蛋白质融合表达的标签及切割研究

蛋⽩质表达中质粒上TEV酶切位点的设计与应⽤⼀、引⾔蛋⽩质表达是⽣物学研究中重要的技术⼿段之⼀，其中质粒作为外源基因的携带者，在蛋⽩质表达过程中发挥着关键作⽤。

TEV酶（Tobacco Etch Virus protease）作为⼀种常⽤的切割酶，被⼴泛应⽤于蛋⽩质表达系统中，能够在特定的氨基酸序列识别并切割蛋⽩质，为蛋⽩质纯化和功能研究提供了便利。

⼆、TEV酶切割位点的设计原则在质粒构建中，合理设计TEV酶切割位点⾄关重要。

设计TEV酶切割位点时应考虑以下原则：1. 特异性：选择在⽬标蛋⽩质序列中唯⼀存在的TEV酶切割位点，以避免⾮特异性切割导致的副产物。

2. 保留原⽣氨基酸序列：尽可能选择不影响⽬标蛋⽩质结构和功能的TEV酶切割位点，以确保切割后蛋⽩质仍能够正确折叠和发挥作⽤。

3. 免疫原性：避免选择可能引起免疫原性问题的TEV酶切割位点，以减少可能的影响。

三、TEV酶切割在蛋⽩质表达中的应⽤TEV酶切割在蛋⽩质表达中具有⼴泛的应⽤价值：1. 蛋⽩质纯化：TEV酶可以⾼效地切割融合标签，如His标签、GST标签等，从⽽实现对⽬标蛋⽩质的纯化。

2. 蛋⽩质亲和性纯化：利⽤TEV酶切割蛋⽩质与亲和树脂之间的连接，实现⾼纯度的蛋⽩质亲和纯化。

3. 结构研究：TEV酶切割可以⽤于去除蛋⽩质表达体系中的融合标签，以进⾏蛋⽩质结构和功能的研究。

4. 功能研究：通过TEV酶切割产⽣⽆标签的⽬标蛋⽩质，⽤于功能鉴定和活性分析。

四、实验步骤1. 质粒构建：在⽬标蛋⽩质的N-末端或C-末端引⼊包含TEV酶切割位点的多肽序列，如ENLYFQG。

2. 蛋⽩质表达：将质粒转化⾄表达宿主中，经过诱导表达⽬标蛋⽩质。

3. 蛋⽩质纯化：利⽤亲和树脂纯化体系，如Ni-NTA亲和层析，纯化蛋⽩质融合标签形式。

4. TEV酶切割：应⽤TEV酶切割蛋⽩质与融合标签之间的连接，获取⽆标签的⽬标蛋⽩质。

5. 切割后处理：通过适当的层析技术去除TEV酶和融合标签，获得纯净的⽬标蛋⽩质。

融合蛋白的作用与应用蛋白质是生命体中重要的组成部分，因此蛋白质的合成和研究一直是生物科学的热门领域。

在这个领域里，融合蛋白技术因其独特的作用和广泛的应用而备受关注。

本文章将重点介绍融合蛋白技术在生物科学研究中的作用和应用。

融合蛋白是一种人工合成的蛋白质，它是由两个或多个不同蛋白质的基因融合而成的。

融合蛋白通常由一个标签和一个目标蛋白组成。

标签可以是荧光蛋白、酶标签、His-标签等。

融合标签可以帮助研究人员追踪蛋白质的存在、位置和运动。

目标蛋白可以是任何感兴趣的蛋白质，例如转录因子、激酶、酶等。

融合蛋白技术的主要作用是实现表达和纯化目标蛋白质。

传统的表达和纯化方法通常需要在目标蛋白质中添加一些化学物质或结构，这样会影响到蛋白质的本来结构和功能。

而融合蛋白技术使得目标蛋白质可以在不添加任何结构和化学物质的情况下得到表达和纯化。

因此，融合蛋白技术可以保证目标蛋白质的结构和功能完整，从而更好的进行生物学研究。

融合蛋白技术还可以用于标记和可视化蛋白质，以便于对其进行追踪和定位。

这项技术可以帮助研究人员研究蛋白质在细胞内的运动和交互，并且提供一种高效、准确的方法来定位和证实蛋白质相互作用的位置和方式。

融合蛋白技术还可以用于对药物与蛋白相互作用进行研究，这样可以更好的理解药物的作用机理并开发更加高效、准确的药物。

例如，研究人员可以制备融合蛋白并将其融入药物。

然后，他们可以研究药物对融合蛋白的影响，从而了解药物如何与蛋白相互作用。

融合蛋白技术还可以用于优化蛋白表达和纯化方案。

蛋白表达和纯化通常是一项复杂的任务，但是融合蛋白技术可以使其更加容易。

通过使用融合蛋白来表达和纯化目标蛋白，可以使表达和纯化此目标蛋白变得更加容易和高效。

总而言之，融合蛋白技术在生物科学研究中具有广泛的应用，可以实现表达和纯化目标蛋白、标记和可视化蛋白、研究药物与蛋白相互作用和优化蛋白表达和纯化方案。

随着蛋白质研究的不断深入，融合蛋白技术将会发挥更多的作用和应用。

蛋白表达载体系统重组蛋白表达技术和重组蛋白表达载体现已广泛应用于生物学各个具体领域,尤其是体内功能研究和蛋白质的大规模生产。

GeneCopoeia的蛋白表达载体按照表达宿主的不同分为3类:B类，M类和Lv 类。

B类的表达宿主为大肠杆菌，M类的宿主为哺乳动物细胞，Lv类是慢病毒载体，宿主可以为哺乳动物细胞或原代细胞。

除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将各类载体按荧光蛋白标签、多功能标签、促溶解度标签和抗体免疫共沉淀标签四种，先将几种主流的标签功能初步介绍如下：eGFP/eCFP/eYFP/mCherry分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白标签,具有不同的激发波长和发射波长，均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来。

就eGFP而言，相对于GFP，其荧光强度更强、荧光性质更稳定。

同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

mCherry是从DsRed演化来的性能最好的一个单体红色荧光蛋白，可以和GFP系列荧光蛋白共用，实现多色标记体内、外实验表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白时，荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响。

这些荧光标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：1.不用破碎组织细胞、不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。

2.其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。

3.同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测效果更快速、简便、灵敏度高而且重现性好。

4.其低消耗、高灵敏度检测的特性，十分适用于高通量的药物筛选。

现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。

融合标签技术及其应用摘要：融合标签技术是一种基于报告基因的重组DNA技术，融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化、固定及检测更加快速、简便，并很快得到了应用。

关键词：融合标签技术；重组蛋白；应用融合标签技术是20世纪末兴起的一种基因重组技术，其主要过程是利用重组DNA技术在靶蛋白编码基因的3’端或5’端融合某种标签的编码基因，通过适宜的宿主来表达重组蛋白质[1]，表达的重组蛋白质可以通过融合的标签与包被在固相基质上的特异配基结合而进行纯化。

融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便。

近几年，随着新的融合标签系统的开发，其功能逐渐多样化，除用于蛋白质纯化外，还用于蛋白质定位和检测等。

1 融合标签的种类融合标签根据其分子量大小可分为两大类：大的蛋白质分子（或蛋白质结构域及其衍生物）和小的多肽片段。

大的蛋白质标签有GST（谷胱甘肽巯基转移酶）、SPA（葡萄球菌蛋白A）和GFP（绿色荧光蛋白）等，它的使用会增加目标蛋白的溶解性，但在蛋白结晶和抗体产生等过程中，标签必须去除。

小的多肽标签有6×His（六聚组氨酸）、HA（流感病毒血凝素表位）、c-myc（人c-myc蛋白表位）、FLAG（专为蛋白纯化和检测设计的八肽）等，多数情况下，由于多肽标签相对较小，对融合蛋白质结构影响小，不需要从融合蛋白质中切除，因而多肽标签较蛋白质标签更为常用。

迄今为止，已有文献较为详尽地报道了各种融合标签[2]，其大小从几个氨基酸到蛋白质不等，相互作用类型包括酶与底物，细菌受体与血清蛋白，六聚组氨酸与金属离子，抗原与抗体等[3]，表1-1列出了目前报道较多的标签融合系统。

2融合标签技术的应用2.1用于蛋白的纯化。

融合标签技术用于重组蛋白质纯化已为大量实验所证实[4]。

理论上，根据亲和纯化原理可定向设计使目标蛋白质与纯化基质之间不发生任何直接相互作用的融合标签，以避免由于这种直接相互作用造成蛋白质变性。

目前已有许多不同的标签可供利用。

1 .1多聚精氨酸-标签(Arg-tag)精氨酸-标签通常由5或6个精氨酸组成.它已被成功用作细菌C末端标签,精氨酸是碱性最强的氨基酸,带5个精氨酸标签的蛋白质可以结合到阳离子交换树脂SP-Sephadex上, 而大部分杂蛋白不结合.结合后,带标签的蛋白质在碱性pH下运行线性NaCl梯度洗脱得到.当C末端为疏水性区域时,多聚精氨酸可能影响蛋白质的三级结构.氨酸残基的C末端序列可用羧肽酶B处理去除.这一酶促处理已被成功用于一些例子,但常常由于低的切割得率或者在期望的蛋白质序列间发生不必要的切割而受到限制.然而精氨酸标签并不常用,与第二标签联用是很有趣的蛋白质纯化工具.1．2 多聚组氨酸-标签(His-tag)已广泛采用的方法是利用固定化金属螯合层析纯化带有由多聚组氨酸残基组成的一个短的亲和标签的重组蛋白质.固定化金属螯合层析的基础是固定在基质上的过渡态金属离子(Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+)与特定的氨基酸侧链之间的相互作用.组氨酸是与固定化金属离子作用最强的氨基酸,组氨酸的咪唑环作为电子供体容易与固定的金属离子形成配位键.基质材料洗涤之后,可通过调节柱缓冲液的pH或者添加游离咪唑洗脱含多聚氨基酸序列的肽类。

虽然在变性条件下系统对于带6个组氨酸标签的蛋白质纯化有效,带3个组氨酸标签的蛋白质在生理条件下可有效纯化.然而带6个组氨酸标签的蛋白质可以在天然条件下,在低或高浓度盐的缓冲液中结合到Ni2+-NTA 基质上.结合后,目标蛋白可用0.8到250 mM咪唑梯度洗脱.低浓度的咪唑(如0.8 mM)可减少带有组氨酸的宿主蛋白质的非专一吸附.6个组氨酸标签的蛋白质可用20到250mM咪唑浓度范围洗脱. 使用咪唑的缺点是咪唑的存在经常导致蛋白质的聚集.另一种用于纯化多聚组氨酸标签蛋白质的材料是TALON.这由Co2+-羧甲基天冬氨酸(Co2+-CMA)组成,并偶联到固相的树脂上.TALON使得标签蛋白在温和条件下洗脱,已有报导与Ni2+-NTA树脂相比,其非特异性蛋白结合更少,从而达到更高的洗脱产物纯度.一种酶制剂通过SDS-PAGE鉴定的纯度高于95%.1.3 谷胱甘肽S-转移酶-标签1988年首次描述了融合有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的多肽的一步纯化.来自日本血吸虫(schisto soma japonicum),26-kDa的 GST被克隆在大肠杆菌表达载体中.融合蛋白可从未经处理的裂解液中用固定化的谷胱甘肽亲和层析加以纯化.结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱..GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测.标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性.在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的.推荐采用位点专一的蛋白酶如凝血酶或Xa因子从融合蛋白切除GST标签.蛋白酶解后,GST载体和蛋白酶通过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析去除.GST标签可位于N端或C端,可用于细菌,酵母,哺乳细胞, 和杆状病毒感染的昆虫细胞. GST融合蛋白已成为分子生物学家的基本工具.1.4 Strep-标签(Strep-tag)Strep-标签是一氨基酸肽开发来用于在链球菌抗生物素蛋白(streptavidin)柱上亲和纯化相应的融合蛋白.链球菌抗生物素蛋白(streptavidin)在特定位点第44, 45, 和47位的突变体与天然形式相比,对八肽Strep-tag II的亲和力更强,.Strep标签的蛋白质在生理缓冲液条件下结合到生物素结合区域中,并可用生物素衍生物温和洗脱.洗脱时推荐使用2.5 mM脱硫生物素.基质可以用4-羟基-偶氮苯-2-羧酸再生,这种物质在溶液中呈黄色,当结合到基质上则呈红色.结合条件是非常专一的.生物素化的蛋白质如大肠杆菌的羧基载体蛋白可以结合,但生物素或者生物素化的蛋白质则用抗生物素封闭.纯化条件是多种多样的.螯合剂,温和性去污剂,还原型去污剂,和高达1M的盐可以加到缓冲液中. Strep-标签系统适合用于研究蛋白质之间的相互作用以及当那些大的标签或者带电荷的标签无效时的特殊用途.1.5 S-标签S-标签是个融合肽标签可以通过快速灵敏的均匀分析或者在Western blot中用比色法加以检测.该系统的基础是15个氨基酸残基的S-tag与103氨基酸残基的S-蛋白质之间的强烈相互作用,这两个都来自RNaseA.S-蛋白质/S-标签复合物的Kd接近0.1μM,这取决于pH,温度和离子强度.标签由4个带正电荷残基,3个负电荷残基,3个不带电的极性残基和5个非极性残基组成.这使S -标签保持可溶.S-标签的快速分析是基于核酸降解活力的恢复.标签蛋白可以结合到S蛋白质基质上.洗脱条件较苛刻,如pH2.0的缓冲液.然而为了获得有功能的蛋白质推荐用蛋白酶切割标签.该系统可用于纯化的重组蛋白质来源包括细菌,哺乳细胞和杆状病毒感染的昆虫细胞抽提物.该系统经常与第二标签联用.RNase酶A高度灵敏的荧光底物的发现使得该系统可用于与高通量筛选联用的检测.2. 融合蛋白的切割为了对目的蛋白进行生化及功能分析，通常要从目的蛋白上去除fusion tag部分。

融合蛋白的分离纯化原理融合蛋白是指在外源表达系统中，将感兴趣的蛋白与另一个蛋白（通常具有较好的抗体或标签）融合在一起，以便在后续的蛋白分离和纯化过程中更容易识别和纯化。

以下是由融合蛋白的分离纯化原理所组成的详细解释。

1. 蛋白融合表达系统的构建和优势：融合蛋白的表达系统通常包括重组蛋白的DNA序列，它融合了目标蛋白和另一种中间蛋白（常被称为融合标签）。

通过将DNA序列导入到合适的宿主细胞中，在细胞中进行表达和产生融合蛋白。

融合蛋白具有以下优势：- 提高目标蛋白的产量和稳定性；- 改善目标蛋白的溶解和可溶性；- 方便蛋白纯化和检测。

2. 常见的融合标签：常见的融合标签包括：- 多希（histidine tag）：这是最常用的标签，由6个连续的组氨酸残基组成。

利用多希标签可以简便地将融合蛋白通过亲和层析柱进行结合和纯化，例如金属螯合层析；- 谷氨酸蛋白酶切位点（glutathione S-transferase cleavage site, GST tag）：GST标签可以用于纯化融合蛋白，它可以通过谷氨酸蛋白酶进行特异性切割，从而分离目标蛋白；- 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP tag）：GFP标签可以通过荧光显微镜直接检测融合蛋白，从而评估目标蛋白的表达和定位情况。

3. 整细胞和亲和层析柱的纯化方法：对于融合蛋白的纯化，可以采用整细胞和亲和层析柱的方法。

整细胞的纯化方法是将目标融合蛋白在细胞中产生，并通过裂解细胞膜和核膜释放蛋白。

然后，通过高速离心将裂解物中的纤维蛋白、DNA和RNA沉淀，获得上清液。

接下来，可以通过盐析沉淀、超滤或浓缩来富集目标蛋白。

亲和层析是利用融合蛋白与特定配体的结合来纯化蛋白。

例如，使用多希标签可以通过金属螯合层析柱选择性地结合多希蛋白，并通过改变洗脱缓冲液的组成来分离并收集目标蛋白。

4. 蛋白纯化的后续步骤：蛋白纯化的后续步骤通常包括：- 目标蛋白的浓缩和洗脱：通过离心、超滤或吸附到凝胶等方法去除污染物，从而富集目标蛋白；- 蛋白质的测定和定性：通过比色法、荧光法或质谱等方法确定目标蛋白的含量和纯度；- 蛋白质的保存和储存：通过冻干、冷冻或加入保护剂等方法保持蛋白的活性和稳定性。

重组蛋白融合标签及对应的酶切酶一、概述重组蛋白是一种人工合成的蛋白质，通常用于生物技术和药物研发领域。

在研究和应用中，为了更好地研究和分析重组蛋白，通常需要在其N端或C端连接不同的标签，以便于对其进行纯化、检测和定位等操作。

而对于大多数重组蛋白而言，酶切酶是一个重要的工具，它可以通过切割特定的肽键来去除标签或实现蛋白质的精确裁剪。

重组蛋白融合标签及对应的酶切酶是重要的研究话题。

二、重组蛋白融合标签1. His标签His标签是一种常用的重组蛋白融合标签，它通常由6个组氨酸构成，其序列为His-His-His-His-His-His。

这种标签能够与金属离子亲和层析柱上的镍离子结合，便于对融合蛋白进行纯化。

常用的His标签融合蛋白包括His-tag、GST-His-tag等。

对应的酶切酶包括Thrombin、Enterokinase等，可以在需要的时候精确切割掉His标签。

2. FLAG标签FLAG标签是另一种常用的重组蛋白融合标签，它是一个八肽序列，其序列为DYKDDDDK。

FLAG标签常用于蛋白质检测和免疫印迹等分析中。

常用的FLAG标签融合蛋白包括pET21a-FLAG、CMV-FLAG等。

对应的酶切酶为Enterokinase等，可实现对FLAG标签的精确切割。

3. GFP标签GFP标签是一种表达在绿色荧光蛋白上的重组蛋白融合标签，其序列与GFP蛋白的序列相同，能够使融合蛋白在荧光显微镜下直接观察到。

常用的GFP标签融合蛋白包括pGFP、pGFP-V-RS等。

对应的酶切酶为Bgl II等。

4. HA标签HA标签是一种可溶酶敏感的蛋白质标签，其序列为YPYDVPDYA。

HA标签常用于蛋白质的免疫检测、纯化等。

对应的酶切酶为Enterokinase等。

5. Myc标签Myc标签是另一种常用的重组蛋白融合标签，其序列为EQKLISEEDL。

Myc标签常用于免疫印迹、免疫沉淀等研究中。

对应的酶切酶为Enterokinase等。

融合标签技术在蛋白质研究中的应用摘要近年来，越来越多的科学家开始运用一种被称为融合标签的技术来研究蛋白质。

融合标签技术的快速发展给蛋白的快速纯化带来了福音。

本文主要介绍一些常用融合标签的原理、优缺点以及它们在蛋白质研究中的应用，并讨论了融合标签对蛋白研究产生的深远影响。

关键词蛋白质融合标签蛋白纯化前言蛋白质相互作用存在于每个细胞的新陈代谢过程中。

围绕着中心法则，我们可以发现，DNA复制、转录、逆转录、翻译等少不了蛋白质的参与，而且在细胞的信号转导，细胞死亡和凋亡等生命活动中，蛋白质的相互作用也都发挥了核心作用。

对蛋白质的研究，催生了结构生物学的蓬勃发展，而且，蛋白质相互作用的研究也成为了蛋白质研究不可或缺的一部分[1]。

利用蛋白质表达技术，快速、简便地进行有关活性代谢产物的高效表达而研究蛋白质生物学功能和理化性质成为一种很好的研究方法。

其中融合蛋白表达技术由于容易实现高效表达、纯化，兼有步骤简便、产物多以活性形式存在等优点，在蛋白质研究中得到了广泛的应用[2]。

蛋白融合即在蛋白序列上加上蛋白标签。

蛋白标签是指利用DNA重组技术与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或蛋白质，以便于目的蛋白的表达、检测以及纯化[3]。

该技术的原理是通过基因操作技术，将目的基因片段与某些特定的蛋白标签串联，插入适当的载体中进行表达。

这些特定的基因因为带有标签，能够与特殊的介质进行亲和层析，使特定的蛋白能够纯化出来。

得到的融合蛋白还可以通过使用化学物质或者酶类的特定反应切除标签，从而得到纯化的目的蛋白，用于结晶或者特定功能研究。

常用的融合蛋白主要包括多聚组氨酸标记、硫氧还原蛋白、谷胱甘肽S-硫转移酶（GST）、融合了八个氨基酸的亲水性多肽、麦芽糖结合蛋白等。

根据其分子量大小，可将之分为两类：小的多肽标签，包括FLAG、His6（六聚组氨酸）、c-myc（人c-myc蛋白表位）、HA（流感病毒血凝素表面抗原决定簇）等；大的蛋白标签，包括SPA（葡萄球菌蛋白A）、GST（谷胱甘肽巯基转移酶）和GFP （绿色荧光蛋白）等。