His标签融合蛋白纯化常见问题解析

组氨酸(His)标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化。

IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。

同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。

1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。

Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。

步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。

镍柱纯化常见问题及分析1:通过His标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？（1）如果纯化的是上清，蛋白酶会部分降解目的蛋白，可通过加多种入蛋白酶抑制剂改进。

（2）可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度，以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。

（3）杂蛋白和目的蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。

2:镍柱使用中出现棕色是怎么回事?(1)出现这样的情况，主要是缓冲液中DTT的影响，DTT会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响,在碱性的缓冲液条件下，镍离子会被DTT还原生成棕色的沉淀，所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免DTT的参与（一般的镍柱耐受小于5mM DTT,推荐缓冲液中不要超过2mM DTT）。

3:柱子堵了，怎么办？（1）柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要高速离心。

（2）上清纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，赶紧加入1-2mM DTT(上清样品处理要在冰浴中进行)，还不行加尿素变性，使其在变形环境下。

（3）样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大，或者导致蛋白析出或变性，料液比要在1/10-1/15之间较适宜。

4：纯化过程中，蛋白出现了浑浊，怎么办？（1）出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定，所以要检查缓冲体系是否正确，环境是否低温，或在缓冲液中加入还原剂DTT。

（2）加入肌氨酸钠，迅速使蛋白变性，消除浑浊现象。

5：没能纯化到带His标签的蛋白，蛋白都流穿了（未挂柱）？（1）超声的功率不对(太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放)策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶。

（2）样品或者是结合缓冲液不正确：策略：检测pH及样品和结合缓冲液的组成份（EDTA 等）。

确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及起始咪唑的浓度不是太高。

（3）组氨酸的标签没有完全的暴露策略：在变性条件下(用8M脲，6M盐酸胍,1%SDS)并加入1-2mMDTT进行纯化。

蛋白纯化常见问题：His标签1、常用的His标签蛋白纯化填料，Ni Sepharose 6FF和Ni Sepharose HP有什么区别，应该如何选？答：HP：High Performance，高性能，填料平均颗粒大小约34 μm，颗粒细能带来高分辨率的分离纯化。

HP 纯化后峰更窄，样品浓度高，节省了浓缩步骤的时间，但会带来更高的反压，因此流速更慢。

FF：Fast Flow，快流速，填料平均颗粒大小约90 μm，较 HP 颗粒粗，流速快，具有良好的分辨率及轻松实现规模扩大的分离纯化，同样适用于重力流下的蛋白纯化和多孔板筛选。

2、HisTrap FF Crude 和 HisTrap excel 的特点是什么？应该如何选择？答：HisTrap FF Crude 的滤膜孔径更大，裂解液无需离心过滤处理，可以直接上样，适合样品不稳定或者比较粘稠容易造成柱子堵塞的料液。

例如如果纯化包涵体蛋白较多时，可以优先考虑FF Crude （预装柱）或 FF。

HisTrap excel 最大的特点是镍脱落极低，且能耐受100 mM EDTA，特别适合真核外泌蛋白（如培养基中含有螯合剂）。

无需脱镍，即可直接使用 NaOH 清洗，防止交叉污染且有更长的使用寿命。

3、 His 标签蛋白纯化实验中，常用的缓冲液成分是什么？答：建议缓冲溶液成分如下· 结合缓冲溶液：FF、 HP系列： 20mM磷酸钠缓冲溶液， 500mM NaCl(避免非特异电荷吸附)，20-50mM 咪唑(提高浓度，可以增加纯度但会降低收率)， pH7.4 (可以根据实际情况调节pH)。

Talon 系列：20mM 磷酸钠缓冲溶液，500mM NaCl，10-20mM咪唑， pH7.4。

Excel 系列： 20mM 磷酸钠缓冲溶液， 500mM NaCl， pH7.4 (结合缓冲液中一般不添加咪唑，在wash缓冲液中可根据样品性质加入 0-30 mM 咪唑)· 洗脱缓冲溶液：20mM 磷酸钠缓冲溶液，500mM NaCl，500mM 咪唑，pH 7.44、纯化得到的组分中没有或很少目的 His 标签蛋白，怎么回事？答：若目的His 标签蛋白正常表达（使用抗His 标签的抗体进行WB 检测）且充分释放至上清中，确认蛋白是流穿还是未被洗脱：若 His 标签蛋白流穿：· 样品或结合缓冲液的条件不合适，注意螯合剂或强还原剂以及咪唑的浓度。

蛋白纯化试剂的原理及蛋白纯化实验问题分析蛋白纯化试剂盒主要是利用蛋白与亲和介质的亲和能力不同达到蛋白分离纯化的目的。

蛋白纯化试剂常见的蛋白标签有GST标签、HIS 标签等，本文主要介绍了蛋白纯化试剂盒的原理、His Tag 蛋白纯化方法试剂选择的方法、GST 标签融合蛋白纯化问题分析等。

蛋白抽提试剂盒和蛋白纯化试剂盒用途有什么不同?蛋白抽提试剂盒是从细菌、真菌、新鲜动植物组织或细胞蛋白、培养动植物组织将全细胞蛋白、核蛋白、胞浆蛋白、带化学修饰基团的天然蛋白(例如磷酸化蛋白)中的一种或两种以上作为目标从样品中分离收集的一套试剂。

用于液体样品中蛋白浓缩、提取、或脱盐、脱去垢剂、脱还原剂等目的。

蛋白纯化试剂盒用于将连接有Flag标签GST HIS 标签的重组蛋白、包涵体蛋白、抗体从重组蛋白表达系统中高效浓缩分离出来。

主要原理是利用蛋白A或蛋白G与抗体的不变区有多个结合位点或Ni- Sepharose与HIS标签蛋白在不同缓冲液条件下亲和能力多得多差异分离目标蛋白。

将蛋白A与Sepharose共价交联制备的层析介质，可以用于纯化抗体。

抗体与蛋白A或蛋白G在高盐高pH值条件下结合，在低盐低pH值条件下解离。

蛋白纯化试剂盒广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

GST常见问题解答集锦纯化方法的问题解决以下解决问题的指南指出了对于大多数纯化方法的普遍问题,对于特别的纯化方法的问题也有提及,这种情况下会指出相应的纯化方法.问题可能原因解决方法G S T 标签蛋白GST标签蛋白被机械裂解的方法在裂解过程中,用温和的机械/化学裂解条件.裂解的条件不结合柱子或变性(比如超声).过分的裂解必须依照经验来决定. 结合非常弱会使标签蛋白变性,阻止其结合. GST标签蛋白在样品中有聚集, 在细胞裂解前加入DTT,在缓冲液中也加入DTT.1-20mM 导致沉淀标签蛋白的浓度过低的DTT会显著增加某些GST蛋白的结合. 浓缩样品.结合能力是浓度依赖的.低表达量的蛋白可能不会像高表达量蛋白那样有效地结合柱子.因此,浓缩样品会提高结合. 标签蛋白可能改变了G S T 的构检测所使用的pGEX载体中GST的结合.准备带有所使用的象,因此降低了GST标签蛋白的pGEX的细胞超声裂解物,检测其与柱材的结合.如果结合结合能力. 的很好,则可能是标签蛋白改变了GST的构象,因此降低了GST标签蛋白的亲和力.可以通过降低结合的温度到4°C限制洗涤来改善结果. 平衡时间太短确认柱材至少用5倍柱体积的pH6.5到8.0的缓冲液平衡过(比如PBS). GST标签蛋白在pH值低于6.5和高在净化好的样品上样前用pH6.5到8.0的缓冲液平衡过(比如于8时结合效率低GSTrap柱:柱子需要清洗PBS). 根据标准的清洗步骤清洗柱子(见附录2).如果GSTrap柱已经用过几次了,可能需要换用新柱. Glutathione Sepharose柱材使用使用新的Glutathione Sepharose柱材(清洗过程请见附录次数过多样品上样过程中的流速过高2) 降低在上样时的流速.影响GST标签蛋白结合的一个重要参数就是流速.由于GST与谷胱甘肽相对慢的结合,在样品上样过程中保持低流速以获得最大结合能力很重要. 在KTAprime plus上的GSTrap 柱子堵住了:根据说明书清洁柱子,确认样品已经离心或柱:柱子或系统被堵住了,导致用0.45m的滤膜过滤过了. 高压力和无结合. 系统堵住了:将柱子换成一段管子.如果压力高于0.3MPa,根据手册清洗系统在KTAprime plus上的GSTrap 检测是否使用了正确的柱子. 柱:样品不结合检测流入管是否接入了正确的流入端口. 检测缓冲液的组成和pH值是否正确.检测样品是否已经被调节到适合结合缓冲液的条件.1G S T 标签蛋白洗脱缓冲液的体积不够不能被高效的洗脱洗脱的时间不够增加洗脱缓冲液的体积.有些情况下,尤其是柱上酶切有标签蛋白时,需要更大体积的缓冲液来洗脱标签蛋白. 通过降低洗脱过程中的流速来增加洗脱时间. 对于GSTrap柱,为了获得最好的结果,在样品上样时,用0.2到1ml/min的流速(1ml HiTrap柱),0.5到5ml/min的流速(5ml HiTrap柱).对于离心方法,降低洗脱过程中的离心速度.谷胱甘肽的浓度不够增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度:本方案中建议的10mM 浓度对于大多数应用来说足够了,但是也存在例外.尝试使用50mM Tris-HCl,20-40mM 还原型谷胱甘肽,pH8.0作为洗脱缓冲液.洗脱缓冲液的pH过低增加洗脱缓冲液的pH值:将pH增加到8-9会增强洗脱而不用提高洗脱所用谷胱甘肽的浓度.洗脱缓冲液的离子强度过低.增加洗脱缓冲液中的离子强度,在洗脱缓冲液中加入0.10.2M的氯化钠也会使结果变好.洗脱缓冲也中的谷胱甘肽被氧化使用新鲜的洗脱缓冲液. 了加入DTT.非特异的疏水相互作用导致蛋白向洗脱缓冲液中加入非离子去垢剂.加入1%的TritonX-100 和柱材非特异的结合或聚集,从或2%的n-octylglucoside可以显著提高某些GST标签蛋白的而阻止了标签蛋白的溶解和洗洗脱. 脱. 电泳或蛋白质分子量为70 000 的蛋白与GST标分子量为70 000 的蛋白可能是大肠杆菌dnaK基因的产物. 免疫印迹检测签蛋白共纯化发现多条条带该蛋白参与大肠杆菌中蛋白质折叠.有报道这种相互作用可以通过上样前在50mM Tris-HCl,2mM ATP,10mM MgSO4,pH7.4中37°C温浴10分钟而破坏.或者把有标签蛋白通过A TP-agarose或相似的纯化介质或进行离子交换层析来除去. 标签蛋白被蛋白酶部分降解加入蛋白酶抑制剂.多条条带可能是由于目的蛋白被蛋白酶部分降解的结果.在裂解溶液中加入1mM PMSF可能会使结果变好.一种无毒的水溶性的PMSF替代物是AEBSF, Roche Biochemicals的商品名为Pefabloc SC.注:丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa前除去. Prescission Protease不是一种经典的丝氨酸蛋白酶.经GE Healthcare检测,它对很多蛋白酶抑制剂不敏感. PMSF有毒,有急性作用.如果可能的话使用Pefabloc SC.2在宿主细菌中的蛋白降解用一种蛋白酶缺失型宿主:多条带可能是在宿主细菌中蛋白酶切造成的.如果是这种情况,或许需要蛋白酶缺陷型菌株(比如lon-或ompT).大肠杆菌BL21随pGEX载体提供. 这种菌株是ompT和lon缺陷型菌株.在机械裂解过程中细胞破碎降低裂解时间:细胞裂解表面上是使悬浊液部分澄清,可以通过镜检检测.机械裂解前加入溶菌酶(0.1倍体积的10 毫克/毫升溶菌酶溶液,溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 )可能会使结果变好.避免发泡,因为这可能使标签蛋白变性.过分裂解也会导致宿主细胞蛋白和GST标签蛋白共纯化.分子伴侣可能被共纯化了包括额外的纯化步骤:多余的条带可能由于共纯化一些分子伴侣所造成.这些分子伴侣参与大肠杆菌中新生成的蛋白的正确折叠.这些包括,但不仅仅是:DnaK(分子量70 000)DnaJ(分子量37 000)GrpE(分子量40 000)GroEL (分子量57 000)GroES(分子量10 000).一些从这些共纯化的蛋白中分离GST标签蛋白的方法已经发表.抗体和很多种大肠杆菌中的蛋白抗体和大肠杆菌蛋白交叉反应:取决于抗GST抗体的来源. 反应它可能包含一些抗体,这些抗体与标签蛋白样品中的大肠杆菌蛋白能够反应.通过和大肠杆菌的超声裂解物反应来除掉那些能够交叉反应的抗体.GE Healthcare的GST抗体已经和大肠杆菌蛋白进行过交叉吸附,并检测证明其在蛋白质免疫印迹中没有非特异条带. 目的蛋白酶切蛋白酶切发生在宿主细菌内后电泳检测发现多条条带检测条带何时出现:确定多余的条带在Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa切割前不存在.这些条带可能是在宿主细菌中降解的结果. 目的蛋白可能含有Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa 的切割位点,检查序列.细节请参见《GST基因融合系统手册》.His Tag 蛋白纯化方法之选择全攻略HisTag 蛋白纯化篇：用基因工程的方法来表达蛋白质，必须经过纯化才能实现最终目的。

1）蛋白不溶解或沉淀在柱子上：要留意缓冲液体的pH，此外在样品中添加一些表面活性剂甚至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性蛋白的溶解度，避免沉淀。

2）蛋白不吸附：这是最常见的，通常的原因有1是标签不暴露，被折叠在蛋白的结构内，可以在变性的条件下去纯化，2可以选择作用力更强，配基密度更高的填料，通常镍琼脂糖凝胶作用力最强，如果蛋白分子量大可以选择手臂长的填料，如镍NTA琼脂糖凝胶，填料的好坏可以看填料的颜色，颜色越深那配基密度越高，作用力也相应要强。

3样品的pH过低或者沉淀导致不能吸附，所以样品和缓冲液的pH要尽量一致，避免沉淀，通常再偏碱性条件下吸附更好。

3）难洗脱：如果穿透中目标蛋白明显减少，而洗脱又没有，取点填料加电泳缓冲液煮后离心跑电泳还是有目标蛋白，可以用更强的洗脱条件如500mM咪唑，如果还不能洗脱，可以直接用500mM咪唑加到6M盐酸胍去洗脱。

4）电泳杂带多：因为这种亲和毕竟特异性要差点，原因在蛋白中带组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等很常见，特别是蛋白折叠会导致几个这样的氨基酸残基临近，这样也会使它们和镍柱的作用力增加，因此可以用不同浓度的咪唑阶段洗脱，此外在咪唑洗脱前增加一步0.5M pH5的醋酸缓冲液洗脱，在平衡缓冲液中添加0.5%吐温或Triton可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附，这样可以电泳的杂带明显减少，但是如果用这样的方法还是杂带多，那就地回头去看看破碎的条件是不是太剧烈或者温度控制不好导致蛋白短裂或者分解导致一些蛋白片段带标签，或者因为样品长时间保存导致水解等，总之纯化的好坏决定于每一个步骤，不仅仅是纯化的问题。

还有一个不容忽略的问题是有时候因为蛋白相互作用或者因为形成聚合体导致杂带增加，而由于疏水相互作用或者因为离子作用可以通过添加表面活性剂或者增加离子强度得到改善，对于因为形成聚合体的可以在缓冲液和样品中加1-2mM巯基乙醇避免，如果这样的情况下最好是选择镍NTA琼脂糖凝胶，因为它在还原剂下更稳定。

His标签融合蛋白纯化常见问题解析（博进生物）1. 纯化原理His标签融合蛋白的纯化是借助于层析介质上的过渡金属离子（如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等）与His融合蛋白上的His标签的配位作用实现目标蛋白的分离。

组氨酸（His）的残基上带有1个咪唑基团，可以和Ni2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上，这些金属离子通过螯合配体固定在层析介质上，因此带有His标签的蛋白可以特异性的吸附在螯合了Ni2+等过渡金属离子的层析介质上，而其他不含His标签的杂质蛋白则不能吸附或仅微弱吸附在介质上。

通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，可以将His标签融合蛋白从层析介质上解吸附下来，从而得到较高纯度的目标蛋白。

2. His标签蛋白纯化策略His标签蛋白纯化的所有优化策略都是基于改变标签蛋白和过渡金属离子之间配位作用力的强弱，而影响配位作用力强弱的因素如下：2.1 标签长度及暴露程度最常用的His标签是6个重复的组氨酸，但在实际操作过程中，可控制在4-10个组氨酸的标签长度。

标签越长，蛋白与过渡金属离子的结合力越强。

过渡金属离子只能与蛋白表面的组氨酸集合，所以His标签暴露的程度越高，结合能力越强。

2.2 过渡金属离子半径常用于螯合His标签蛋白的过渡金属离子有Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等，金属离子的半径越小，与His标签蛋白的结合能力就越强。

上述金属离子与His标签蛋白结合能力的强弱顺序为Cu2+ >Zn2+ >Ni2+ >Co2+2.3 缓冲液条件His标签融合蛋白与过渡金属离子的螯合作用受缓冲液的pH值影响。

在中性或弱碱性（pH 7-8）环境下的螯合作用力要强于酸性环境下的作用力。

His标签融合蛋白与过渡金属离子的螯合作用还受缓冲液种类的影响。

通常磷酸盐缓冲液中的螯合作用力强于Tris-HCl缓冲液中的作用力。

由于咪唑可以和His标签蛋白竞争过渡金属离子，所以缓冲液中咪唑浓度的升高可减弱上述螯合作用力。

His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦（二）His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦（二）GE Healthcare产品专家：查业、朱燕His标签的纯化方式是最常用的亲和层析的方法之一，镍离子作为纯化His融合蛋白的首选金属离子，镍填料的具体使用方法也成为用户比较关心的问题。

继His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦第一期収表后，应用户的需求，我们现推出第二期，内容如下：1.使用几次以后发现镍柱的载量下降，挂柱效率降低，如何处理？HisTrap或Ni填料怎么进行有效的再生或清洗？答：如果镍柱的载量下降或者挂柱效率降低，可能是由于逐渐积累的沉淀、变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点，而通过洗脱液无法彻底清洗所致。

建议可以采用不同的清洗方法来提高载量：1）较温和的清洗方法为了去除沉淀或变性物质，可以尝试用2倍柱体积的6M盐酸胍或8M尿素洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液洗涤；为去除疏水结合的物质，可以尝试2倍柱体积1%的Triton X-100洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液洗涤。

若改变不明显，可以选择下面更强烈的清洗方法。

2) 更强烈的清洗方法首先用5－10倍柱体积的脱镍缓冲液（20 mM 磷酸钠, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH7.4）洗涤，迚行脱镍操作，然后用5－10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗，最后用5－10倍柱体积的双蒸水冲洗；随后迚行清洗操作，去除离子型杂蛋白，可以用5倍柱体积的1.5M NaCl溶液，然后10倍柱体积的双蒸水冲洗；去除沉淀或变性蛋白，可以用1M氢氧化钠溶液，结合1－2小时，然后用10倍柱体积的平衡缓冲液和10倍柱体积的双蒸水迚行冲洗；去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用5－10倍柱体积的30%异丙醇溶液清洗，然后10倍柱体积的双蒸水洗涤；最后迚行生镍操作，用0.1M硫酸镍上柱，随后5倍柱体积的双蒸水和平衡缓冲液迚行洗涤，如需保存，保存在20%乙醇溶液即可。

2.通过组氨酸标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？答：可能原因1），蛋白酶部分降解目的蛋白，可通过加入蛋白酶抑制剂改迚；可能原因2），杂蛋白对金属离子有高亲和力，可用分步洗脱或咪唑浓度线性梯度洗脱来确定在结合和洗涤过程中最优的咪唑浓度。

His标签融合蛋白纯化常见问题解析（博进生物）1. 纯化原理His标签融合蛋白的纯化是借助于层析介质上的过渡金属离子（如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等）与His融合蛋白上的His标签的配位作用实现目标蛋白的分离。

组氨酸（His）的残基上带有1个咪唑基团，可以和Ni2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上，这些金属离子通过螯合配体固定在层析介质上，因此带有His标签的蛋白可以特异性的吸附在螯合了Ni2+等过渡金属离子的层析介质上，而其他不含His标签的杂质蛋白则不能吸附或仅微弱吸附在介质上。

通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，可以将His标签融合蛋白从层析介质上解吸附下来，从而得到较高纯度的目标蛋白。

2. His标签蛋白纯化策略His标签蛋白纯化的所有优化策略都是基于改变标签蛋白和过渡金属离子之间配位作用力的强弱，而影响配位作用力强弱的因素如下：2.1 标签长度及暴露程度最常用的His标签是6个重复的组氨酸，但在实际操作过程中，可控制在4-10个组氨酸的标签长度。

标签越长，蛋白与过渡金属离子的结合力越强。

过渡金属离子只能与蛋白表面的组氨酸集合，所以His标签暴露的程度越高，结合能力越强。

2.2 过渡金属离子半径常用于螯合His标签蛋白的过渡金属离子有Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等，金属离子的半径越小，与His标签蛋白的结合能力就越强。

上述金属离子与His标签蛋白结合能力的强弱顺序为Cu2+ >Zn2+ >Ni2+ >Co2+2.3 缓冲液条件His标签融合蛋白与过渡金属离子的螯合作用受缓冲液的pH值影响。

在中性或弱碱性（pH 7-8）环境下的螯合作用力要强于酸性环境下的作用力。

His标签融合蛋白与过渡金属离子的螯合作用还受缓冲液种类的影响。

通常磷酸盐缓冲液中的螯合作用力强于Tris-HCl缓冲液中的作用力。

由于咪唑可以和His标签蛋白竞争过渡金属离子，所以缓冲液中咪唑浓度的升高可减弱上述螯合作用力。

His标签蛋白纯化全攻略作为重组蛋白构建过程中最常用的标签，相信奋战在实验室中的小伙伴对His标签并不陌生。

His标签可通过Ni2+柱进行简单有效的纯化，不过纯化容易想要纯化好却并不那么容易。

爱纯派助力His标签纯化，马上为大家送上His标签纯化全攻略。

His标签蛋白的纯化原理组氨酸（His）的残基上带有1个咪唑基团，可以和Ni2+、Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上，这些金属离子能够用鳌合配体固定在层析介质上，因此带有组氨酸标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性的结合在介质上，而其他的杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。

结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，从而得到较高纯度的His标签蛋白。

His标签蛋白纯化说起来简单做起来难。

小编也常常收到小伙伴们类似于“His标签重组蛋白Ni2+柱纯化后纯度不够”、“His标签蛋白挂不到Ni2+柱上”等等之类的抱怨。

其实呢，不怕做不到，就怕没想到。

His标签蛋白纯化是有很大的优化空间哦~His标签纯化优化策略His标签蛋白纯化的所有优化策略都是基于改变标签蛋白和金属离子之间配位结合作用力的强弱，而这种作用力主要和一下因素相关：1） 标签长度及暴露程度：最常用的His标签时6个重复的组氨酸，但在实际操作过程中，根据实际情况可控制组氨酸的数目从四到十个不等。

较短的标签与金属离子的结合更弱，较长的标签与金属离子的结合更强；而标签的暴露程度也很容易理解，金属离子只能和蛋白表面的His结合，所以His标签暴露程度越高，结合能力越强。

2） 金属离子半径：除最常用的Ni2+以外，但 Cu2+、Zn2+、Co2+等金属离子都可用于标签蛋白的纯化，不同金属离子区别在于离子半径不同，离子半径越小，离子半径越小，与与His His标签蛋白的纯化，不同金属离子区别在于离子半径不同，离子半径越小，的结合能力也就越强。

His-Tag融合蛋白纯化注意事项海狸纳米科技His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性。

无论是可溶性表达的蛋白或者包涵体都可以用海狸组氨酸标签蛋白纯化磁珠（BeaverBeads TM IDA Nickel、BeaverBeads TM IDA Cobalt）进行纯化。

Beaverbeads TM IDA磁珠的选择：Beaverbeads TM IDA磁珠分为镍离子（Nickel）螯合磁珠、钴离子（Cobalt）螯合磁珠。

镍离子螯合磁珠与蛋白结合力较强，载量较高。

每毫升（沉降体积）Beaverbeads TM IDA-Nickel的蛋白结合量可达到40 mg，每毫升（沉降体积）Beaverbeads TM IDA-Cobalt的结合量约为25 mg。

如果一个蛋白与磁珠结合力较强，想得到较高的纯度，可以选择Beaverbeads TM IDA-Cobalt。

Beaverbeads TM IDA使用常见问题及解析：1、蛋白不吸附或亲和力低首先确认纯化前的样品中是否有目标蛋白。

（1）有目标蛋白，但大量穿透：a、蛋白不含有标签或未能正确表达。

解决措施：Western Blot鉴定目标蛋白是否有His-Tag。

若没有，需要重新构建载体，添加组氨酸标签，并确认标签正确表达。

b、蛋白折叠导致组氨酸标签未完全暴露。

解决措施：在样品和平衡缓冲缓冲液中加1-2M尿素，这样蛋白结构相对松散，也许能吸附而蛋白不会变性。

在变性条件下纯化蛋白，加入4~8M尿素或4~6M盐酸胍使蛋白变性。

如果蛋白有二硫键，最好加1-2mM DTT或1~5mM巯基乙醇（在样品中添加），可以改善蛋白的吸附。

重新构建载体，将组氨酸标签换到另外一端，或在组氨酸标签基因与目的基因之间增加一段Linker，可以降低蛋白折叠后标签被掩盖的几率。

c、标签太短。

解决措施：将标签的组氨酸数量增加至6-10个。

d、蛋白标签被水解。

之阳早格格创做组氨酸标签蛋黑的杂化His-Tag混同蛋黑是暂时最罕睹的表黑办法，而且很老练，它的便宜是表黑便当而且基础不效率蛋黑的活性，无论是表黑的蛋黑是可溶性的大概者包涵体皆不妨用牢固金属离子亲战色谱去（IMAC）杂化.2．1 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用牢固IDA动做配基的挖料螯合过度金属铜、镍、钴大概锌离子，不妨吸附杂化表面戴组氨酸、色氨酸大概半胱氨酸残基的蛋黑，1987年Smith et al. 创造戴有几个组氨酸大概色氨酸小肽战螯合金属离子的IDA-sephadex G-25效率力更强，此前正在1986年他战他的合做家用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲战杂化正在氨基端戴组氨酸战色氨酸的胰岛素本.共年1987年Hochuli et al.创造戴有贯串组氨酸的多肽战Ni2+-NTA挖料效率力更强于一般的肽，1988年他第一次用那样的要领杂化了戴六个组氨酸标签的多肽，无论是正在天然仍旧变性条件下一次亲战杂化皆得到很佳效验，今后表黑戴六个组氨酸标签的蛋黑协共IMAC变得非常普遍，相对付而行，不戴标签的蛋黑杂化便非常艰易，所以表黑戴六个组氨酸标签的蛋黑协共IMAC 杂化形成最时常使用而且最灵验的钻研蛋黑结媾战功能的有力脚法.1986年Porath et al.还创造Fe3+-IDA-sephadex G-25不妨用于磷酸化蛋黑的杂化，而后创造Ga3+-IDA也有共样的效验，那样螯合那二种金属离子的挖料便灵验用于磷酸化多肽的富集战杂化，共时IMAC也不妨用于杂化百般战金属离子分离的多肽，应用非常广大.市里罕睹的商品化IMAC用于戴六个组氨酸标签蛋黑的配基有以下几种：2.2效率IMAC杂化截行的果素：2.2.1挖料的种类：分歧挖料厂家的挖料有不共，所以使用历程最佳能得到厂家的技能支援，果为分歧的厂家挖料分歧，别的蛋黑杂化本性很强，不哪一个挖料是能符合所有戴六个组氨酸标签蛋黑的杂化，载量下战特同性佳自己便是冲突.2.2.2挖料的配基种类、稀度、金属离子种类挖料最简朴的推断是螯合佳共样的金属离子，哪产业品的颜色越深便表示着战蛋黑的效率力越强，适用范畴越广，载量也越下，杂化的佳坏关键瞅杂化的条件，仅有挖料的特同性是不敷的，共样配基稀度下IDA挖料的亲战力要比NTA的强，所以NTA上不克不迭吸附的样品不妨采用IDA为配基的挖料.螯合金属离子战蛋黑效率强强为铜战镍离子的强，而锌战钴离子的强.果此如果一个蛋黑效率力强，念得到佳的特同性不妨采用螯合钴离子，它另有一个便宜是不怕还本剂，特天时间有下浓度的还本剂.相共金属离子，IDA的强于NTA.螯合金属离子的价位越矮战蛋黑的效率力越强.共时镍离子是最时常使用的，如果有条件不妨换分歧金属离子以得到更佳的效验，果为分歧的金属离子有分歧的采用性.果此要期视挖料应用范畴广便采用镍琼脂糖凝胶，如果是期视特同性佳而且宁静便采用镍NTA琼脂糖凝胶.2.2.2蛋黑自己的结媾战样品根源IMAC本理已经证明只消是戴组氨酸、色氨酸大概半胱氨酸残基的蛋黑皆不妨被吸附，所以要念得到佳的杂化效验，必须采用佳杂化的条件，常常戴组氨酸蛋黑皆不妨正在天然情况下被镍琼脂糖凝胶大概镍NTA琼脂糖凝胶吸附，然而是如果标签合叠正在蛋黑里里阻挡易表露，那样便易杂化，如果镍琼脂糖凝胶皆不克不迭吸附，不妨正在样品战仄稳慢冲液中加1-2M 脲，那样蛋黑结构相对付紧集，也许能吸附而蛋黑不会变性，对付于自己便是变性的蛋黑如果8M脲不克不迭吸附，改用6M盐酸胍溶解样品便不妨被吸附，果为盐酸胍不妨挨启脲挨不启的结构使得标签能表露.天然如果有二硫键最佳加1-2mMDTT也不妨更佳办理吸附的问题.别的也不妨把标签换到其余一端.2.2.3 慢冲体系，pH及盐浓度对付于一些效率力强的蛋黑不克不迭采用戴氮本子的的一些慢冲体系，如Tris-HCl等，符合普及慢冲液pH不妨减少吸附效验，共样本理不妨降矮pH洗脱一些咪唑洗不去的杂戴.为预防由于电荷效率的搞扰，仄稳慢冲液中需要加0.1-1M氯化钠，而正在仄稳慢冲液增加00.1-0.5%吐温大概者triton不妨降矮由于疏火相互效率引导的非特同吸附.2.2.4 表面活性剂及其余增加剂增加一些表面活性剂不妨减少蛋黑的溶解度，降矮疏火相互效率，那样使杂化的截行更佳，正在真验标明正在仄稳慢冲液中加0.5-1%的吐温不妨使电泳的背景更浑晰，杂戴缩小.对付一些易溶解的样品也不妨加乙醇大概者苦油.正在变性条件下偶尔会正在样品中增加还本剂如巯基乙醇大概者二巯基苏木糖醇，它们如果浓度过下大概者上样量过大，会引导镍离子还本以至脱降，使挖料做废，如果要正在那样的环境下，那最佳采用螯合价位下的挖料如镍NTA琼脂糖凝胶大概降矮还本剂的浓度，常常1-2mM是出问题的.如果一定要采用下浓度的还本剂，也不妨把镍离子还成钴离子，它不怕还本，把一般的镍琼脂糖凝胶还成钴离子即可.以下是破碎及提与、杂化支配战罕睹问题办理要领：破碎要领样品的处理对付杂化是很要害的，要害的准则是破碎要温战，不克不迭使蛋黑断裂大概者降解，可则一些片段共样也戴有标签，那样减少了杂化的易度.需要注意的问题是超声破碎温度，强度，时间大肠杆菌的破碎要领：1）支集培植收酵液，4度7000-8000g离心10分钟，支集重淀的菌体(如果不是赶快破碎不妨搁-70度热冻，然而是最佳能保存成小块大概者薄片，那样佳用.)2）与1-2克菌体加10ml破碎慢冲液（pH7.4的50mM磷酸慢冲液含0.5M NaCl，0.5mg/ml溶菌酶，1mM PMSF，1mM MgCl2，1.7units/ml Benzonase,其中的菌酶，1mM PMSF，1.7units/ml Benzonase现加）正在冰上混同45分钟，如果pH不正在7-8，需要用0.5M NaOH一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml混同时间不妨支缩到10分钟.3）把混同菌体正在冰火中用超声探头破碎20秒种,总合四次,中间隔断要脆持2分钟热却破碎液,检测pH,如果不正在7-8,仍旧用0.5M NaOH一边搅拌一边滴加去调.如果菌体的为50-500克,不妨下压破碎的要领,慢冲液共上,体积为1降,破碎三次,压力为800 bar.4）破碎的液4度12000g离心10分钟，如果要让溶液更澄浑，不妨4度50000g离心30分钟，那时间不妨把上浑战重淀分别留样，跑电泳，如果只重淀中有目标蛋黑，那便用变性条件下去提与.5）破碎离心的上浑加2M咪唑溶液0.12ml使末浓度为20mM，样品的总体积为10ml.过柱子的样品最佳过0.45μm的滤膜，预防堵柱.2．可溶性蛋黑的杂化1）仄稳慢冲液：pH7.4的50mM磷酸慢冲液含0.5M NaCl，含20mM咪唑.2）洗脱慢冲液：pH7.4的50mM磷酸慢冲液含0.5M NaCl，含500mM咪唑.3）与1ml镍琼脂糖凝胶FF大概镍NTA琼脂糖凝胶FF预拆柱，用10ml仄稳慢冲液仄稳，而后与破碎上浑10ml样品以0.5ml/min上样，而后2ml/管分管支集.4）用15ml仄稳慢冲液洗去已吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管支集.5）用5 ml洗脱慢冲液洗去已吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管支集.6）再用5ml仄稳慢冲液仄稳柱子，灌谦20%乙醇，启关，以备下次使用.7）此要领是通用的要领，然而是一定能得到符合自己蛋黑的谦意效验，所以劣化的办法是洗脱不妨用50mM，100mM，300mM，500mM分阶段洗脱，各洗脱5个柱体积，那样协共电泳检测，得到符合自己的蛋黑的条件.8）支集的部分不妨用紫中分光光度法、BCA法大概用考玛斯明蓝法测定蛋黑的浓度，再与有蛋黑的部分电泳检测杂度.3．罕睹问题及办理要领1）蛋黑不溶解大概重淀正在柱子上：要注意慢冲液体的pH，别的表样品中增加一些表面活性剂以至乙醇等有机溶剂不妨减少疏火性蛋黑的溶解度，预防重淀.2）蛋黑不吸附：那是最罕睹的，常常的本果有1是标签不表露，被合叠正在蛋黑的结构内，不妨正在变性的条件下去杂化，2不妨采用效率力更强，配基稀度更下的挖料，常常镍琼脂糖凝胶效率力最强，如果蛋黑分子量大不妨采用脚臂少的挖料，如镍NTA琼脂糖凝胶，挖料的佳坏不妨瞅挖料的颜色，颜色越深那配基稀度越下，效率力也相映要强.3样品的pH过矮大概者重淀引导不克不迭吸附，所以样品战慢冲液的pH要尽管普遍，预防重淀，常常再偏偏碱性条件下吸附更佳.3）易洗脱：如果脱透中目标蛋黑明隐缩小，而洗脱又不，与面挖料加电泳慢冲液煮后离心跑电泳仍旧有目标蛋黑，不妨用更强的洗脱条件如500mM咪唑，如果还不克不迭洗脱，不妨曲交用500mM咪唑加到6M盐酸胍去洗脱.4）电泳杂戴多：果为那种亲战到底特同性要好面，本果正在蛋黑中戴组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等很罕睹，特天是蛋黑合叠会引导几个那样的氨基酸残基临近，那样也会使它们战镍柱的效率力减少，果此不妨用分歧浓度的咪唑阶段洗脱，别的表咪唑洗脱前减少一步0.5M pH5的醋酸慢冲液洗脱，正在仄稳慢冲液中增加0.5%吐温大概Triton不妨预防果为疏火相互效率引导非特同吸附，那样不妨电泳的杂戴明隐缩小，然而是如果用那样的要领仍旧杂戴多，那便天转头去瞅瞅破碎的条件是不是太剧烈大概者温度统造短佳引导蛋黑短裂大概者领会引导一些蛋黑片段戴标签，大概者果为样品万古间保存引导火解等，总之杂化的佳坏决断于每一个步调，不然而仅是杂化的问题.另有一个阻挡忽略的问题是偶尔间果为蛋黑相互效率大概者果为产生散合体引导杂戴减少，而由于疏火相互效率大概者果为离子效率不妨通过增加表面活性剂大概者减少离子强度得到革新，对付于果为产生散合体的不妨正在慢冲液战样品中加1-2mM巯基乙醇预防，如果那样的情况下最佳是采用镍NTA琼脂糖凝胶，果为它正在还本剂下更宁静.包涵体蛋黑的杂化及复性包涵体破碎1、大肠杆菌的破碎要领：１) 支集培植收酵液，4度7000-8000g离心10分钟，支集重淀的菌体(如果不是赶快破碎不妨搁-70度热冻，然而是最佳能保存成小块大概者薄片，那样佳用.２) 与1-2克菌体加10ml破碎慢冲液（pH8.5 50mM Tris-HCl，2mM EDTA，100mM NaCl，0.5% Triton X-100，1mg/ml溶菌酶.）正在冰上混同45分钟.３) 把混同菌体正在冰火中用超声探头破碎20秒种,总合四次,中间隔断要脆持2分钟热却破碎液,检测pH,如果不正在8.5,仍旧用1M Tris溶液一边搅拌一边滴加去调.如果菌体的为50-500克,不妨下压破碎的要领,慢冲液共上,体积为1降,破碎三次,压力为800 bar.４) 破碎的液4度12000g离心10分钟，如果要让溶液更澄浑，不妨4度50000g离心30分钟，那时间不妨把上浑战重淀分别留样，跑电泳，如果只重淀中有目标蛋黑，那便用变性条件下去提与.５) 破碎离心的重淀用4M荡涤包涵体，再离心得重淀加（pH7.4的50mM磷酸慢冲液含0.5M NaCl，8M脲，20mM咪唑）.过柱子的样品最佳过0.45μm的滤膜，预防堵柱.4．包涵体蛋黑的杂化1）仄稳慢冲液：pH7.4的50mM磷酸慢冲液含0.5M NaCl，8M 脲，20mM咪唑.2）洗脱慢冲液：pH7.4的50mM磷酸慢冲液含0.5M NaCl，8M脲，含500mM咪唑.3）与1ml镍琼脂糖凝胶FF大概镍NTA琼脂糖凝胶FF预拆柱，用10ml 仄稳慢冲液仄稳，而后与破碎上浑10ml样品以0.5ml/min 上样，而后2ml/管分管支集.4）用15ml仄稳慢冲液洗去已吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管支集.5）用5 ml洗脱慢冲液洗去已吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管支集.6）再用5ml仄稳慢冲液仄稳柱子，灌谦20%乙醇，启关，以备下次使用.7）此要领是通用的要领，然而是一定能得到符合自己蛋黑的谦意效验，所以劣化的办法是洗脱不妨用50mM，100mM，300mM，500mM分阶段洗脱，各洗脱5个柱体积，那样协共电泳检测，得到符合自己的蛋黑的条件.8）支集的部分不妨用紫中分光光度法、BCA法大概用考玛斯明蓝法测定蛋黑的浓度，再与有蛋黑的部分电泳检测杂度.9）其问题妥协决要领不妨参照可溶性蛋黑的杂化的相关真质.复性格中搀杂，所以修议参照文件战一些博门的叙述.罕睹问题及办理要领1）不溶解大概重淀正在柱子上：要注意慢冲液体的pH，别的表样品中增加一些表面活性剂以至乙醇等有机溶剂不妨减少疏火性蛋黑的溶解度，对付于戴半胱氨酸多的蛋黑很简单氧化汇集重淀，所以需要加2-5mM巯基乙醇预防重淀.2）黑不吸附：那是最罕睹的，常常的本果有1是标签不表露，被合叠正在蛋黑的结构内，不妨正在变性的条件下去杂化，如果用脲变性吸附短佳，不妨改用盐酸胍，部分体味是那样常常不妨使吸附不上的蛋黑得到革新，成功杂化.2不妨采用效率力更强，配基稀度更下的挖料，常常镍琼脂糖凝胶效率力最强，如果蛋黑分子量大不妨采用脚臂少的挖料，如镍NTA琼脂糖凝胶，挖料的佳坏不妨瞅挖料的颜色，颜色越深那配基稀度越下，效率力也相映要强.3样品的pH过矮大概者重淀引导不克不迭吸附，所以样品战慢冲液的pH要尽管普遍，预防重淀，常常再偏偏碱性条件下吸附更佳.3）易洗脱：如果脱透中目标蛋黑明隐缩小，而洗脱又不，与面挖料加电泳慢冲液煮后离心跑电泳仍旧有目标蛋黑，不妨用更强的洗脱条件如500mM咪唑，如果还不克不迭洗脱，不妨曲交用500mM咪唑加到6M盐酸胍去洗脱.4）电泳杂戴多：果为那种亲战到底特同性要好面，本果正在蛋黑中戴组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等很罕睹，特天是蛋黑合叠会引导几个那样的氨基酸残基临近，那样也会使它们战镍柱的效率力减少，果此不妨用分歧浓度的咪唑阶段洗脱，别的表咪唑洗脱前减少一步0.5M pH5的醋酸慢冲液洗脱，正在仄稳慢冲液中增加0.5%吐温大概Triton不妨预防果为疏火相互效率引导非特同吸附，那样不妨电泳的杂戴明隐缩小，然而是如果用那样的要领仍旧杂戴多，那便天转头去瞅瞅破碎的条件是不是太剧烈大概者温度统造短佳引导蛋黑短裂大概者领会引导一些蛋黑片段戴标签，大概者果为样品万古间保存引导火解等，总之杂化的佳坏决断于每一个步调，不然而仅是杂化的问题.另有一个阻挡忽略的问题是偶尔间果为蛋黑相互效率大概者果为产生散合体引导杂戴减少，而由于疏火相互效率大概者果为离子效率不妨通过增加表面活性剂大概者减少离子强度得到革新，对付于果为产生散合体的不妨正在慢冲液战样品中加1-2mM巯基乙醇预防，如果那样的情况下最佳是采用镍NTA琼脂糖凝胶，果为它正在还本剂下更宁静.。

蛋白纯化常见问题解析蛋白纯化是生物学实验中的关键环节，旨在从复杂的生物样本中分离和提纯出目标蛋白质。

然而，在蛋白纯化的过程中，研究人员常常会遇到各种问题和挑战。

这些问题可能源于样本的复杂性、蛋白质的特性，或是纯化技术的局限性。

为了成功地进行蛋白纯化，理解并解决这些常见问题至关重要。

下面是关于蛋白纯化的相关问题解析，希望对你有帮助：一、蛋白质的纯化技术有哪些？①沉淀法②电泳在克隆基因表达产物的检测分析过程中，电泳是常用的方法，但在纯化蛋白时，通常都不采用电泳的方法。

由于某些特殊的目的，需要用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化蛋白质，常用下述方法进行：①从电泳后的凝胶上切下所需的相应条带，将凝胶压碎，用缓冲液浸泡，使其中的蛋白质扩散出来，从而获得纯化的蛋白质。

此法简单但回收率低。

②将电泳后的凝胶用电洗脱的方法使蛋白质从凝胶转移到溶液中，从而达到纯化的目的。

此法快速，回收率高，但需要特殊的电泳装置。

③色谱法：色谱法（chromatography）是蛋白纯化中最常用的一种方法，这种方法既可以制备大量的纯化蛋白质，又可以保持蛋白质的生物学活性。

色谱的种类很多，可分为常规色谱和高效液相色谱（high-performance liquid chromatography,HPLC）。

凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱等均为常规色谱法。

HPLC包括反相高效液相色谱（reversed-phase HPLC,RP-HPLC）、离子交换高效液相色谱（ion exchange HPLC）等。

根据目标蛋白性质的不同可选用相应的色谱分离技术纯化蛋白质。

二、什么是最好的蛋白质纯化方法？常见的蛋白质纯化方法包括色谱法（如凝胶过滤、离子交换和亲和色谱）、电泳法（如SDS-PAGE和Native-PAGE）以及沉淀法（如盐析和有机溶剂沉淀）。

每种方法都有其独特的优缺点和适用范围。

例如，凝胶过滤色谱适用于大规模纯化，能够基于蛋白质的分子量进行分离；离子交换色谱则适用于根据蛋白质的电荷差异进行分离；而亲和色谱则特别适用于那些与特定配体有高亲和力的蛋白质。

蛋白质纯化常见问题及解决方案蛋白质纯化是生物化学研究中非常重要且常见的实验技术。

纯化蛋白质可以帮助科学家深入理解蛋白质的结构和功能，从而推动相关领域的研究进展。

然而，在进行蛋白质纯化的过程中，科学家们常常会遇到各种问题。

本文将介绍一些常见的问题，并提供解决方案，以帮助研究人员顺利进行蛋白质纯化实验。

常见问题一：蛋白质表达量太低在蛋白质纯化中，蛋白质的表达量是一个非常关键的因素。

然而，有时候我们会发现蛋白质的表达量过低，难以获得足够纯度的样品。

这可能有以下几个原因：1. 载体选择不当：选择适合的表达载体对蛋白质表达量有很大影响。

可以尝试使用高效表达载体，如pET系列载体，来提高蛋白质的表达量。

2. 菌株选择不当：不同菌株对蛋白质表达量有差异。

常用的菌株包括大肠杆菌（E.coli）和酵母菌等。

可以尝试不同菌株进行表达，找到最适合的菌株。

3. 条件优化不足：包括温度、培养基和诱导条件等。

合理优化这些条件有助于提高蛋白质的表达量。

解决方案：针对上述问题，可以尝试优化表达载体、菌株和条件，并进行系统的优化实验。

此外，还可以尝试使用其他表达系统，如哺乳动物细胞和昆虫细胞等。

常见问题二：蛋白质不稳定或易聚集蛋白质在纯化过程中可能会失去稳定性，因而导致降解、聚集或失活。

这种情况可能是由于多种因素造成的，例如温度、pH值、盐浓度和氧气等。

解决方案：对于易聚集和不稳定的蛋白质，可以采取以下一些措施：1. 降低温度：将温度降低到4℃以下，可以减缓蛋白质的降解和聚集速度。

2. 优化缓冲液：选择合适的缓冲液，并进行pH和离子强度的优化。

有时候添加一些辅助物质，如甘油、蔗糖或胰蛋白酶抑制剂，可以提高蛋白质的稳定性。

3. 使用小分子化合物：有时候可以加入一些小分子化合物，如L-辅酶A和聚氧乙烯醇等，来增强蛋白质的稳定性。

常见问题三：蛋白质纯化的污染蛋白质纯化过程中常常会伴随着各种污染物的存在，如其他蛋白质、核酸、有机化合物和盐等。

蛋白纯化实验常见问题精华解析本文主要介绍了蛋白纯化过程中常见的问题.内容选择方面恐存众不足，望指正。

1）我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST 亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。

请问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。

细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用GST做亲和层析，但效率只有50～60％左右。

洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀，我用0.5％CHAPS 助溶可勉强溶解部分，目的蛋白疏水性比较强。

既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性，同时保护你的蛋白，你再做纯化就可以了，我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000，这样的情况下蛋白还是活性回收率很高，我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好，你失去活性你可以监测一下提取，纯化，酶切到底哪里失去了活性，这样更容易解决你的问题。

还有注意缓冲液PH值，看看改变它对溶解度有没有影响。

蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点，这也是个办法。

2)请问楼主有没有合成过配体为FMN的亲和胶？我已经给你发了相关一些偶联的材料，请查收，现在一般要自己合成亲和填料，有很多公司都提供活化好的介质，自己偶联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂糖凝胶等，但是如果是小分子的配基最好选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好，此外也曾经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选择性有差别，因此你可以选择自己适合的活化介质。

不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求，所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选择合适的活化介质。

我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶，它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以，而且合成的介质刚性好，非特异吸附少，所以不需要特殊处理未反应基团。

His tag 和GST tag 融合蛋白的纯化原理
本文中，通过图片形象的描述着两种纯化的结合作用力，以及洗脱的原理。

希望通过对这些图片的说明，可以帮助了解实验的原理。

his- tag所用层析凝胶的基质上连接了一个NTA（[=nitrilotriacetic acid]氮基三乙酸），可以与Ni离子结合，而Ni离子与融合蛋白的6Xhis氨基酸之间产生如图的吸引力，从而将带有his-tag组氨酸标签的融合蛋白与其它蛋白区分开来。

从图中可以看到，组氨酸残基红色的五元咪唑环是蛋白与Ni离子作用的关键。

因此,当我们用高浓度的咪唑（imidazole）溶液洗脱的时侯（如250mM），咪唑便于蛋白质his-tag的咪唑环竞争结合，最终将融合蛋白从凝胶上洗脱下来。

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左图是用以纯化GST-tag融合蛋白的凝胶主要结构，凝胶手臂上通过硫键结合一个谷胱甘肽（如右图所示）。

GST-tag纯化的作用力在于谷胱甘肽与谷胱甘肽转移酶之间酶和底物的特异性的作用力。

凝胶上的手臂谷胱甘肽可以与GST-tag融合蛋白以这样的形式作用，从而将带标签的蛋白与其他蛋白分离开。

左图中中间红色的部分既为谷胱甘肽。

谷胱甘肽通常有氧化型GSSG和还原型GSH，当我们使用GSH洗脱时，GSH会与凝胶上的谷胱甘肽竞争结合融合蛋白，从而将目标蛋白洗脱。

组氨酸标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。

2．1IMAC(ImmobilizedMetal-ionaffinitychromatography)是Porathetal.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smithetal.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadexG-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。

同年1987年Hochulietal.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。

1986年Porathetal.还发现Fe3+-IDA-sephadexG-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。

市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：2.2影响IMAC纯化结果的因素：2.2.1填料的种类：不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。

His融合蛋白纯化常见问题解答蛋白过镍柱纯化的原理：Ni-NTA纯化介质纯化带有His6-Tag的融合蛋白是目前蛋白纯化中最常使用的一种方法。

Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有HIs(组蛋白)标签的碱性蛋白蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸(碱性氨基酸)。

在蛋白上样后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出。

Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍也可以与咪唑结合，采用咪唑洗脱，咪唑竞争性结合到硫酸镍上，目的蛋白就被洗脱了，这时候收集穿出液，里面就是目的蛋白，然后透析掉咪唑即可。

上样，清洗，洗脱，基本三个步骤就结束了。

1. His 标签蛋白没有与柱结合：a)可能原因：超声的功率不对(太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放)解决方法：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶b)可能原因：样品或者是结合缓冲液不正确：解决方法：检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份。

确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。

c)可能原因：组氨酸标签暴露不完全解决方法：在变性条件下( 用4-8 M 脲，或4-6 M 盐酸胍) 进行纯化。

d)可能原因：His标签丢失解决方法1：WB 检查His 是否表达，上游构建，改变His-tag 的位置(C-端或N-端)，必要时增加His个数。

解决方法2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。

解决方法3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。

Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数6×His标记的重组蛋白质的首选金属离子。

也是一般最常用的离子。

蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的pH，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用Ni2+。

2. His 标签蛋白没有被洗脱下来：a)可能原因：洗脱条件太温和(组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强)解决方法：增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。

蛋白纯化过程中的常见问题及解决策略1.杂蛋白去除在蛋白纯化的过程中，杂蛋白的去除是一个关键步骤。

杂蛋白的存在会干扰目标蛋白的纯度和质量。

通常，我们会使用各种色谱技术（如离子交换、疏水相互作用、凝胶过滤等）来进行杂蛋白的去除。

遇到问题时，可以尝试调整色谱条件，如改变缓冲液pH、离子强度、温度等，以达到更好的杂蛋白去除效果。

2.蛋白回收率低蛋白回收率低可能是由于目标蛋白在提取过程中损失，或者在纯化过程中的某些步骤中没有被完全回收。

为了提高蛋白回收率，可以尝试优化提取和纯化步骤，例如减少剧烈操作，避免过度离心和过滤,使用更温和的缓冲液等。

另外，也可以考虑使用更为高效的纯化方法,如免疫沉淀、标签亲和纯化等。

3.目标蛋白变性在纯化过程中，目标蛋白可能会出现变性，表现为蛋白质构象变化、聚合、沉淀等。

这可能是由于物理或化学因素（如温度、pH、离子强度等）导致的。

为了防止目标蛋白变性，需要密切关注这些因素，并尽量减少它们的变化。

同时，也可以考虑使用蛋白质稳定剂（如糖类、甘油等）来帮助稳定目标蛋白Q4.蛋白纯度不足蛋白纯度不足可能是由于纯化步骤不够完善，或者目标蛋白本身存在一定的杂质。

为了提高蛋白纯度，可以尝试优化纯化步骤，例如增加洗涤步骤、使用更高纯度的试剂等。

同时，也可以采用更为严谨的检测方法（如电泳、质谱等）来帮助评估蛋白纯度。

5.目标蛋白聚集在某些情况下，目标蛋白可能会在纯化过程中发生聚集。

这可能是由于目标蛋白的浓度过高、PH值不合适、金属离子浓度过高或者其他因素导致的。

为了防止目标蛋白聚集，可以尝试降低目标蛋白的浓度、调整PH值、去除金属离子等。

同时，也可以使用一些防止蛋白质聚集的试剂（如表面活性剂、蛋白质稳定剂等）。

6.目标蛋白活性丧失在纯化过程中，目标蛋白的活性可能会受到影响或者完全丧失。

这可能是由于物理或化学因素（如高温、有机溶剂、强酸碱等）导致的。

为了保护目标蛋白的活性，需要尽量减少这些不利因素的影响。