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菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握菠萝蛋白酶的提取和纯化方法2、研究菠萝蛋白酶的稳定性3、掌握菠萝蛋白酶的化学修饰并对修饰酶与未修饰酶的活性比较二、实验原理菠萝蛋白酶（Bromelain,EC 3.4.22.3）是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，分子量约为33000D，等电点为9.55，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。
水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白质，肽，酯，酰胺。
它的水解蛋白的活性比木瓜蛋白酶的活性高十倍以上，因此有着广泛的用途。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、明胶、水解蛋白酶的生产。
在医药上它可用于生物体内溶解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
菠萝蛋白酶的最适温度范围比较稳定，最稳定范围是55℃~65℃。
菠萝蛋白酶的最适 pH 在 7.1 左右，呈现中性。
金属盐离子中 NaCl、KCl 对酶活的影响不是很大，较高浓度的MgCl2、CaCl2对菠萝蛋白酶单宁复合物有一定程度的抑制作用，尤其在浓度较高的情况下对菠萝蛋白游离酶酶活的影响更大。
Zn2+的作用中以醋酸锌的作用更为显著，极低的浓度即能促使菠萝蛋白酶的酶活性明显提高。
较低浓度的 ZnCl2也能使酶的稳定性有所提高。
维生素 C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，都能使酶分子中巯基基团维持还原态，能够作为还原剂来提高酶活力。
0.05%的苯甲酸钠即能使氧化脱氢酶的活性得到抑制，对酶起到保护作用。
对酶活有影响的金属离子，EDTA 能通过螯合而保护菠萝蛋白酶，消除其对酶的失活作用。
其它试剂如 50%的甘油、葡萄糖、 40%的半乳糖都能使菠萝蛋白酶的半衰期延长，蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、松三糖、乙二醇和甘露醇均对菠萝蛋白酶有一定的保护作用。
糖蛋白的提取分离纯化与表征摘要：糖蛋白是由寡糖链与多肽链共价连接而成的一类结合蛋白质，是一类重要的生物大分子，在生物体内占有重要地位。
本文综述了糖蛋白的分类、分离纯化及纯度鉴定方法研究，并介绍了某些糖蛋白的生理活性，对糖蛋白的开发利用具有借鉴作用。
关键词：糖蛋白，提取，分离纯化，纯度鉴定，生物活性1 糖蛋白的简介1.1糖蛋白的定义糖蛋白是由小于15个单糖单位的寡糖链与蛋白质以共价键连构成的复合分子，在组成上以蛋白质为主。
与其他大分子相比，糖蛋白的定义一直比较模糊，直至1908年美国生物化学家协会首次将糖蛋白定义为：由蛋白质分子和除核酸外的含有碳水化合物基团的物质共同组成的复合物(compounds of the protein molecules with a substance or substances containing acarbohydrate group,other than nucleic acid)(Montreuil et a1.,1995)。
糖含量在不同糖蛋白中差别较为明显，通常情况下，总糖含量占蛋白重量的1％-60％不等，举几个例子：胶原蛋白含糖量一般不到1％，免疫球蛋白G低于4％，人红细胞膜的血型糖蛋白含糖量在54％左右。
随着糖和蛋白复合物领域研究的逐步深入，研究者将蛋白聚糖和糖蛋白区别开来，糖蛋白专指由比较短(通常不会超过15个单糖单位)、通常情况下具有多个分支的寡糖链与多肤链以共价键相连接的，含量上以蛋白为主的复合物；而蛋白聚糖在组成上以糖为主，且其糖链类型和连接方式均与糖蛋白有区别。
近年来，糖蛋白的研究成为多门学科的研究前沿领域。
相关研究者在医药学、生物化学、细胞生物学、免疫学以及食品科学领域都渗透进了糖蛋白的相关研究。
1.2糖蛋白的分类及分布糖蛋白的主要由糖链和肽链两大部分构成。
构成糖蛋白的单糖主要有(陈惠黎主编，1997)：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、N-乙酞葡萄糖胺、以及糖醛酸等。
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。
关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。
1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
辣椒素的提取、纯化及其测定方法的优化研究的开
题报告
一、研究背景及意义
辣椒素是一种特殊的植物成分，具有辛辣味和辣椒的特有香味，具
有改善食欲和增强新陈代谢的功效。
在医学应用方面，辣椒素是一种非
常重要的药物成分，能够刺激神经末梢、增强血流、降低血压等等。
因此，辣椒素以及其衍生物的提取、纯化及其测定方法的优化研究，对于
食品、药品等行业具有非常重要的意义。
二、研究内容
1. 辣椒素的提取与分离
利用超声波提取、萃取、酶解等方法，优化提取辣椒素的条件，以
及与其他杂质的分离方法。
2. 辣椒素的纯化及分析
利用高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等分析技术对提取物中的
辣椒素进行分离与纯化，并对其进行定量分析。
3. 辣椒素测定方法的优化与比较
对于提取、纯化后的辣椒素样品，采用HPLC、GC等方法进行检测，并选择最适宜的测定方法。
三、研究方法
1. 对提取辣椒素的方法进行优化，探究最佳条件
在实验室进行超声波提取、萃取、酶解等方法的试验，比较不同条
件的处理效果。
2. 对提取物进行分离、纯化和分析
利用正己烷、乙腈、乙酸乙酯等溶剂进行分离和纯化，以HPLC、
GC等方法分析提取物的组成成分。
3. 对辣椒素测定方法进行比较
优选提取和分离纯化后的物质作为标准品，对多种测定方法进行比对，并选择最适合的方法。
四、研究预期成果
本项研究将对辣椒素的提取、纯化和测定方法进行优化与改进，建
立一套可行的测定体系，为辣椒素的产业化生产提供技术支持，为食品、药品等行业提供产品质量保证。
食品科学现代农业科技2019年第1期不同提取方法提取辣椒及其制品中DNA效果研究罗阿东I陆邹红$蔡秋I王艳I曹云恒I陈霄IC贵阳海关，贵州贵阳550081；彳贵州医科大学)摘要采用CTAB法、SDS法、吸附柱法对辣椒及其制品中的基因组DNA进行提取，分别通过核酸蛋白测定仪、琼脂糖凝胶电泳、实时荧光PCR扩增检测。
结果表明,CTAB法、SDS法、吸附柱法均能从鲜辣椒、干辣椒、油辣椒、辣椒酱中抽提得到DNA,从核酸蛋白测定仪检测得到的DNA提取物ODMOD^o值可看出，CTAB法和SDS法提取的DNA纯度较吸附柱法的低；DNA样品的琼脂糖凝胶电泳发现，各样品均无大范围明显拖尾，说明DNA提取完整度较好；实时荧光PCR检测分析3种提取方法的不同样品基因组DNA均出现PCR扩增曲线。
经试验比较确定，提取方法的效率由高到低依次为吸附柱法〉SDS法＞CTAB法。
可见，吸附柱法最适用于辣椒及其制品中核酸提取。
关键词辣椒及其制品；DNA提取；CTAB法；SDS法；DNA吸附柱中图分类号S641.3文献标识码A文章编号1007-5739(2019)01-0212-02Study on Effect of Different Extraction Methods on DNA Extraction from Chilli and Its Products LUO A-dong1LU Zou-hong2CAI Qiu1WANG Yan1CAO Yun-heng1CHEN Xiao1('Guizhou Customs,Guiyang Guizhou550081；2Guizhou Medical University)Abstract CTAB, SDS and DNA adsorption column method were adopted to extract DNA from chilli and its products.Nucleic acidprotein detector method,agarose gel electrophoresis method and real-time fluorescence PCR amplification methods were applied to measure the DNA samples.The results showed that DNA could be extracted by CTAB,SDS and adsorption column from chilli and its products.lt could be seen from the OD/OD^value of DNA extract by nucleic acid protein detector,the concentration of DNA extracted by CTAB and SDS was lower than that by adsorption column.Agarose gel electrophoresis measurement showed DNA extracted with3methods there was no obvious tail smearing in all areas,the results showed that DNA had better extraction integrity.The PCR amplification curve of genomic DNA of3different extraction methods was detected by real-time fluor-escence PCR. Through experiment and comparison,it was determined that the efficiency of the extraction method was as following:adsoq)tion column method>SDS method>CTAB method.In summary,the adsorption column method is the most suitable for extracting nucleic acid from chilli and its products.Key words chilli and its products；DNA extraction；CTAB method；SDS method；DNA adsorption column辣椒是人们生活中必不可少的蔬菜作物，具有药理、经济、食用、营养等方面的价值。
螺旋霉素药渣中蛋白质的分离提取
赵宏樵;朱旗;韩晓娟;沈志伟
【期刊名称】《科技通报》
【年(卷),期】1999(15)2
【摘要】螺旋霉素药渣是制药工业的废弃物．本研究采用化学和生物化学方法，经酸、碱、盐和酶等水解分离，从药渣中提取蛋白质，对每种反应剂，利用正交设计试验，确定其最佳化学反应剂及分离方法．试验结果证明，蛋白质的平均溶出率为：酶法为５１．３７ｇ／Ｌ，碱法为４５．００ｇ／Ｌ，酸法为２９．４５ｇ／Ｌ，盐溶法为２３．９０ｇ／Ｌ．蛋白质平均提取率为：酶法为６０．７７％，碱法为４８．７５％，酸法为２４．１６％，盐溶法为２５．５９％．
【总页数】6页(P131-136)
【关键词】蛋白质;废渣;螺旋霉素;分离;提取;制药工业
【作者】赵宏樵;朱旗;韩晓娟;沈志伟
【作者单位】国家海洋局第二海洋研究所;杭州中美华东制药有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】X789.05
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Advances in Marine Sciences 海洋科学前沿, 2014, 1, 1-8Published Online September 2014 in Hans. /journal/ams/10.12677/ams.2014.11001Study on Extraction, Isolation, Purificationand Physical Chemistry Properties of theGlycoprotein from Thais clavigera KusterHejun Cai, Feifei Ge, Bim Yu, Pan Zhao, Youle Qu*College of Food and Pharmaceutical Science, Zhejiang Ocean University, ZhoushanEmail: *youle1960@Received: Jul. 11th, 2014; revised: Jul. 26th, 2014; accepted: Aug. 4th, 2014Copyright © 2014 by authors and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY)./licenses/by/4.0/AbstractPurpose: This paper studied on extraction, isolation and purification as well as physical chemistry properties of the Glycoprotein from Thais clavigera Kuster. Method: The crude extract was then fractionated with 3 concentrations of ammonium sulfate solution. LGP-1, LGP-2, LGP-3, LGP-4 were prepared from the crude through DEAE-cellulose. LGP-I, LGP-II, LGP-III, LGP-IV, LGP-V, LGP-VI, LGP-VII were prepared through Sephadex G-100 chromatography. Result: The results showed that three glycoprotein components were carried out from 40% grade ammonium sul-phate precipitation, named LGP-I, LGP-II, LGP-III. Three peaks appeared for 60%s, named LGP-IV, LGP-V and LGP-VI. The sugar were 17.86%, 20.00%, 13.14%, 21.57%, and the contents of protein were 56.72%, 62.58%, 71.86%, 60.86%. The IR indicated glycoprotein groups contained −OH, −COO−, −NH, −C−O−C characteristics.KeywordsThais Clavigera Kuster, Glycoprotein, Isolation and Purification, Characterization辣螺糖蛋白的提取、分离纯化及理化性质分析蔡和君，葛飞飞，俞斌，赵盼，曲有乐*浙江海洋学院食品与药学学院，舟山*通讯作者。
Email: *youle1960@收稿日期：2014年7月11日；修回日期：2014年7月26日；录用日期：2014年8月4日摘要目的: 对辣螺中的糖蛋白进行分离纯化，并分析其理化性质。
方法: 采用缓冲溶液低温提取辣螺中的糖蛋白，以硫酸铵对糖蛋白粗提液进行梯度分级沉淀，各级组分经DEAE-52阴离子交换柱分离、纯化，得到的糖蛋白命名为LGP-1, LGP-2, LGP-3, LGP-4，再经Sephadex G-100层析纯化，得到的糖蛋白命名为LGP-Ⅰ, LGP-Ⅱ, LGP-Ⅲ, LGP-Ⅳ, LGP-Ⅴ, LGP-Ⅵ, LGP-Ⅶ。
结果: 40%级硫酸铵沉淀得到3种糖蛋白组分(LGP-Ⅰ, LGP-Ⅱ, LGP-Ⅲ)。
60%级酸铵沉淀得到3个糖蛋白组分(LGP-Ⅳ, LGP-Ⅴ, LGP-Ⅵ)。
总糖含量17.86%、20.00%、13.14%、21.57%，蛋白质含量56.72%、62.58%、71.86%、60.86%。
结论: IR 分析表明，各组分均含有多糖的−OH、−COO−、−NH、−C−O−C等特征基团。
关键词辣螺；糖蛋白；分离纯化；性质1. 引言辣螺，学名疣荔枝螺(Thais clavigera Kuster)，含有丰富的糖蛋白，在我国南北沿岸及舟山各岛屿沿岸均有分布，为岩相潮间带最习见螺类之一。
目前已有研究证实海洋软体动物——海兔、虾夷扇贝和文蛤中的糖蛋白具有明显的抑瘤作用[1]-[3]。
关于牡蛎提取液具有抗氧化作用[4] [5]，栉孔扇贝[6]和管角螺[7]等中提取的糖蛋白具有显著的抗肿瘤与增强免疫力的活性之类的研究更是引起了广泛的关注。
糖蛋白是指由比较短，往往带分支的寡糖链上的羟基与多肽某些特殊部位的羟基或酰基形成肽键的一类有侧链的复杂大分子物质，在自然界广泛存在于动物、植物和某些微生物中，在生物体内它以不同的形式存在而发挥作用，是细胞膜、细胞间基质、血浆、粘液、激素等的重要构成成分[8]-[10]。
现在对海洋软体动物中提取糖蛋白的生物活性研究较多，但对辣螺糖蛋白的研究较少。
本研究只要利用阴离子交换柱、凝胶层析柱分析辣螺糖蛋白的组成，以分离纯化辣螺糖蛋白。
2. 实验部分2.1. 材料与仪器2.1.1. 材料与试剂新鲜辣螺(图1)，购于舟山市南珍菜市场；透析袋(34, MW:3000)，天津市纽森科技有限公司；DEAE- 52纤维素，Whatman公司；Sephadex G-100，Pharmacia公司；考马斯亮蓝R250，美国Fluka公司；磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，硫酸铵，氯化钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。
2.1.2. 仪器日本日立CR21G冷冻离心机；BT1-100恒流泵，上海琪特分析仪器有限公司；FD-1000冷冻干燥机，上海爱朗仪器有限公司(东京理化器械(株)独资工厂)；JJ-2组织捣碎机，上海梅香仪器有限公司；华凌BCD-199HC，中国雪櫃實業有限公司；BSA323S电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；UV-1100Figure 1.Thais clavigera Kuster图1.辣螺紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；Nicolet-6700付立叶红外光谱分析仪，森井电机株式会社(香港)；YP-2固体压片机，上海山岳科学仪器有限公司；WS70-1红外线快速干燥器，上海锦屏仪器有限公司通州分公。
2.2. 实验方法2.2.1. 辣螺糖蛋白的提取辣螺螺肉匀浆→冷冻保藏→解冻→加缓冲溶液浸提→4℃离心→过滤→糖蛋白粗提液→硫酸铵分级沉淀，使浸提液中硫酸铵浓度分别达到30%，60%，100%三个级别→4℃离心→收集清夜透析→冷冻干燥→DEAE-52阴离子交换层析→收集洗脱液冷冻干燥→Sephadex G-100凝胶过滤层析→收集洗脱液冷冻干燥2.2.2. 辣螺糖蛋白的分离DEAE-52离子交换层析柱，分别用蒸馏水、0.1 mol/L、0.5 mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为1.7 mL/min。
分管收集，逐管分别用苯酚–硫酸法和紫外分光光度法检测糖和蛋白的紫外吸收情况。
收集单一峰组分(合并糖和蛋白洗脱曲线的重合峰位)，冷冻干燥。
2.2.3. 辣螺糖蛋白的纯化(改法同上)Sephadex G-100凝胶过滤层析柱(25 mm × 100 cm)，用蒸馏水洗脱，流速为1.7 mL/min，每管收集5 ml，逐管分别用苯酚-硫酸法和紫外分光光度法检测糖和蛋白的紫外吸收情况。
收集单一峰组分(合并糖和蛋白洗脱曲线的重合峰位)，冷冻干燥。
2.2.4. 总糖含量的测定采用苯酚-硫酸法，以蒸馏水做空白对照，以干燥后的葡萄糖在0~140 μg/ml范围内作准标准曲线，测其总糖含量。
2.2.5. 蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法，用抗体作为标准蛋白，在20 ug~150 ug/100 ul之间绘制标准曲线。
根据标准曲线计算待测样本的浓度。
2.2.6. 辣螺糖蛋白的红外光谱测定取样品1 mg，用KBr压片，测定红外光谱，扫描范围4000~400 cm−1。
3. 结果与分析3.1. 辣螺糖蛋白的提取分离及其纯化辣螺匀浆200 g经缓冲溶液浸提、硫酸铵分级沉淀、透析、冷冻干燥得到3组不同的粗糖蛋白，命分别名为LGP-a，LGP-b，LGP-c，分别为15.78 g，7.83 g，0.23 g。
3.2. DEAE-52阴离子交换柱层析分离辣螺糖蛋白经过翻阅大量的参考文献，本实验选择蒸馏水、0.1 mol/L、0.5 mol/L的NaCl溶液进行连续梯度洗脱，每个浓度洗脱30支试管。
将辣螺糖蛋白LGP-a，LGP-b，LGP-c按上述方法分别进行洗脱，洗脱结果如图2~图4所示：透析后的3个级别硫酸铵沉淀辣螺粗糖蛋白液经阴离子交换柱DEAE-52，用蒸馏水(试管号1-30)、0.1 mol/L(试管号31~60)、0.5 mol/L(试管号61~90)的NaCl溶液进行连续梯度洗脱，辣螺糖蛋白得到较好的分离。
分离的糖蛋白组成结果由图1~图3所示，280 nm蛋白质吸收峰主要有5个，其中40%级硫酸铵沉淀粗糖蛋白有2个峰，分别是LGP-1和LGP-2；60%级硫酸铵沉淀粗糖蛋白有2个峰，分别是LGP-3和LGP-4，LGP-3所得量极少；100%级硫酸铵沉淀粗糖蛋白有1个峰，为LGP-5(该组糖蛋白所得量极少)，用苯酚-硫酸法在490 nm下和考马斯亮蓝法在280 nm下检测，其总糖含量为14.74%，蛋白质含量为Figure 2. The separated results of LGP-a from Thais clavigera Kuster DEAE-52-ceUulose图2. 辣螺糖蛋白LGP-a在DEAE-52上的洗脱Figure 3. The separated results of LGP-b from Thais clavigera Kuster DEAE-52-ceUulose图3. 辣螺糖LGP-b在DEAE-52上的洗脱62.99%。
