基于Gateway技术的表达载体构建

同尾酶结合gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法同尾酶结合gateway克隆技术是一种高效的基因克隆方法，已被广泛应用于多基因表达载体的构建。

本文介绍了采用同尾酶结合gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法。

首先，设计含有多个目的基因的PCR引物，使其末端含有同一限制酶切位点。

使用这些引物分别扩增目的基因，并将其纯化后进行限制酶切。

接下来，将经过限制酶切的基因片段与同尾酶切割后的基因载体连接，构建同尾酶结合的基因载体。

然后，将所得的基因载体与gateway载体进行LR反应，得到多基因表达载体。

最后，将多基因表达载体转化到目标表达宿主中进行表达。

利用同尾酶结合gateway克隆技术，可以高效地构建含有多个目的基因的表达载体，为分子生物学研究提供了更为有效的工具。

- 1 -。

gateway构建载体原理Gateway（网关）是将多个网络连接在一起的设备，它可以在不同的网络之间传输数据。

在计算机网络中，网关是连接两个网络的节点。

它可以是硬件设备或软件服务，负责转发数据包，使得不同网络中的数据能够互相通信。

网关的构建载体原理是通过将多个网络接口连接在一起，实现不同网络之间的数据传输。

网关通常具备路由器的功能，可以根据目标网络的地址将数据包转发到相应的网络。

它还可以执行网络地址转换（NAT）的功能，将私有网络地址转换为公共网络地址，实现内部网络与外部网络的互联。

网关的构建可以基于不同的协议和技术，常见的有以下几种载体原理：1. 路由器：路由器是一种常见的网关设备，它可以连接不同的网络，并根据网络地址的转发表将数据包转发到目标网络。

路由器可以根据网络的拓扑结构和路由协议来选择最佳的路径，以实现数据的快速传输。

2. 防火墙：防火墙是一种网络安全设备，可以用作网关来保护内部网络免受外部网络的攻击。

防火墙可以检查和过滤进出网络的数据流量，阻止潜在的威胁和攻击。

同时，防火墙也可以实现网络地址转换，隐藏内部网络的真实地址，增加网络的安全性。

3. 代理服务器：代理服务器也可以作为网关设备使用，它可以拦截客户端和服务器之间的通信，并代表客户端发送请求。

代理服务器可以缓存常用的资源，减少网络流量和加快响应速度。

此外，代理服务器还可以过滤和控制进出网络的数据流量，提高网络的安全性。

4. VPN网关：VPN（虚拟私有网络）网关是一种将远程网络连接到私有网络的设备。

它可以通过加密和隧道技术，创建一个安全的连接，使远程用户能够访问私有网络中的资源。

VPN网关可以通过认证和加密来保护数据的安全性，实现远程访问和远程办公。

5. 负载均衡器：负载均衡器是一种用于分发网络流量的设备，可以将流量均匀分配给多个服务器，提高系统的性能和可靠性。

负载均衡器可以作为网关设备使用，将客户端的请求转发到最适合处理的服务器上，实现请求的快速响应和服务器资源的有效利用。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911062021.5(22)申请日 2019.11.01(71)申请人 西北农林科技大学地址 712100 陕西省咸阳市杨凌示范区邰城路3号(72)发明人 管清美　牛春东　曹富国　施焕然　陈鹏翔　(74)专利代理机构 西安长和专利代理有限公司61227代理人 何畏(51)Int.Cl.C12N 15/66(2006.01)C12Q 1/6876(2018.01)C12N 15/11(2006.01)C12N 15/82(2006.01)A01H 5/12(2018.01)A01H 6/82(2018.01) (54)发明名称Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用(57)摘要本发明属于生物技术和植物基因工程技术领域，公开了一种Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用，所述Gateway克隆系统的植物表达载体分别为P K G M Y C ，P K N Y F P 和PKCYFP；PKGMYC的序列为SEQ ID NO：1；PKNYFP的序列为SEQ ID NO：2；PKCYFP的序列为SEQ IDNO：3。

本发明以pK7GWIWG2D(II),0或pK2GW7为骨架，这两个载体分别使用SacI/KpnI和SacI/PmeI核酸内切酶进行双酶切；通过同源重组技术将其他Gateway系列载体构建入这两个载体，形成以卡那霉素为筛选标记的植物表达载体；同时，pK7GWIWG2D(II),0为骨架的改造载体还具有非融合的GFP荧光蛋白筛选标记。

权利要求书2页 说明书7页序列表14页 附图10页CN 110904137 A 2020.03.24C N 110904137A1.一种Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法以pK7GWIWG2D(II)或pK2GW7为骨架，两个载体分别使用SacI/KpnI和SacI/PmeI核酸内切酶进行双酶切；通过同源重组技术将其他Gateway系列载体构建入两个载体。

专利名称：同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法
专利类型：发明专利
发明人：任茂智,王凯,冯丽,董攀
申请号：CN201510980547.7
申请日：20151223
公开号：CN105505967A
公开日：
20160420
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法，包括以下步骤：(1)构建M35S-8GWN载体、MNOS-8GWN载体和MOCS-8GWN载体；(2)克隆各目的基因，通过Not？I和Sbf？I将各基因分别组装到M35S-8GWN载体、MNOS-8GWN载体和MOCS-8GWN载体中，形成多个基因的表达盒；(3)将多个基因的表达盒通过同尾酶AsiS？I和Pac？I串联在一起；(4)将多基因表达盒通过Gateway？LR反应连接到目标表达载体上。

还公开了三种用于构建多基因植物表达载体的入门载体M35S-8GWN、MNOS-8GWN、MOCS-8GWN。

申请人：重庆大学
地址：400045 重庆市沙坪坝区沙正街174号
国籍：CN
代理机构：重庆市前沿专利事务所(普通合伙)
代理人：郭云
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基于Gateway技术的表达载体构建基于Gateway技术的表达载体构建1. Gateway-T载体（pGWC）的酶切反应pGWC除具有传统T载体的克隆功能外，还可以作为入门克隆（Entry Clone）与Gateway 重组克隆技术兼容。

该载体中的ccdB基因编码一个能够使大多数E. coli致死的毒蛋白，可作为重组子的负选标记取代了蓝白斑筛选。

该载体在使用前，需经过AhdI（实验中采用其同裂酶Eam1105 I）酶切，使载体两端产生5’T，用与PCR产物的两端的3’A互补。

PCR产物回收后与pGWC载体连接，挑取正向克隆送测序。

pGWC载体的酶切反应体系如下：pGWC10 μl（约2μg）10×Eam1105 I Buffer5 μlEam1105 I2 μlddH2O34 μl共计50 μl将反应混和液于37℃温育6h。

取1μl酶切反应液走1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，估测载体片段的浓度，该酶切反应液可直接用作连接无需纯化。

2. PCR产物的回收与连接反应PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）进行回收，与pGWC载体进行连接。

DNA片段与pGWC-T的连接：pGWC-T1μl（约50ng）DNA回收片段4μl（600bp片段约需40ng）Solution I （TaKaRa）5μl共计10μl反应混合液于4℃下连接过夜（约12~16h）。

3. 连接产物的转化取大肠杆菌DH5α感受态细胞（50μl/管）于冰上融化，加入5μl 连接产物，用移液器轻轻吸打混匀，在冰上放置30min，42℃水浴热激90s，冰上放置5min，加入无抗生素的LB培养基300μl，37℃，160rpm振荡培养45min，将菌液铺在氯霉素抗性（25mg/L）LB平板上，在超净台吹干后37℃倒置培养过夜。

4. LR反应与表达载体构建表达载体均采用Gateway重组克隆技术构建，目标基因连入pGWC后即为入门克隆（EntryClone），通过与表达载体做LR反应构建目标基因的表达载体。

图1 目的载体pH7GWIWG2（I ）克隆获得目的基因后，通过序列比对等方法寻找该基因的特异性序列片段，分别设计特异引物及含有一半attB接头序列的引物。

引物Primers 引物序列Primer SequencesGENE -F GENE -R attB- GENE -F attB- GENE -R attB-adapter-F attB-adapter-R 5′- NNNNNNNNNNNNNNNNN -3′5′- NNNNNNNNNNNNNNNNN -3′5′- AA AAA GCA GGC T NNNNNNNNNNNNNNNNN -3′ 5′- A GAA AGC TGG GT NNNNNNNNNNNNNNNNN -3′ 5′- GGG GAC AAG TTT GTA CA A AAA AGC AGG CT -3′5′- GGG GAC CAC TTT GTA CA A GAA AGC TGG GT-3′1、 根据特异性片段序列，设计引物GENE –F/GENE –R ，RT-PCR 获得目的片段。

2、以步骤一得到的cDNA 片段为模板，用引物attB- GENE –F/attB- GENE –R 进行扩增获得attB-1-PCR 产物。

3、以步骤二得到的目的片段为模板，用引物attB-adapter-F/attB-adapter-R 进行扩增，得到attB-PCR 产物。

4、纯化回收attB-PCR 产物。

5、BP 反应（1）室温下，在1.5 ml eppendorf管中加入下列反应体系，并混匀，25℃温育过夜。

试剂名称体积（反应体系：10 µL）attB-PCR 回收产物 2 µLpDONRTM vector（150 ng/ µL） 1 µLBP Clonase TM enzyme mix 1 µL5 × BP ClonaseTM Reaction Buffer 2 µLTE Buffer （pH8.0） 4 µL（2）加1 µL Proteinase K solution，37℃温育10 min，以终止BP反应。

文中如未特别指出，PCR程序均为：95℃预变性5',95℃变性30",60℃退火30", 72℃延伸1'30" (短片段30"), 30个循环后延伸10min。

1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物。

1.1.1载体构建及鉴定1．PCR产物的纯化参见安比奥生物科技公司的Puprep PCR Purification Kit 说明书。

2. 载体构建（Gateway技术）pDONR201是一种attP供体载体，用于BP反应构建入门载体，包含抗kan和抗cm筛选标记，并且含有ccdB基因，ccdB基因编码干扰大肠杆菌DNA促旋酶的一种蛋白，从而抑制标准大肠杆菌宿主的生长。

当目的载体和入门克隆发生重组时，ccdB基因被目的基因取代。

携带有ccdB基因的未反应载体或保留有ccdB基因副产品的细胞将不会生长。

GatewayN-GFP一种attR目的载体通过LR反应构建目的基因的表达载体（图3.3），含有35S组成型强启动子、抗氨苄青霉素基因和抗除草剂筛选标记基因Bar，还含有绿色荧光蛋白报告基因GFP。

表达载体Gatewaypleela（图2.2）含有35S组成型强启动子、抗氨苄青霉素基因和抗除草剂筛选标记基因Bar，通过LR反应构建目的基因的表达载体。

图2.2 pDONR201的结构BP反应体系(att B x att P → att L x att R )att B-PCR产物40-100 fmol,25-50ngpDONR™75ng5x BP Clonase™- buffer 1 μlTE Buffer (pH 8.0) or H2O to 4.5μlBP Clonase™0 .5μlTotal 5μl反应体系放于25°C下温育2h。

反应后，加2 μl 2 μg/μl的Proteinase K在37°C下处理10 min，再将BP产物（入门载体）加2μl转入大肠杆菌DH5α，在含kan的LB 板上筛选，克隆并保存入门载体。

Gateway 基因克隆Gateway 基因克隆是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。

该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。

这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone）。

据Invitrogen宣称Gateway技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology）。

一、Gateway 基因克隆的原理及机制Gateway被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。

Gateway的原理是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。

在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。

这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。

这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。

利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi表达载体NAC转录因子参与植物生长发育和对生物和非生物胁迫的应答反应，利用Gateway克隆技术构建丹参NAC转录因子的RNAi植物表达载体，以便进一步研究丹参NAC转录因子的功能。

根据Gateway技术要求，设计含有attB接头的引物，使用NEB的Phusion超保真聚合酶，通过PCR方法，扩增SmNAC1基因的特异性片段。

通过BP重组反应，将带有attB接头的PCR产物克隆到入门载体pENTR/SD/D-TOPO上，再通过LR重组反应，利用入门载体上的SmNACi 特异性基因片断克隆到植物表达载体pK7GWIWG2D上。

实验结果表明Gateway 载体的构建方法能够高效、快速地将目的基因克隆到表达载体上，为植物基因转化提供基础。

标签：RNAi；Gateway载体；BP和LR反应Gateway克隆技术是由invitrogen公司开发，基于λ噬菌体的位点特异性重组原理[1-2]，可以使DNA片段在不同的克隆载体之间实现转移，并保持基因定位和阅读框架不发生改变。

λ噬菌体的位点特异性重组是在噬菌体和细菌的整合因子（INF，Int）的作用下，λ噬菌体的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，λ噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生2个新位点：attL，attR。

这是一个可逆的过程，在噬菌体编码蛋白Xis和细菌的整合因子IHF，Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB，attP位点。

这一过程受编码蛋白Xis和整合因子（IHF，Int）调控。

与经典基因克隆多个步骤相比，Gateway技术不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到表达载体（destination vector，目的载体）上，该方法只需一步生化反应便能达到目的，是高通量克隆基因的好方法。

Gateway 基因克隆Gateway 基因克隆是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。

该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。

这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone）。

据Invitrogen宣称Gateway技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology）。

一、Gateway 基因克隆的原理及机制Gateway被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。

Gateway的原理是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。

在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。

这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。

这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。