最新第三章荧光分光光度法[002]PPT

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荧光相关光谱要点ppt课件

检测器分别检测。
三、应用
• 1.生物分子相互作用 • 金环蛇毒素和乙酰胆碱受体的作用 • 组氨酸标记肽与金属螯合脂的作用 • 转铁蛋白与人转铁蛋白受体的作用 • 秋水仙碱与微管蛋白的作用 • ……
2.活细胞相关研究
• A.细胞膜 • 磷脂双分子层4nm厚，可按二维模型处理
• 胰岛素原C-肽与人细胞膜的相互作用 • 表皮增长因子与膜结合受体的特异结合 • 神经肽在胰腺癌细胞细胞膜的结合作用
一、概念
• FCS通过测定溶液中微区内（fL）发光粒子因布朗运动或化学反应而产生的荧光涨落现象，分析荧光涨落的相关函数而获得单个粒子（如分子）的浓度、化学动力学参数等信息。
• 概念于20世纪70年代提出，90年代开始发展。（计算机技术、光学检测技术、激光共焦技术）
Rhodamine green 488nm激发
相关公式
• 微区内荧光分子数在任一时间t的变化导致荧光强度的涨落值为：
• 用归一化自相关函数将荧光涨落与延迟时间τ 相关：
二、相关实验技术
• 激光器 • 共焦显微镜 • 高数值孔径物镜
• 1.单光子激发
• 2.双光子激发
• 3.荧光互相关光谱：
• 分子量之差小于8倍，扩散系数之差小于2倍。 • 标记两种不同荧光试剂，两个独立激光器激发，两个
• B.胞内 • 线粒体中NADH、黄素蛋白有自发荧光
• 乳胶微球在细胞内的扩散行为 • 寡聚核苷酸在细胞核内的分子运动 • β-半乳糖酶融合蛋白在胞内的运动
3.核酸研究 • DNA PCR扩增动力学研究 • DNA单个分子构象波动

4.疾病诊断
• 结合PCR扩增或其他扩增
• HIV • HBV、HCV、SARS • 朊病毒

荧光分光光度法.精选PPT

第八章荧光分光光度法
优选第八章荧光分光光度法
§ 8- 1 概述
一、分，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法
较高激发态
吸收能
光辐射
量受激
退激
基态
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激
2. 无辐射去激——不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热的形式释放。包括：
内部转换（IC）—相同的多重态之间的转换 S-S
系间窜跃（ISC）—不同的多重态之间的转换 S-T
去激发光 * * n
基态
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电
子自旋方向总是相反的，处于基态单重态。用 “S0”
表示；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度越大，越易产生荧光; 环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强
振动驰豫（VR）—同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程
外部转移—指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消灭
发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内部转换困难
VR
VR：振动驰豫
S2
IC：内部转换
IC
ISC：系间窜跃
VR 计算 I前/I后
T1

第三章紫外可见分光光度法ppt课件

2、影响紫外吸收光谱的主要因素
二苯乙烯顺式反式异构体的紫外吸收光谱
2、影响紫外吸收光谱的主要因素
(2) 跨环效应跨环效应指非共轭基团之间的相互作用。如对亚甲基环丁酮在214nm处出现一中等强度的吸收带，同时284nm处出现R带。这是由于结构中虽然双键与酮基不产生共轭体系，但适当的立体排列，使羰基氧的孤电子对与双键的π电子发生作用，相当于n→π*跃迁的R带向长波移动。
苯的紫外吸收光谱（异辛烷溶剂中）
4、E带——芳香族化合物特征吸收带
由苯环结构中3个乙烯的环状共轭系统的π →π*跃迁所引起。分为E1和E2两个吸收带。 E1 吸收带约在 184nm ， εmax=60000 ，强吸收带。 E2 吸收带在 204nm 以上， εmax=8000 ，强吸收带。
2、K带——Konjugation(共轭作用)
由共轭双键中π →π*跃迁引起。吸收峰出现在200nm以上，吸收强度大（ε＞105）。随着共轭双键的增加，吸收峰红移，吸收强度有所增加。如丁二烯λmax =217nm为K带。
3、B带——benzenoid(苯)
芳香族（包括杂芳香族）特征吸收带。由苯等芳香族化合物的π →π*跃迁所引起的吸收带之一。吸收峰出现在 230~270nm 之间，中心波长256nm。在极性溶剂中，B带精细结构变得不明显或消失。
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1、有机化合物的紫外吸收光谱
(2)不饱和烃及共轭烯烃含孤立双键或叁键的简单不饱和脂肪化合物，可以产生σ→σ* 和π→π*两种跃迁。最大吸收波长λmax小于200nm。具有共轭体系的不饱和化合物，共轭体系越长，跃迁时所需能量越小，吸收峰红移越显著。如1,3,5,7,9,11-十二烷基六烯λmax为364nm，εmax为138000。

荧光光谱分析法-课件

b. 荧光光谱的形状与激发波长无关
电子可以跃迁到不同激发态能级,吸收不同波长的能量
(如能级图l 2 、l 1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一
个发射态，如l 3 。
为什么？
20
c. 镜像规则由于电子基态的振动能级分布与激发态相似,故通常
荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
各小峰波长递减值与振动能级差有关,各小峰的高度与跃迁几率有关。
电子能级的多重性 M=2S+1
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则),三重态能级比相应
单重态能级低;
大多数有机分子的基态处于单重态；
11
小结:激发单重态与激发三重态的不同√
激发单重态分子中没有净电子自旋,因而具有反磁性;激发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的激发单重态分子平均寿命短（10-8~10-6s），而激发三重态的长（10-4~10s）基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻跃迁
2008年诺贝尔化学奖
2
3
澳大利亚科学家最新发现, 一种叫“螳螂虾”的海里动物通过发出色彩鲜艳的荧光来恐吓警告敌对者或者吸引性配偶，
用荧光抗体染色之原生动物
4
green-fluorescent protein (GFP) K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306
S0→S1、S2 允许跃迁; S0→T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入 (见能级图)；进入的几率小；
12
内转换
振动弛豫内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸收

分光光度法专业知识课件

E1’ molecular vibration E1’’ molecular rotation E0 Ground level
互补（色）光
complementary colors
第一节分光光度法基本原理
若溶液选择性地吸收了某种颜色旳光，则溶液呈吸收光旳互补色。
二．物质旳吸收光谱
用不同波长旳单色光依次
① c 一定, A∝b Lambert ② b 一定, A∝c Beer
A =εbc
三、Lambert-Beer定律
A =bc
溶液厚度b, 单位:cm
浓度c，单位molL-1
摩尔吸光系数，单位Lmol -1cm-1
若用质量浓度替代c
A = ab
质量浓度 , 单位: gL-1
质量吸光系数a, 单位: Lg -1cm-1
常用参比溶液
成份溶剂显色剂
溶剂空白 √ ×
试样
×
其他合用范围
× 显色剂、试样均无吸收
试剂空白 √ √ 试样空白 √ ×
×
√ 试样无吸收显色剂有吸
收
√
√ 显色剂无吸收，试样有
吸收
第四节
提升测量敏捷度和精确度旳措施自学要点看：分光光度法旳误差起源显色剂旳选择测定条件旳选择
本章小结
As，在相同条件下测出试样溶液旳吸光度 Ax，则试样溶液浓度cs可按下式求得：
Ax /As= cx / cs cx = cs Ax /As
参比（空白）溶液 blank
I 参比溶液旳作用：扣除一切不起源于目旳产物旳光吸收。
如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物旳影响。
常用参比溶液：
①溶剂空白 ②试剂空白 ③试样空白

荧光分光光度法

第二节分子荧光强度的影响因素
一、荧光与有机化合物的结构
1. 跃迁的类型对于有机荧光物质: 对于有机荧光物质: n →π* εmax＜ 100 平均寿命10 平均寿命10-5~10-7sec π→π* εmax≥104 平均寿命10 平均寿命10-7~10-9sec kS → T小 π*→π 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。强荧光的有机化合物具备下特征: 强荧光的有机化合物具备下特征具有大的共轭π键结构键结构； ①具有大的共轭键结构；具有刚性的平面结构； ②具有刚性的平面结构； ③具有最低的单重电子激发态为S1为π * →π型；具有最低的单重电子激发态为型取代基团为给电子取代基。 ④取代基团为给电子取代基。
4 3 2 1
S0
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
λex =290nm (MAX)
λ
λem= 620nm(MAX) 620nm(MAX)
2. 三维荧光光谱 I F ∝f (λex 、λem) 固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、
1−
It = 1 −T = 1 − e−2.303εbC I0
I0 − It = I0 ( 1− e−2.303εbC )
荧光强度（与相应的吸光分数成正比：荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：
IF =φ( I0 − It ) = φI0 ( 1− e−2.303εbC )
按照级数展开式：按照级数展开式：
C. 激发光谱与发射光谱的镜像关系
4 3 2 1
IF4800
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400

荧光分光光度计课件

光学分析仪器培训
22
荧光分光光度法 3、荧光分光光度法的特点
（5）受外界影响较大，外界因素如温度、 PH值、溶剂和其它因素都可能显著地影响分析结果。其中温度对他的影响最大，这也是荧光分析需标准的原因。
2017/4/23
光学分析仪器培训
23
荧光分光光度法 3、荧光分光光度法的特点
3.2、荧光分光光度法的发展近年来，荧光分光度计随着新技术的的采用，
2017/4/23 光学分析仪器培训 8
荧光分光光度法 1、荧光分光光度法简介

分子能级图：
2017/4/23
光学分析仪器培训
9
荧光分光光度法 2、荧光分光光度计的基本结构
F-7000荧光分光光度计
2017/4/23
光学分析仪器培训
10
荧光分光光度法 2、荧光分光光度计的基本结构
荧光分析仪器的结构和主要部件：
2017/4/23 光学分析仪器培训 28
荧光分光光度法 3、荧光分光光度法的特点
3.3、荧光和分子的关系：取代基的类型和位置：取代基对荧光体的影响分为加强荧光的、减弱荧光的和影响不明显的。
加强荧光的取代基有—OH—ORR—NH2—
CN、—NHR、—NR2、—OCH3等给电子取代基，由
于它们n电子的电子云几乎与芳环上的π轨道平行，因
发展非常快，特别是计算机和其它先进技术应用的引
入，是荧光光度计发生了根本的变化，相应的分析方法也得到很快的发展，象激光荧光分析技术、时间分辨荧光分光光度法、同步荧光分析法，这些又大的推动了分析方法在理论和应用方面的进展。同时促进荧
光分析技术的不断完善。
2017/4/23 光学分析仪器培训 24

荧光分光光度法课件

实验证明：O2的熄灭作用，似乎是随溶剂的介电常数的减小而增加，所以O2在水溶液中熄灭作用较小，而在有机溶剂中熄灭作用较强。
荧光分光光度法课件
（d）发生电子转移反应的熄灭
某些熄灭剂分子与荧光物质的分子相互作用时，发生了电子转移的反应，即氧化还原反应，因而引起荧光的熄灭。
例：甲基兰荧光溶液被Fe2+熄灭
重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物及某些杂环化合物，容易转入三重线级，溶液中绝大部分转入三重线级的分子在一般温度下不发光，它们将多余的能量消耗于它们与其它分子的碰撞之中，因而荧光产生熄灭作用。这可能是由于顺磁性的氧分子与处于单重激发态的荧光物质分子相作用，促进形成顺磁性的三重态荧光分子，即加速系间窜跃所致。
D* + Fe2+ D- + Fe3+
有荧光
无荧光
荧光分光光度法课件
发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金属离子，I-， Br-，S2O32-等易于给出电子的阴离子对奎宁、罗丹明及荧光素钠等有机荧光物质也会发生熄灭作用。
荧光分光光度法课件
（e）荧光物质的自熄灭荧光物质溶液的浓度大于1g/L时，常常
散射和拉曼散射、器壁的散射及胶粒的散射（丁铎尔散射）。
荧光分光光度法课件
当物质分子吸收了频率较低的光能后，并不足使分子中的电子跃迁到电子的激发态，而只是上升到基态中较高的振动能级上去，若在10-15~10-12s返回到原能级，此时辐射出和激发光相同波长的光，称为瑞利散射。
荧光分光光度法课件
荧光分光光度法课件
❖ 氙弧灯（氙灯）是连续光源，发射光束强度大，可用于200~700nm波长范围。在200~ 400 nm波段内，光谱强度几乎相等。

第3章荧光分析法ppt课件

3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素
➢ 空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。
SO3Na
H3C N
CH3
H3C SO3Na N CH3
①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 ②1-二甲胺基萘-8-磺酸盐
f＝0.75
f＝0.03
➢ 顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没有
荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反式有强
⑶ 取代基的影响：给电子取代基使荧光强度增大；而吸电子取代基则使荧光强度降低。
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素
➢ 长共轭结构示例比较：λex (nm)/ λem (nm)/ f
苯 205/278/0.11
萘 286/321/0.29
蒽 356/404/0.36
2. 荧光和磷光的产生
➢ 辐射跃迁－发光失活荧光：激发态分子从第一激发单线态S1的最低
振动能级回到基态S0所发出的辐射。磷光：激发态分子从第一激发三重态T1的最低
振动能级回到基态S0所发出的辐射。波长关系：激发光＜荧光＜磷光。
3.2 基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>
2. 荧光和磷光的产生
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素
➢ 例如：硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和
散射光谱
H
O H3C
H HO
N H
CH CH2
1/2H2SO4 H2O
N
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素

荧光分光光度法共49页

，就像为了城墙而战斗一样。 ——赫拉克利特 17、人类对于不公正的行为加以指责，并非因为他们愿意做出这种行为，而是惟恐自己会成为这种行为的牺牲者。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强者做什么事都横行霸道。— —奥维德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含义是财富。— —爱献生
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德谟克利特 67、今天应做的事没有做，明天再早也是耽误了。——裴斯泰洛齐 68、决定一个人的一生，以及整个命运的，只是一瞬之间。 ——歌德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布克 70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭

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平行自旋比成对自旋稳定（洪特规则），三重态能级比相应单重态能级低。
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 激发态→基态的能量传递途径：（1）多种途径和方式（见能级图）：返回速度最快、激发态寿命最短（停留时间短）的途径占优势，发生的几率大，发光强度相对大。
（2）第一、第二、…电子激发单重态表示为S1、S2…；
❖ 相对于磷光和化学发光而言，目前荧光法的应用较多。
本章主要讨论荧光分析。
第三章荧光分光光度法[002]
3.1 分子荧光产生的本质(Molecular Fluorescence)
图3-1 吸收第光三谱章荧和光分荧光光光度光法[0谱02]能级跃迁示意图
❖ 电子激发态的多重度：M=2S+1（S为电子自旋量子数的代数和（0或1）
第一、第二、…电子激发三重态表示为T1、T2…。
第三章荧光分光光度法[002]
（3）电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁（发光）和无辐射跃迁等方式失去能量；（4）辐射跃迁：荧光、延迟荧光和磷光；
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 无辐射跃迁（非辐射能量传递过程）：系间跨越、内转移、外转移和振动弛豫。
第三章荧光分光光度法[002]
时至今日，荧光分析在方法上取得了极大的进展。促进了诸如时间分辨、相分辨、荧光偏振、荧光免疫、同步荧光等荧光分析新方法的发展，同时促使各种各样新型荧光分析仪器的出现。
第三章荧光分光光度法[002]
在仪器化方面，微机控制的全自动荧光分析仪具有灵敏度高（比紫外-可见分光光度法高2~3个数量级）、选择性好、工作曲线线性范围宽，且能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、偏振和各向异性诸多信息等优点，已成为一种重要的痕量分析技术。
❖ 通过化学反应使分子受激而发光称为“化学发光”。利用化学发光进行分析工作叫 “化学发光分析”。
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 化学发光分析、荧光分析和磷光分析统称为“分子发光分析(molecular luminescence)”。
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 荧光和磷光同属光致发光。通过测定发光的强度可以定量测定许多痕量的无机物和有机物。
第三章荧光分光光度法[002]
在生物、医学、医药、环境和石油工业等诸多领域，荧光分析法都有广泛的应用。不仅能直接和间接地分析众多的有机化合物，而且利用与有机试剂间的反应还能进行许多无机元素的测定。
第三章荧光分光光度法[002]
随着科技的发展进步，荧光这种光致发光（photoluminescence）的本质进一步被揭开。
需要注意的是：（1）整个过程是在单线态之间进行的；
（2）产生荧光的过程极快，约在10-8秒左右内完成；
（3）荧光的产生是由第一电子激发态的最低
振动能级开始，而与荧光分子被激发至哪一
个能级无关。
因此，荧光光谱的形状和激发光的波长
无关。
第三章荧光分光光度法[002]
2. 磷光（Phosphorescence）当某些物质分子被激发到较高的能级，
1.产生荧光的原因荧光物质的分子吸收了特征频率的光能
后，由基态跃迁到能级较高的第一电子激发态或第二电子激发态，然后通过无辐射跃迁返回到第一电子激发态的最低振动能级上，再从该能级降落至基态的各个不同的振动能级上，同时放出相应能量的分子荧光，最后以无辐射形式回到基态的最低振动能级。
第三章荧光分光光度法[002]
第三章荧光分光光度法[002]
3. 迟滞荧光（延迟荧光）某些分子在跃迁至三重线态之后，通过
热激活作用，可以再回升至第一电子激发态的各振动能级上，然后再由第一电子激发态的最低振动能级（v=0）降落至基态的各个不同振动能级而发出荧光，这种光叫做迟滞荧光（或：延迟荧光）。
（1）振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。发生振动弛豫的时间10-12s。（2）内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃迁回第一激发单重态的最低振动能级。
第三章荧光分光光度法[002]
第ometry)
第三章荧光分光光度法[002]
前言： ❖ 1852年，斯托克斯（Stokes）发现萤石在暗处受到光的照射会发出一种蓝白色的光，他把这种光命名为“荧光”。
❖ 1868年 Goppelstroeder发表了利用Al-桑色素绿色荧光来分析微量Al的分析方法，可见荧光分析是一种历史悠久的分析方法。
并通过无辐射跃迁降落至第一电子激发态的最低振动能级之后，尚不能继续直接降落至基态，而是通过另一次无辐射跃迁降至一个中间的亚稳态能级—三重线态上，这些分子在三重线态上经短暂停留后，再降落至基态的各个不同的振动能级上，同时发出辐射光，称这种发出的辐射光为磷光。
第三章荧光分光光度法[002]
磷光与荧光的区别主要为：（1）产生磷光的过程稍长，约在10-5秒~0.1 秒，有时长达1秒以上；（2）两者发光机理不同；（3）在辐射停止几秒或更长一段时间后，仍能检测到磷光，而上述荧光现象在照射光一旦停止照射，荧光便立即消失。
（3）外转换：激发分子与溶剂或其它分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
（4）系间跨越：不同多重态，有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。/激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋-轨道耦合进行。第三章荧光分光光度法[002]
❖ 物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不同波长光的照射后，同样也有发光现象。例如：X-荧光、红外荧光等。
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 除了吸收光能使分子激发而发光，根据起始激发形成的方式，可以将荧光同其它的发光类型（例如：生物发光、热发光、化学发光和摩擦发光）区别开来。