精子DNA碎片检测操作卡

产品注册证号：闽明食药监械（准）字2013第1400018号 执行标准号：YZB/闽明0030-2013 生产许可证号：闽食药管械生产许第20110297号
包装规格：10人份/盒、20人份/盒 、 40人份/盒
存储条件及有效期： 试剂盒于2-8℃避光保存，有效期为12个月。
（三）
精子活体染色试剂盒 （拒染法）
检测原理：
利用荧光络黄染料（吖啶橙）具有高度的异 染性的特性，以插入的方式与双螺旋的DNA分子
结合，染色后断裂的单DNA精子呈绿色荧光。
医生可通过计算红色和黄色荧光精子即单链DNA
精子的百分率评估精子受精几率。
3、检测操作过程
检测样本：液化后的新鲜精液标本 精子洗涤 涂片 固定
三明市和众生物技术有限公司内部培训资料
生殖医学检测试剂盒系列
精子五联检
1、精子DNA检测试剂盒 2、精子DNA碎片检测试剂盒 3、精子活性检测试剂盒 4、精子形态学检测试剂盒 5、精子核蛋白检测试剂盒
影响精子受精或男性不育的因素



精子死亡率过高 精子畸形率过高 精子成熟率过低 精子染色体异常 精子数量过少 精子活动力过低 精子液化能力过低
完
正常参考值：核蛋白不成熟精子≤30%


结果： 核蛋白不成熟的精子（IM）染紫蓝色或紫色 核蛋白成熟的精子（M）染红色。
操作方法
精子液化 精子洗涤 精子洗涤
涂片
复染 洗脱 染色 固定
镜检
染色效果
不成熟精子
成熟精子
正常参考值：核蛋白不成熟精子≤30%
产品基本信息
产品注册证号：闽明食药监械（准）字2013第1400022号 执行标准号：YZB/闽明0033-2013 生产许可证号：闽食药管械生产许第20110297号

精子/血细胞染色操作卡样本准备精液样本1、新鲜完全液化2、精子密度低于10×106/ml，600g离心10分钟后去除大部分精浆，重新悬浮。

血液样本EDTA抗凝血操作步骤1、在预染载玻片的染料中心区域加入标本4μl 盖上盖玻片，以笔的平端轻．轻．挤压盖玻片2、根据染色标本或染色目的的不同，选择下列合适的方法进一步操作：①干片观察（适用于精子形态学染色）室温染色30min~120min 以约30-70°的角度拉动盖片制成精子涂片自然干燥显微镜100×油镜下观察结果②湿片观察（适用于血细胞形态染色）：室温染色15 min后，不揭盖玻片，显微镜100×油镜下观察细胞形态注意事项1、加样量过多、标本液层过厚可影响染色效果，致使细胞受染不匀。

2、以笔的平端挤压盖玻片的中央，使标本均匀覆盖在染料表面，可增加细胞染色的均一性。

3、在制备干片过程中，揭去盖玻片后以约30-70°的角度拉动盖片时，注意应始终保持盖片在载玻片的涂漆表面滑行，不得落入染色区域4、本试剂盒不适于以干片方式染色洗涤后的精子，除非在洗涤后的精子沉淀团内加入精浆重悬。

但洗涤后的精子（不以精浆重悬）可以湿片方式观察，染色3~5min即可观察结果。

5、血液细胞染色最好不要以干片方式观察结果。

网织红细胞染色后不易褪色，但网织红细胞计数应在染色后5小时内完成，因为染色时间过久后部分红细胞会褪色。

6、精液标本可采用湿片和干片相结合的方式观察细胞形态。

可先在湿片状态下鉴定圆细胞形态，然后揭去盖玻片，以干片方式观察精子形态。

湿片状态下可轻易鉴别生精细胞和白细胞：前者胞质中无颗粒而后者胞质中有较多颗粒。

精子核蛋白染色操作卡
标本准备：
1．0.2-0.5ml 液化新鲜精液 + 1ml 生理盐水于Eppendorf 管中 弃去上清液。

2．Eppendorf 管中加入1.5ml 生理盐水 弃去上清液。

3．重复上一步操作 离心结束后，弃去上清液。

4. 在Eppendorf 管中加入A 液约0.1-0.2ml ，混匀并计数精子密度。

5. 用洗液A 调整密度至20-40×106/ml 的精子悬液。

操作步骤：
1．精子悬液5μl 干燥。

2．滴加B 液2-3滴/涂片窗 流水冲洗。

3．滴加C 液2-4滴/涂片窗 流水冲洗。

4．载片插入D 液反应池中 流水冲洗。

5．滴加E 液2-4滴/涂片窗 流水冲洗，吹干观察。

注意事项:
1. 不同标本，成熟精子的染色本底可能会存在差异。

观察结果时，以该标本具代表性的最浅红染 的精子作为对照，较之对照更深染的紫色或紫蓝色精子便可判定为不成熟精子。

2. 试剂盒配备的组织载片高度洁净，请小心保存。

混匀
1000g 离心5min 混匀 1000g 离心5min 组织载片
涂布 室温2min
室温5min 室温5min
室温5min。

诱发精子顶体反应检测操作卡操作步骤：1、每例标本同时设测定管和对照管，均加精子悬液0.5m 孵育3小时。

2、测定管+钙离子载体2.5ul对照管+对照液2.5ul 3、以下存在两种反应模式,一种为组织玻片4℃过夜反应模式(推荐),一种为组织玻片37℃反应1小时模式,请酌情使用。

⑴ 4℃过夜反应模式(推荐), a.均加生理盐水 1ml 生理盐水1.5ml 生理盐水至100μl 取10μl 精子悬液涂片 干燥。

b.如果不能连续完成检测，则第2步完成后，在测定管和对照管中均加入生理盐水1ml 生理盐水1.5ml 加入生理盐水至100ul 取10μl 精子 悬液涂片 干燥后的组织载片完全浸泡于盛有组织片保存液的反应池内，置于2-8℃ 至少可保存72h ，取出后可继续进行后面步骤。

c.将干燥组织载片浸于固定液中30min 纯化水浸2min ，换水，重复三次 干燥。

d.荧光结合物50μl 置于湿盒内 纯化水浸泡2min ，换水，重复三次。

e.干燥 每个涂片窗内加1滴荧光封固液 盖片,观察。

二氧化碳培养箱（5%CO 2、37℃） 孵育15min 。

600g 离心5min 去除上清液 600g 离心5min去除上清液 二氧化碳培养箱（5%CO 2、37℃） 600g 离心5min 去除上清液 600g 离心5min去除上清液 4℃过夜反应R)*)/(1.11810*(g rpm 5(2) 37℃反应1小时模式a.均加精子洗液B 应用液 1ml 精子洗液B 应用液 1.5ml 精子洗液B 应用液至100ul 取10μl 精子悬液涂片 干燥。

b.如果不能连续完成检测，则第2步完成后，在测定管和对照管中均加入生理盐水1ml生理盐水1.5ml 加入生理盐水至100ul 取10μl 精子 悬液涂片 干燥后的组织载片完全浸泡于盛有组织片保存液的反应池内，置于2-8℃ 至少可保存72h ，取出后可继续进行后面步骤。

c.将干燥组织载片浸于固定液中30min 纯化水浸2min ，换水，重复三次 干燥。