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pCMV-N-Flag产品编号 产品名称 包装 D2722-1µg pCMV-N-Flag 1µg D2722-100µgpCMV-N-Flag100µg产品简介：pCMV-N-Flag 是碧云天自行研发的用于在哺乳动物细胞中表达N 端和Flag tag (Flag 标签)融合的目的蛋白的表达质粒。
含有CMV 启动子可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达；在多克隆位点的5'端含有一个可以编码Flag 标签的序列，因此可以表达出含有Flag 标签的融合蛋白，可以方便地使用抗Flag 的抗体来识别目的蛋白，有利于目的蛋白检测和分离纯化。
质粒为卡那霉素抗性。
转染细胞后，可使用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。
pCMV-N-Flag 质粒的主要信息如下：Feature Nucleotide Position CMV promoter 1–602 T3 promoter and T3 primer binding site 620–639 Flag tag 679–702 multiple cloning site 705–778 T7 promoter and T7 primer binding site 821–842 SV40 polyA signal 854–1237 f1 origin of ss-DNA replication 1375–1681 bla promoter 1706–1830 SV40 promoter 1850–2188 neomycin/kanamycin resistance ORF 2223–3014 HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal 3015–3473 pUC origin 3602–4269 pCMV-N-Flag 质粒的图谱如下：碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线: 400-1683301或800-8283301 订货e-mail :******************技术咨询: *****************网址: 碧云天网站 微信公众号pCMV-N-Flag的多克隆位点的详细图谱如下：Flag tag __SacI M D Y K D D D D K651 GAGCTCCACC GCGGTGGCGG CCGCCATGGA TTACAAGGAT GACGACGATACTCGAGGTGG CGCCACCGCC GGCGGTACCT AATGTTCCTA CTGCTGCTATXmaI PstISmaI BamHI HindIII EcoRI EcoRV SalI BglII701 AGAGCCCGGG CGGATCCAAG CTTCTGCAGG AATTCGATAT CGTCGACAGATCTCGGGCCC GCCTAGGTTC GAAGACGTCC TTAAGCTATA GCAGCTGTCTXhoI XbaI ApaI751 TCTCTCGAGT CTAGAACTAG TGGGCCCGGT ACCTTAATTA ATTAAGGTACAGAGAGCTCA GATCTTGATC ACCCGGGCCA TGGAATTAAT TAATTCCATGpCMV-N-Flag中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pCMV-N-Flag)包括：Afl II Age I Ahd I Asc I Bbs I Bbv II Blp I Bsg I BsiW I BsmB I BspM II BsrG I BssH II Bst1107 I BstE II Ear I Eco47 III Eco72 I EcoN I Esp I Fse I Nru I PflM I Pme I Pml I PpuM I Psp1406 I Sap I Sca I Spl IpCMV-N-Flag中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pCMV-N-Flag once)包括：Nde I CA`TA,TG 241 SnaB I TAC|GTA 347 Nhe I G`CTAG,C 598 Sac I G,AGCT`C 656 Sac II CC,GC`GG 663 BstX I CCAN,NNNN`NTGG 664 Not I GC`GGCC,GC 669 PspA I C`CCGG,G 706 Xma I C`CCGG,G 706 Srf I GCCC|GGGC 708 Sma I CCC|GGG 708 BamH I G`GATC,C 713 Hind III A`AGCT,T 719 Pst I C,TGCA`G 729 EcoR I G`AATT,C 731 EcoR V GAT|ATC 739 Sal I G`TCGA,C 743 Acc I GT`MK,AC 744 Bgl II A`GATC,T 749 PaeR7 I C`TCGA,G 755 Xho I C`TCGA,G 755 Xba I T`CTAG,A 761 Spe I A`CTAG,T 767 Bsp120 I G`GGCC,C 773 Apa I G,GGCC`C 777 Pvu I CG,AT`CG 855 Bcl I T`GATC,A 1009 Mun I C`AATT,G 1102 Hpa I GTT|AAC 1115 Mlu I A`CGCG,T 1238 Dra III CAC,NNN`GTG 1468 Sfi I GGCCN,NNN`NGGCC 2127 BseR I GAGGAG 16/14 2170 Stu I AGG|CCT 2173 Cla I AT`CG,AT 2192 Kas I G`GCGC,C 2351 Nar I GG`CG,CC 2352 Ehe I GGC|GCC 2353 Bbe I G,GCGC`C 2355 Msc I TGG|CCA 2434 Tth111 I GACN`N,NGTC 2470 BsrD I GCAATG, 8 2585 Bsp1286 I G,DGCH`C 2655 Rsr II CG`GWC,CG 2868 BsiC I TT`CG,AA 3034 BstB I TT`CG,AA 3034 Bsa I GGTCTC 7/11 3341 HgiE II ACCNNNNNNGGT-1/13 3681 ApaL I G`TGCA,C 3956pCMV-N-Flag质粒中对于插入片段进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物T7的序列如下：T3 primer (620–639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'T7 primer (821-842): 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'pCMV-N-Flag的全序列信息请参考碧云天网站上该质粒的信息。
flag磁珠说明书Anti-Flag磁珠，也称Anti-Flag免疫磁珠或Flag抗体磁珠，是由高品质的Flag 小鼠单克隆抗体与纳米级氨基磁珠共价偶联而成，可特异性地与动植物或微生物裂解液、血清、腹水等中含有Flag标签的蛋白结合，从而用于带有Flag标签的融合蛋白或其蛋白复合物的免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)、免疫共沉淀(Co-IP)或纯化。
Flag标签(Flag-tag)、Myc标签(Myc-tag)、HA标签(HA-tag)、His标签(His-tag)和GST标签(GST-tag)等是表达载体上最常见的一些标签，通过与这些标签的融合表达可以非常方便地检测目的蛋白及与目的蛋白相互结合的蛋白，也可以非常方便地用于目的蛋白的纯化。
Flag-tag是8个氨基酸残基(DYKDDDDK)组成的多肽，常用的形式有Flag和3X Flag，通过基因重组技术把Flag-tag的核酸序列与目的基因的5’端或3’端连接，就可以最终表达形成Flag-tag的目的蛋白。
Flag-tag具有以下优点：Flag-tag通常不会与目的蛋白相互作用，并且大多数情况下不会影响目的蛋白的功能；Flag-tag作为标签蛋白，后续通过Flag抗体(AF519)、Anti-Flag磁珠或Anti-Flag亲和凝胶(P2271)即可对目的基因的表达、定位及功能进行检测或对目的蛋白进行纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等；融合在N端的Flag标签，可被肠激酶(Enterokinase, EK)切除(DDDK)，从而得到完美的没有标签的目的蛋白。
基于以上优点，Flag标签已被广泛应用于蛋白表达、纯化、鉴定、相互作用和功能等多方面的研究。
Anti-Flag Magnetic Beads (Anti-Flag磁珠)，也被称为Anti-DYKDDDDK Magnetic Beads，可以特异性地结合Flag标签融合蛋白，并可以借助磁力架等磁分离设备非常便捷地应用于带有Flag标签的融合蛋白或其蛋白复合物的免疫沉淀或纯化等实验。
F3290 Rev 02/221Product InformationFLAG ® PeptideF3290Storage Temperature 2-8 °CProduct DescriptionMolecular Weight: 1013.0Sequence: N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C (synthetic octapeptide)The FLAG ® Peptide is useful for the competitive elution of amino-terminal, Met-amino-terminal or carboxy-terminal FLAG ® fusion proteins from the ANTI-FLAG ® M1 or M2 monoclonal antibody in solution or bound to agarose gel. A workingconcentration of 100 µg/mL is commonly used toelute FLAG ® fusion proteins from the ANTI-FLAG ® M1 and M2 affinity resins.2-4 Five one-column volumes of the working solution are sufficient to elute most FLAG ® fusion proteins.Various publications have used the FLAG ® Peptide (Cat. No. F3290) at other concentrations, which we have not necessarily tested, such as: • 150 µg/mL 5 • 200 µg/mL 6 • 250 µg/mL 7 • 300 µg/mL 8,9•0.5 mg/mL (500 µg/mL)10The FLAG ® Peptide will not elute 3X FLAG ® fusion proteins. For this application, use the 3X FLAG ® Peptide (Cat. No. F4799).Precautions and DisclaimerFor research use only. Not for drug, household, or other uses. Please consult the Safety Data Sheet for information regarding hazards and safe handling practices.Preparation InstructionsTo prepare a stock solution, dissolve in TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) to a finalconcentration of 5 mg/mL. Aliquot and store at −20 °C. Repeated freezing and thawing is not recommended.Storage/StabilityStore the lyophilized powder at 2-8 °C. Afterreconstitution, aliquot and store at −20 °C. Repeated freezing and thawing is not recommended.ProcedureElution of FLAG ® Fusion Proteins by Competition with FLAG ® Peptide: Elute the bound FLAG ® fusion protein from the ANTI-FLAG ® M1 or M2 affinity resin bycompetitive elution with five one-column volumes of a solution containing 100 µg/mL FLAG ® peptide in TBS.References1. Brizzard, B.L. et al ., BioTechniques , 16(4):730-735 (1994). 2. Antonysamy, S. et al ., Proc. Nat. Acad. Sci. USA ,109(44): 17960-17965 (2012). 3. He, J. et al ., Nucleic Acids Res ., 40(13):6097-6108 (2012). 4. Singh, O. et al ., Protein Sci ., 22(8):1071-1077 (2013). 5. Li, W. et al ., Mol. Cell. Biol ., 36(22):2855-2866 (2016). 6. Cheng, F. et al ., Mol. Immunol ., 60(1):44-53 (2014). 7. Singh, G. et al ., Methods , 65(3):320-332 (2014). 8. Meller, N. et al ., J. Biol. Chem ., 279(36):37470-37476 (2004). 9. Aguado, L.C. et al ., Nature , 547(7661):114-117 (2017). 10. Simsek, D. et al ., Cell , 169(6):1051-1065.18 (2017).The life science business of Merck operatesas MilliporeSigma in the U.S. and Canada.Merck and Sigma-Aldrich are trademarks of Merck KGaA, Darmstadt, Germany or its affiliates.All other trademarks are the property of their respective owners. Detailed information on trademarks is available via publicly accessible resources.© 2022 Merck KGaA, Darmstadt, Germany and/or its affiliates. All Rights Reserved.F3290 Rev 02/22 2NoticeWe provide information and advice to our customers on application technologies and regulatory matters to the best of our knowledge and ability, but without obligation or liability. Existing laws and regulations are to be observed in all cases by our customers. This also applies in respect to any rights of third parties. Our information and advice do not relieve our customers of their own responsibility for checking the suitability of our products for the envisaged purpose. The information in this document is subject to change without notice and should not be construed as a commitment by the manufacturing or selling entity, or an affiliate. We assume no responsibility for any errors that may appear in this document. Technical AssistanceVisit the tech service page at/techservice.Standard WarrantyThe applicable warranty for the products listed in this publication may be found at /terms. Contact InformationFor the location of the office nearest you, go to /offices.。
Anti-GFP亲和凝胶Cat#：IP0057（本品仅用于科学研究，不可用于诊断及治疗）1.背景信息GFP，绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)，来源于维多利亚多管发光水母，由约238个氨基酸组成，从蓝光到紫外线都能使其激发出绿色萤光。
GFP常用于真核蛋白质重组表达标记。
Anti -GFP亲和凝胶，由高品质的GFP鼠单克隆抗体与Sepharose 4B琼脂糖颗粒共价偶联制成，具有高载量（至少为1.2mg protein/ml凝胶），高特异性，性质稳定，可反复使用的特点，可用于GFP标签融合蛋白的免疫（共）沉淀检测。
2.性能指标应用范围：可用于N端GFP融合蛋白（GFP–Protein）和C端GFP融合蛋白（Protein-GFP）的免疫（共）沉淀。
载量：1ml Sepharose 4B琼脂糖颗粒，共价偶联800μg Anti-GFP 鼠单克隆抗体，可沉淀至少1.2mg GFP融合蛋白。
成分：共价偶联Anti-GFP 鼠单克隆抗体的Sepharose 4B琼脂糖颗粒, 1ml溶于2ml PBS+50%甘油中。
保存方法：在加入了50%甘油和0.2‰叠氮钠的PBS保存液中，-20℃可保存1年。
3.使用方法3.1细胞裂解液制备3.1.1悬浮细胞和半贴壁细胞从细胞培养瓶上吹下来后放入离心管中，1000rpm离心5分钟。
贴壁细胞用细胞刮子轻轻从瓶壁上刮下来，放入离心管中1000rpm离心5分钟。
3.1.2预冷的PBS(pH7.2)重悬细胞，1000rpm离心3min，弃上清。
重复一次。
3.1.3根据细胞的量加入相应体积的细胞裂解液（推荐配方见5.3），反复吹打后冰上放置10-20min，让细胞充分裂解。
3.1.4用超声破碎仪将细胞裂解液超声，直至细胞裂解液透明，不再粘稠。
冰上放置30min之后，12000rpm，4℃离心10min。
取上清，冷冻保存。
3.2装柱及孵育3.2.1根据使用目的选用重力柱或离心管，移入适量亲和凝胶。
产品名: FLAG tag Peptide 修订日期: 6/30/2016产品说明书化学性质产品名:FLAG tag Peptide Cas No.:98849-88-8 分子量:1012.97 分子式:C41H60N10O20 别名:H-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-As p-Lys-OH 化学名:FLAG Peptide SMILES: C1=CC(=CC=C1CC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CC(=O)O)C(=O)NC(CC(=O)O)C(=O)NC(CC(=O)O)C(=O)NC(CC(=O)O)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)O)NC(=O)C(CC(=O)O)N)O溶解性: >50.6mg/mL in DMSO储存条件: Desiccate at -20°C一般建议: For obtaining a higher solubility , please warm the tube at 37°Cand shake it in the ultrasonic bath for a while.Stock solution can bestored below -20°C for several months.运输条件:Evaluation sample solution : ship with blue iceAll other available size: ship with RT , or blue ice upon request生物活性靶点 :Tag Peptides 信号通路:产品描述:FLAG 标签肽（FLAG tag Peptide ）是一个含有肠激酶酶切位点的8肽（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ），专门用于免疫亲和层析。
FLAG 标签肽融合系统主要用于蛋白鉴定与纯化。
蛋白纯化试剂盒介绍试剂盒有10个重力流柱，而该柱在自然条件下纯化可重新装填Ni-IDA Sefinose TM 6 Fast Flow 和结合缓冲液，洗脱液。
这10个柱子通过固定化金属亲和层析可用于纯化带组氨酸标签的蛋白。
Ni-IDA Sefinose 6 Fast Flow 有很高的蛋白结合能力，低镍离子（Ni2 +）的泄漏以及可与变性剂和广泛的添加剂相兼容。
澄清和非澄清的样品可使用该柱。
特殊的frits 在纯化过程可防止介质变干燥。
一次纯化平均需要30分钟。
在变性下纯化，请自备额外的结合缓冲液和洗脱液。
特征柱材料聚丙烯桶，聚乙烯筛板介质Ni-IDA Sefinose 6 Fast Flow平均粒径90 µm蛋白结合能力约6 mg组氨酸标签蛋白/1毫升树脂床体积 1 mL/柱使用时兼容性在各种通用缓冲液，洗涤剂和变性剂中稳定避免在缓冲液中含螯合剂，例如EDTA，EGTA，柠檬酸等pH稳定性，短期（2h）2-14储存20%乙醇保存温度4或30℃与NI-IDA树脂相兼容的试剂还原试剂5 mmol/L DTE(二硫赤藓糖醇)5 mmol/L DTT(二硫苏糖醇)20 mmol/L β-巯基乙醇5 mmol/L TCEP(磷酸三氯乙酯)10 mmol/L 还原型谷胱甘肽变性剂8 mol/L尿素6 mol/L 盐酸胍洗涤剂2% TritonX-100(非离子物质)2% Tween 20（非离子物质）2% NP-40 (非离子物质)2% 胆酸盐1% CHAPS（两性离子）其他添加剂20% 乙醇50% 甘油100 mmol/L Na2SO41.5 mol/L NaCl1 mmol/L EDTA60 mmol/L柠檬酸盐100 mmol/L 磷酸钠，pH 7.4 缓冲液100 mmol/L Tris-HCl pH 7.4100 mmol/L Tris pH 7.4100 mmol/L HEPES pH 7.4100 mmol/L MOPS pH 7.4100 mmol/L 醋酸钠pH 4注意：1.为了最佳的操作过程，按照上述纯化步骤进行预洗以除去任何削弱结合镍离子的物质。
蛋白纯化试剂盒介绍试剂盒有10个重力流柱，而该柱在自然条件下纯化可重新装填Ni-IDA Sefinose TM 6 Fast Flow 和结合缓冲液，洗脱液。
这10个柱子通过固定化金属亲和层析可用于纯化带组氨酸标签的蛋白。
Ni-IDA Sefinose 6 Fast Flow 有很高的蛋白结合能力，低镍离子（Ni2 +）的泄漏以及可与变性剂和广泛的添加剂相兼容。
澄清和非澄清的样品可使用该柱。
特殊的frits 在纯化过程可防止介质变干燥。
一次纯化平均需要30分钟。
在变性下纯化，请自备额外的结合缓冲液和洗脱液。
特征柱材料聚丙烯桶，聚乙烯筛板介质Ni-IDA Sefinose 6 Fast Flow平均粒径90 µm蛋白结合能力约6 mg组氨酸标签蛋白/1毫升树脂床体积 1 mL/柱使用时兼容性在各种通用缓冲液，洗涤剂和变性剂中稳定避免在缓冲液中含螯合剂，例如EDTA，EGTA，柠檬酸等pH稳定性，短期（2h）2-14储存20%乙醇保存温度4或30℃与NI-IDA树脂相兼容的试剂还原试剂5 mmol/L DTE(二硫赤藓糖醇)5 mmol/L DTT(二硫苏糖醇)20 mmol/L β-巯基乙醇5 mmol/L TCEP(磷酸三氯乙酯)10 mmol/L 还原型谷胱甘肽变性剂8 mol/L尿素6 mol/L 盐酸胍洗涤剂2% TritonX-100(非离子物质)2% Tween 20（非离子物质）2% NP-40 (非离子物质)2% 胆酸盐1% CHAPS（两性离子）其他添加剂20% 乙醇50% 甘油100 mmol/L Na2SO41.5 mol/L NaCl1 mmol/L EDTA60 mmol/L柠檬酸盐100 mmol/L 磷酸钠，pH 7.4 缓冲液100 mmol/L Tris-HCl pH 7.4100 mmol/L Tris pH 7.4100 mmol/L HEPES pH 7.4100 mmol/L MOPS pH 7.4100 mmol/L 醋酸钠pH 4注意：1.为了最佳的操作过程，按照上述纯化步骤进行预洗以除去任何削弱结合镍离子的物质。
亲和纯化是一种常见的生物化学技术，用于从复杂混合物中纯化特定的生物大分子，比如蛋白质、DNA或RNA等。
而 anti-flag 亲和纯化就是利用与Flag标签结合的抗体进行纯化的一种方法。
本文将为您介绍 anti-flag 亲和纯化凝胶纯化纳微的相关知识和技术原理。
一、anti-flag 亲和纯化的原理1.1 Flag 技术的概念Flag 标签是一种广泛应用于蛋白质生物化学和细胞生物学研究中的蛋白质标记技术。
它是一种八个氨基酸残基的片段，可以与抗Flag抗体特异性结合，在一系列生物学实验中得到了广泛应用。
1.2 anti-flag 亲和纯化的原理anti-flag 亲和纯化是利用特异性结合于Flag标签的抗体，将Flag标记的蛋白从混合物中纯化出来的一种技术方法。
该方法利用了抗体与抗原结合的高亲和性，使得目标蛋白可以在保持其生物活性的情况下被特异性地纯化。
二、anti-flag 亲和纯化凝胶纯化纳微的步骤2.1 样品制备首先需要准备包含Flag标记蛋白的混合物样品，该样品可以是原核或真核细胞的裂解液，也可以是细胞培养上清中的蛋白混合物。
2.2 抗体固定将抗Flag抗体固定在凝胶上，使其形成亲和纯化凝胶。
2.3 样品加载将样品加载到亲和纯化凝胶柱中，使其中的Flag标记蛋白与固定的抗体结合。
2.4 洗脱步骤通过洗脱步骤，去除非特异性结合蛋白和杂质。
2.5 Elution 步骤通过适当的条件，比如改变 pH 或者添加特定的化合物，使得所需的Flag标记蛋白脱离抗体从而得到纯净的目标蛋白。
三、anti-flag 亲和纯化凝胶纯化纳微的应用3.1 蛋白纯化anti-flag 亲和纯化凝胶纯化纳微常用于蛋白质的纯化，尤其是对于标记有Flag tag 的蛋白质。
3.2 细胞信号通路研究在细胞信号通路研究中，常常需要对Flag标记的蛋白进行纯化，以进行其生物学功能的研究。
3.3 转基因动物研究在转基因技术中，为了对转基因蛋白进行研究，需要将其从复杂细胞组分中纯化出来，而anti-flag 亲和纯化凝胶纯化纳微则提供了一种高效、特异性的方法。
心型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)酶联免疫分析试剂盒预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中心型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)含量。
实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗h-FABP抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗h-FABP抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。
TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的h-FABP呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板：一块（96孔）2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为150 ng/ml，请先稀释至30 ng/ml，再做系列倍比稀释(注：不要直接在板中进行倍比稀释)后，分别稀释成30 ng/ml，15 ng/ml，7.5 ng/ml，3.75 ng/ml，1.88 ng/ml，0.94 ng/ml，0.47 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。
如配制15 ng/ml标准品：取0.5ml (不要少于0.5ml )30 ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3. 样品稀释液：1×20ml。
4. 检测稀释液A：1×10ml。
5. 检测稀释液B：1×10ml。
6. 检测溶液A：1×120μl（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100μl/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。
如10μl 检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
7. 检测溶液B：1×120μl/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B 1:100稀释。
FLAG标签（DYKDDDDK）融合蛋白纯化试剂盒
Cat#：KAP0064
（本品仅用于科学研究，不可用于诊断及治疗）
1.背景信息
Flag-Tag（DYKDDDDK），常用于真核蛋白质重组表达标记。
FLAG标签（DYKDDDDK）融合蛋白纯化试剂盒，主要成分是Anti-Flag亲和纯化凝胶（Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel），由高品质的Flag兔多克隆抗体与Sepharose 4B琼脂糖颗粒共价偶联制成，具有高载量（至少为1.2mg protein/ml凝胶），高特异性，性质稳定，可反复使用的特点，可用于Flag 标签融合蛋白的亲和纯化。
2.性能指标
应用范围：可用于Met修饰的N端Flag融合蛋白（Met-Flag–Protein），N端Flag融合蛋白（Flag–Protein）和C端Flag融合蛋白（Protein-Flag）的亲和纯化。
载量：1ml Sepharose 4B琼脂糖颗粒，共价偶联800μg Anti-Flag 兔多克隆抗体，可纯化至少1.2mg Flag融合蛋白。
强度：重力柱纯化，可反复使用5次以上。
保存方法：在加入了50%甘油和0.2‰叠氮钠的PBS保存液后，预装纯化柱可于-20℃可保存1年。
3.试剂盒组成
50 mM Tris HCl, pH 7.4, 150 mM
NaCl, 1 mM EDTA, and 1%
Triton X-100（说明见5.3）
4.使用方法
4.1细胞裂解液制备
4.1.1悬浮细胞和半贴壁细胞从细胞培养瓶上吹下来后放入离心管中，
1000rpm离心5分钟。
贴壁细胞用细胞刮子轻轻从瓶壁上刮下来，放入离
心管中1000rpm离心5分钟。
4.1.2预冷的PBS工作液重悬细胞，1000rpm离心3min，弃上清。
重复一次。
4.1.3根据细胞的量加入相应体积的细胞裂解液，反复吹打后冰上放置
10-20min，让细胞充分裂解。
4.1.4用超声破碎仪将细胞裂解液超声，直至细胞裂解液透明，不再粘稠。
冰上
放置30min之后，12000rpm，4℃离心10min。
取上清，冷冻保存。
4.2装柱及孵育
4.2.110ml（10倍柱体积）PBS清洗Anti-Flag亲和纯化柱。
4.2.2加入含有目标蛋白的真核细胞裂解液，室温孵育或者4℃孵育过夜。
4.2.3根据蛋白质性质选择洗脱方法，具体可参见第5部分问题和建议
5.1。
4.33xFlag peptide洗脱液竞争洗脱
4.3.1用1xPBS配制3×Flag peptide洗脱液，终浓度为100μg/ml。
4.3.2加入10ml 3×Flag peptide洗脱液（10倍柱体积）进行洗脱，每次收集
1ml。
4.3.3用紫外检测仪测定收集液, 合并收集液。
4.3.4SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度及浓度，并按照需求处理和保存蛋白质。
4.4酸性洗脱液酸性洗脱
4.4.15ml PBS（5倍柱体积）洗柱三次。
4.4.2预冷的5ml pH
5.0酸性预洗液（5倍柱体积）洗涤纯化柱，除去非特异性
结合蛋白。
4.4.3预冷的10ml pH 3.0的酸性洗脱液（10倍柱体积）进行洗脱，每次收集
1ml, 收集管中预先放入中和液50μl。
注意：酸性环境放置太久会缩短亲和
纯化柱的使用寿命，应尽量缩短亲和纯化柱与酸性洗脱液的接触时间。
4.4.4用紫外检测仪测定收集峰, 合并收集峰。
4.4.5SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度及浓度，并按照需求处理和保存蛋白质。
4.5纯化柱的清洗与再生（洗脱后须立即进行纯化柱的清洗与再生）
4.5.110倍柱体积PBS清洗纯化柱。
4.5.2酸性洗脱液（pH3.0）洗涤纯化柱，每次三倍柱体积。
4.5.3中和液（pH8.0）洗涤柱子三次，每次三倍柱体积。
4.5.4检测流穿液pH，如为中性，则进行下一步；如仍为酸性，则重复4.5.2和
4.5.3。
4.5.5用1xPBS（含50%甘油，0.2‰叠氮钠）清洗，再加入适量该保存溶液至
填料中，保存在20℃。
4.6保存
纯化产物加入50%甘油保存在-80度，用于后续功能性实验。
5.问题与建议
5.1如何选择竞争性洗脱和酸性洗脱？
3×Flag peptide洗脱液与蛋白质上的Flag标签竞争亲和纯化柱上的抗体，使蛋白质与抗体的结合被取代而脱离纯化柱，从而被洗脱下来。
这种洗脱的特点有：
5.1.1洗脱条件温和，一般不会造成蛋白质变性；有利于亲和纯化柱的保存和反复
使用。
5.1.2由于亲和吸附达到平衡比较慢，所以往往需要较常的时间和较大的洗脱体积。
5.1.3特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。
基本上不会有anti-Flag的抗体被洗脱下来。
酸性洗脱是通过改变环境pH，破坏抗原抗体的结合从而使蛋白质脱离纯化柱被洗脱下来，这种洗脱方式的特点有：
5.1.4成本低廉。
5.1.5纯化速度较快。
5.1.6酸性pH会造成部分蛋白质变性，引起目的蛋白质沉淀，降解或失活。
5.1.7有时会有少部分Anti-Flag抗体被洗脱，造成非特异性信号。
5.1.8反复使用酸性洗脱，会造成抗体脱落，也会破坏纯化柱的理化性质，减少纯
化柱的反复使用次数。
5.1.9有文献显示，与传统的Glycine-HCl洗脱液相比，本试剂盒提供的pH3.0
的Arginine-HCl做为洗脱液，可以减少蛋白质变性，延长抗体亲和纯化柱的
使用寿命。
客户可以根据实际情况自行选用配制。
5.2常见的蛋白质的后续处理方法有哪些？
5.2.1透析与超滤
透析法是利用半膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离
心，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜而蛋白留在超滤管内。
两者都可
以达到换液的目的。
使用时需注意选择正确分子量的透析袋和超滤管。
5.2.2过滤除菌
可采用微孔滤膜滤器操作，让蛋白质溶液通过0.22um滤膜，即可达到除菌
的目的。
5.2.3蛋白质定量鉴定浓度。
5.2.4SDS-PAGE鉴定纯度。
5.3如何选择细胞/组织裂解液？
本试剂盒提供的细胞裂解液成分如下：
Nacl 150mM
Tris-HCL(PH8.0) 50 mM
TRITON X-100 1%
EDTA 1mM
使用前可加入1%PMSF和0.5%原钒酸钠, 或其他蛋白酶抑制剂，避免蛋白质降
解。
客户可根据目的蛋白的性质和后继用途，自行配制细胞裂解液及选择是否加入蛋白酶抑制剂。
6.使用中的常见问题
来源出处：武汉戴安生物技术有限公司。
