丙烯酰胺对纹状体神经末梢多巴胺相关转运蛋白的影响

分类号学号M201075020学校代码10487密级硕士学位论文丙烯酰胺对纹状体神经末梢多巴胺相关转运蛋白的影响学位申请人：熊飞学科专业：公共卫生硕士指导教师：严红副教授答辩日期：2012年5月A dissertation submitted to Huazhong University of Science and Technology in conformity with the requirements for the degree ofMaster of ScienceThe impact of acrylamide on the dopaminetransport transport--related protein proteinss in the striatal nerve terminalCandidate:Fei Xiong Major:Master of Public Health Supervisor :Vice Prof.Hong YanTongji Medical CollegeHuazhong University of Science and TechnologyWuhan,Hubei 43004300303030,,P.R.China May,20201212独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

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本论文属于不保密（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日目录缩写词（Abbreviation） (1)摘要 (2)Abstract (7)前言 (13)第一部分丙烯酰胺对大鼠神经行为毒性的影响 (17)材料与方法 (17)结果 (19)讨论 (23)第二部分丙烯酰胺对大鼠多巴胺相关转运蛋白mRNA和蛋白表达的影响 (26)材料与方法 (26)结果 (32)讨论 (37)第三部分丙烯酰胺对PC12细胞多巴胺相关转运蛋白的蛋白表达的影响 (42)材料与方法 (42)结果 (44)讨论 (46)参考文献 (48)小结 (55)综述 (56)附图 (74)致谢 (77)（Abbreviation）缩写词（缩写词ACR Acrylamide丙烯酰胺DA Dopamine多巴胺TH Tyrosine hydroxylase酪氨酸羟化酶PD Parkinson’s disease帕金森氏病GA Glycidmidae环氧丙酰胺MAO-B Monoamine oxidase-B单胺氧化酶BDAT Dopamine transporter多巴胺转运体VTA Ventral tegmental腹侧被盖区VMAT2Vesicular monoamine transporter2Ⅱ型单胺囊泡转运体PC12Rat pheochromocytoma大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤CNS Center nervous system中枢神经系统PNS Peripheral nervous system外周神经系统CAS Chemical Abstracts Service美国化学文摘服务社登记号NFA National Food Administration瑞典国家食品管理局GSH Glutathione还原型谷胱甘肽Ct Threshold Cycle循环阈值AD Alzheimer's Disease阿尔茨海默氏病CYP2E1Cytochrome P450细胞色素P450MAPK Mitogen-aetirated potein kinase丝裂原活化蛋白激酶DEPC Diethyl Pyrocarbonate焦碳酸二乙酯HRP Horseradish Peroxidase辣根过氧化物酶RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain逆转录-聚合酶链式反应ReactionSDS Sodium Dodecyl Sulphate十二烷基硫酸钠PKA Protein kinase A蛋白激酶APKC Protein kinase C蛋白激酶CD2Rs Dopamine D2receptor多巴胺D2受体Nurr1Nuclear receptor related1protein核受体相关因子1丙烯酰胺对纹状体神经末梢多巴胺相关转运蛋白的影响硕士研究生：熊飞指导老师：严红副教授摘要丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是一种从水合丙烯腈中提取出来的具有乙烯基的水溶性有机化合物，是国内外广泛应用于化工冶炼、污水处理、纺织加工及化妆品生产的一种化学原料。

早在20世纪70年代就有职业性中毒的报道，主要表现为神经系统症状，除职业接触外，在饮用水、高温油炸食品和食品的包装材料中都可以检测到单体丙烯酰胺的存在，由于其可以直接经口进入人体，从而引起了社会的高度关注。

有关流行病学调查和实验研究发现，丙烯酰胺对人和实验动物除了有生殖毒性、遗传毒性及致癌性等作用以外，还有明显的神经毒性。

丙烯酰胺急性、亚急性中毒主要以损伤中枢神经系统为主，表现为神经精神症状和小脑共济失调，而慢性中毒则以损害周围神经系统为主，关于其机制目前尚不清楚。

纹状体作为基底节最大的综合处理元件，包含着大量的多巴胺能神经元，在整个脑部中的多巴胺神经递质含量最高。

在多巴胺能系统神经通路中多巴胺神经递质首先在突触前膜中进行合成、转运、释放、降解，以达到突出间隙中多巴胺神经递质的平衡，突触间隙中的多巴胺神经递质进入突触后膜发挥突触后效应，而多巴胺相关转运蛋白在整个过程中发挥着重要作用，维持突触间隙中多巴胺神经递质的平衡，当该平衡被打破后神经系统就会出现不同程度的病症，主要表现在感觉运动整合、躯体平衡运动及学习记忆等方面。

以往对ACR的人群流行病学和实验研究时所出现的神经症状和体征，似乎很大程度上预示着与纹状体多巴胺神经通路中多巴胺神经递质平衡被打破有关。

但直至目前，有关丙烯酰胺影响纹状体维持多巴胺神经递质平衡的相关转运蛋白的研究报道较少，其具体机制仍未完全明确。

因此，本研究拟通过体内和体外实验的结合，检测丙烯酰胺对多巴胺转运体、单胺囊泡转运体及多巴胺合成酶—酪氨酸酸羟化酶的影响，探讨其引起神经毒性的可能机制，为防治丙烯酰胺中毒提供理论依据。

第一部分丙烯酰胺对大鼠神经行为毒性的影响目的：探讨丙烯酰胺对大鼠神经行为毒性的影响。

方法：健康成年雄性SD大鼠40只，体重230±20g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鄂）2010-0007号。

大鼠在10h：14h 明暗光循环的动物房内，自由饮水、摄食，检疫观察7天后用于实验。

将大鼠按体重随机分为4组，分别为对照组、低剂量(20mg/kg)组、中剂量(30mg/kg)组、高剂量（40mg/kg）组，每组10只，均单笼饲养。

按照对应的染毒剂量对各ACR 剂量组进行灌胃染毒，对照组则灌胃给予等容量的生理盐水，每周连续染毒5天间隔2天，总共19天，并于第0，6，13，19天称量体重并进行步态评分，于第0，19天测定大鼠的后肢支撑力和甩尾时间。

末次给药24小时后，断头处死大鼠，迅速取出脑组织，用预冷PBS缓冲液洗净，称量大小脑重量，并于冰盘上迅速分离纹状体、大脑皮层及小脑，并用干净滤纸吸干置于﹣80℃冰箱中保存备用。

取出大鼠心、肝、脾、肺、肾、睾丸等脏器，称量重量并记录。

结果：（1）在整个染毒期内低剂量组大鼠虽然体重增长始终低于对照组，但差异无显著性；与对照组比较，中剂量组大鼠平均体重于第19d明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；高剂量组大鼠平均体重于第6d、13d、19d也明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。

另外，与低、中剂量组相比，高剂量组大鼠平均体重于第19d明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

（2）脏器系数显示，高剂量组大小脑、心脏、肺脏、肾脏及睾丸脏器系数均有增加，且差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。

（3）染毒第6d、13d、19d，与对照组比较，低、中、高剂量组步态评分均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，且染毒结束后，其分值分别集中于1-2、2-3、3-4分之间，并呈现出时间—剂量—效应关系。

另外，与低、中剂量组相比，高剂量组步态评分于第6d、13d、19d也明显增加，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

（4）染毒第19d，与对照组相比，低、中、高剂量组后肢支撑力指数均明显增加，差异有统计学意义(P< 0.01)，且呈现出剂量—效应关系。

另外，与低、中剂量组相比，高剂量组后肢支撑力指数也明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)（5）染毒第19d高剂量组的甩尾时间比对照组明显缩短，差异有统计学意义(P<0.01)。

结论：ACR亚急性染毒能导致大鼠体重下降；大小脑、心脏、肺脏、肾脏及睾丸脏器系数增加；步态评分增高；后肢支撑力指数增加；甩尾时间缩短。

具有明显的神经毒性，主要引起感觉运动功能异常。

第二部分丙烯酰胺对大鼠多巴胺相关转运蛋白mRNA和蛋白表达的影响目的：探讨丙烯酰胺对大鼠纹状体多巴胺转运体(DAT)、单胺囊泡转运体(VMAT2)和酪氨酸羟化酶（TH）mRNA表达和蛋白水平的影响。

方法：动物分组及处理同第一部分。

实时荧光定量PCR技术检测大脑皮层、小脑和纹状体内DAT、VMAT2、TH mRNA表达水平，并检测纹状体中MAO-B mRNA表达水平；Western Blot蛋白印迹技术检测纹状体内DAT、VMAT2、TH的蛋白表达水平。

结果：（1）大脑皮层结果显示：与对照组比较，各剂量组VMAT2mRNA表达水平均明显降低，其中低、中剂量组分别降低了30%、29%，差异具有统计学意义(P<0.05)，而高剂量组则降低了56%，差异具有统计学意义(P<0.01)。

DAT、TH各组间差异均无统计学意义。