下48h以内可出现收缩，但无溶解迹象。

如果8h内血凝块出现溶解现象则表明有全身性纤溶活性的增强。

但此方法不能区分纤溶亢进是因为血浆中存在高水平的纤溶酶原活化物还是游离纤溶酶。

(2)优球蛋白凝块溶解时间：优球蛋白含纤维蛋白原、纤溶酶原、纤溶酶原活化物等纤溶系统的活性成分，仅含少量PAI-1，基本上不产生抑制作用。

正常情况下优球蛋白凝块溶解时间90min，纤溶亢进时可明显缩短。

如果在测定标本中加入低浓度的氨基己酸，可抑制纤溶酶原活化物，但不抑制游离的纤溶酶。

因此，加入氨基己酸后若优球蛋白凝块溶解时间的缩短得以纠正，说明纤溶亢进可能是纤溶酶原活化物增多所致，若不能纠正，则提示游离纤溶酶增多。

(3)纤维蛋白平板溶解试验：将被检血浆加到纤维蛋白平板上，孵育后观察纤维蛋白板被溶解的面积，经与正常人的血浆对照，可判断有无纤溶亢进。

若在纤维蛋白平板中加入或不加纤溶酶原，还可区分纤溶亢进是纤溶酶原活化物增多所致还是游离纤溶酶增多所致。

另外，采用加热后的纤维蛋白平板也可用以鉴别，其原理是纤溶酶原活化物不耐热。

以上3种试验的优点在于操作简便，可在几小时内说明是否存在全身性纤溶亢进。

后2种方法经改良，还可初步判断是纤溶酶原活化物增多还是游离纤溶酶增多。

但这3种方法均无法证实是原发性抑或继发性纤溶亢进。

2、反映纤溶酶生成的实验室检查(1)纤溶酶测定：循环血中很难测出游离的纤溶酶。

毒性酶类试验（一）溶血试验1、原理: 某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌。

2 试验方法: 平板法试管法（1）平板法:将培养物接种于血平板培养基上，36±1 ℃培养24～48h，观察结果。

溶血试验的溶血类型及现象:（1）α（甲型）溶血: 菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环。

（2）β（乙型）溶血: 菌落周围出现较宽的透明溶血环。

（3）γ（-丙型）溶血: 菌落周围无溶血环。

（2）试管法:将待检菌培养液与等量的2%羊血球混合，在36±1 ℃培养16～18h，观察结果。

如溶血，培养液可出现透明状。

3、结果观察与记录:有溶血现象，为阳性，记+；无溶血现象，为阴性，记-(二) 链激酶试验1、原理：A群链球菌群能产生链激酶，该酶能使血液中的纤维蛋白酶原变成纤维蛋白酶，而后溶解纤维蛋白，使血凝块溶解,为阳性反应。

此试验用于测定链球菌的致病性。

阳性反应具有致病性。

2、试验方法：吸取草酸钾血浆0.2 mL(0.01 g草酸钾加5 mL兔血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清液)，加入0.8 mL生理盐水，混匀后，再加入待检菌36℃下培养18-24h肉汤培养物0.5 mL和0.25％氯化钙0.25 mL，混匀，放37℃水浴中，2 min观察一次。

待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。

如2 h内不溶化，继续放置24 h后观察。

同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性的菌株做阳性对照。

3、结果观察与记录；如凝块全部溶化,为阳性+凝块24 h仍不溶化,为阴性-（三）卵磷脂酶试验1、原理：某些微生物能产生卵磷脂酶，在钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸胆碱，在卵黄琼脂平板上菌落周围形成不透明的乳浊环或混浊白环，或使血清、卵黄液变混浊，以此鉴别细菌。

2、试验方法：（1）卵黄平板法A法：将待检菌培养物划线接种或点种于卵黄琼脂平板上，36±1 ℃培养3～6h，观察结果。

作者简介：杨明俊（１９７９－），男（汉），硕士研究生，研究方向：微生物药物学。

＊通讯作者杨明俊１，杨晓彤１，＊，冯慧琴１，糜可１，杨庆尧２（１．上海师范大学微生物与免疫学研究所，上海２００２３４；２．上海杨杨百草研究所，上海２００２３４）两种纳豆激酶活性测定方法对比及相关性分析摘要：从线性和精密度两个方面对纤维蛋白平板法和四肽底物法测定纳豆激酶活性的两种方法进行了比较研究，并验证了两种方法测定值之间的直线相关性。

结果表明：纤维蛋白平板法和四肽底物法分别在１０．７７ＩＵ／ｍＬ￣８０．７３ＩＵ／ｍＬ和０．０３Ｕ／ｍＬ￣０．０９Ｕ／ｍＬ浓度范围内呈线性，且日间和日内变异系数均小于１０％。

两者结果具有直线相关性，其关系为纤维蛋白平板法测定值（ＩＵ）＝２６４．８７×四肽底物法测定值（Ｕ）－１９．６３３，（Ｒ２＝０．９９４２）。

结论：纤维蛋白平板法与四肽底物法均能用于纳豆激酶活性测定，前者测定结果直接，但四肽底物法更灵敏，还可应用于高通量筛选。

关键词：纳豆激酶；纤维蛋白平板法；四肽底物法ＡＣＯＭＰＡＲＩＳＯＮＡＮＤＣＯＲＲＥＬＡＴＩＯＮＳＴＵＤＹＯＦＴＷＯＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＮＡＴＴＯＫＩＮＡＳＥＡＣＴＩＶＩＴＹＤＥＴＥＣＴＩＯＮＹＡＮＧＭｉｎｇ－ｊｕｎ１，ＹＡＮＧＸｉａｏ－ｔｏｎｇ１，＊，ＦＥＮＧＨｕｉ－ｑｉｎ１，ＭＩＫｅ１，ＹＡＮＧＱｉｎｇ－ｙａｏ２（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３４，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｈａｎｇｈａｉＹａｎｇ’ｓＨｅｒｂＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅｌｉｎｅａｒｉｔｙａｎｄｐｒｅｃｉｓｉｏｎｏｆｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅ（ＦＰ）ｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ）ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＳ）ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｓｕｌｔｓ’ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｙｗａｓａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｒｅ－ｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ：Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｓｗｅｒｅ１０．７７ＩＵ／ｍＬ￣８０．７３ＩＵ／ｍＬｆｏｒＦＰｍｅｔｈｏｄａｎｄ０．０３Ｕ／ｍＬ￣０．０９Ｕ／ｍＬｆｏｒＳＳｍｅｔｈｏｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｌｅｂｏｔｈＣＶｓｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ１０％ｉｎｗｉｔｈｉｎ－ｄａｙａｎｄｄａｙ－ｔｏ－ｄａｙｔｅｓｔｓ．Ｔｈｅｔｗｏｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｃｏｎｖｅｒｔｅｄａｓ：ＦＰｖａｌｕｅｓ（ＩＵ）＝２６４．８７×ＳＳｖａｌｕｅｓ（Ｕ）－１９．６３３，（Ｒ２＝０．９９４２）．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ：ｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＳ）ｍｅｔｈｏｄａｒｅｂｏｔｈａｐ－ｐｌｉｃａｂｌｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇＮａｔｔｏｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｆｒｏｍＦＰｍｅｔｈｏｄｃａｎｄｉｒｅｃｔｌｙｒｅｆｌｅｃｔｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ’ｓｔｈｒｏｍ－ｂｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｈｅｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｍｅｔｈｏｄｈａｓｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｆｏｒｆａｓｔ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ；ｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄ；ｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｍｅｔｈｏｄ纳豆（Ｎａｔｔｏ）是日本的传统发酵食品，以大豆为原料由纳豆芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｖａｒ．ｎａｔｔｏ）发酵而成，其风味独特、营养丰富。

琼脂糖—纤维蛋白平板法测定纳豆冻干粉中纳豆激酶活性用琼脂糖-纤维蛋白平板法对纳豆冻干粉中纳豆激酶活性进行测定，在检测酶浓度单位在2000～10000U/ml时呈现很好的2次曲线关系，蚓激酶浓度单位-两垂直直径的乘积回归方程为y=-0.0000004839 x2+0.02203 x-12.2715，相关系数r2=0.9993。

本法回收率范围在89.53%～100.75%，平均回收率为94.7%，RSD为4.2%。

Abstract：The activities of Nattokinase（NK）in natto freeze-dried powder was assessed by agar-fibrin plate assay，it displays a good quadratic relations under the enzyme concentration of 0.30%～0.40%.The product of the regression equation between concentration of vermis kinase and two vertical diameter was y=-0.0000004839x2+0.02203-12.2715，The correlation coefficient was 0.9993.The recovery of the method was found to be in the range of 89.53%-100.75%，the average recovery was 94.7%，RSD=4.2%。

Key words：Agarose；Fibrin；Nattokinase；Lumbrokinase；Plate method纳豆（Natto）是，以大豆为原料由纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis var.natto）发酵而成。