蛋白组学技术在检测肾血管平滑肌脂肪瘤血清差异蛋白中的应用

３讨论
肾血管平滑肌脂肪瘤，也叫肾错构瘤，是肾良 性肿瘤中最常见者，约占肾肿瘤的３％。部分患者 可同时有结节性硬化症，此系常染色体显性基因 导致的遗传的家族性疾病。肿瘤组织由血管、平 滑肌和脂肪组成，其典型影像学表现为超声提示 强回声脂肪密度，ＣＴ提示负值的脂肪成分旧ｏ。但 由于３种成分所占比例不同，影像学表现不同，部 分错构瘤含脂肪成分少，则术前诊断困难，给临床 鉴别诊断增加难度。
ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ
ＭＳ技术是在传统的２Ｄ凝胶电泳
技术之后发展起来的蛋白质组学新技术，同２Ｄ凝
胶电泳技术相比其优点明显。本研究采集的差异蛋 白峰分子质量范围在１～１０ Ｕ，结果中许多在统计
万方数据
董德鑫蛋白组学技术在检测肾血管平滑肌脂肪瘤血清差异蛋白中的应用
１４８３
参考文献：
［１］Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ
摘要：目的应用ＷＣＸ磁珠联合ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ技术对肾血管平滑肌脂肪瘤进行血清差异蛋白实验，寻找显著性表
达的差异蛋白，以提高肾血管平滑肌脂肪瘤的检出率。方法应用磁珠联合ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ ＭＳ技术对肾血管平滑肌脂肪
瘤血清进行差异蛋白研究，筛选出肾血管平滑肌脂肪瘤多个血清差异蛋白，并应用遗传算法建立诊断模型。结果筛
ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＷＣＸ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＭＡＬＤＩ・・ＴＯＦ ＭＳ ｌｉｐｏｍａ．
ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｍｉｓｄｉａｇｎｏｓｉｓ
ｏｆ ｒｅｎａｌ ａｎｇｉｏｍｙｏ－－
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒｅｎａｌ ａｎｇｉｏｍｙｏｌｉｐｏｍａ；ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；ｂｅａｄ；ｓｅｒｕｍ；ｄｉａｇｎｏｓｉｓ
５ ２．１
根据整体波形特点，剔除不合格图谱，并对低分 子质量区间波峰分子质量进行校正。采集分子质量 区间范围为１—１０ ｋｕ，选择标准品进行分子质量校 正，标准品质谱图谱（图１）。利用ＣｌｉｎＰｒｏＴｏｏｌｓ２．２ 软件对质谱图的数据进行分析，筛选血清差异蛋白 峰，建立。肾血管平滑肌脂肪瘤的诊断模型。
Ｉ．２．４血清样品点样：取磁珠处理后的样品，取
１
ＩｘＬ点在Ａｎｃｈｏｒｃｈｉｐ靶样品位置，室温干燥。采用
万方数据
１４８２
基石ｌ｛｛医。￥：与Ｉ临床
Ｂａｓｉｃ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
２０１３．３３（１１）
表１筛选出符合条件的１５个差异蛋白峰建立诊断模型
Ｔａｂｌｅ １ １５ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ
２
结果
肾血管平滑肌脂肪瘤与对照组之间
ｍＬ，置人真空无抗凝剂ＢＤ采血管中，转速
ｒ／ｍｉｎ离，Ｉ）１０ ｒａｉｎ后取上层血清，分装入艾本
２．１．１血清差异蛋白峰筛选：质谱仪采集分子质量
区间１～１０ ｋｕ范围内全部可识别差异蛋白峰１４２个
２ ０００
德管后置于一８０℃低温冰箱冻存。从血清采集到
（图２），凝胶模拟示意图（图３），具有较明显差异的
学上显著差异的蛋白质分子质量在５ ｋｕ以下，而经 典蛋白质组学２Ｄ凝胶电泳技术能够分辨的最小分
子质量多在４—５ ｋｕ以上，因此ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ ＭＳ技
术在寻找小分子量差异蛋白上的优势明显，适合于 临床实际应用Ｍ。７ Ｊ，结果具有很好的重现性、可行性 和可信性。本研究找到‘肾血管平滑肌脂肪瘤与正常 对照之间的差异蛋白１个，期望可以为肾血管平滑 肌脂肪瘤的人群筛查、早期诊断、治疗选择和术后随 访提供临床参考。 遗传算法是近些年发展起来的一种全局优化算 法，借用了生物遗传学的观点，通过自然选择、遗传、 变异等作用机制，实现个体的适应性提高旧。９ Ｊ。本 研究利用ＣｌｉｎＰｒｏＴｏｏｌｓ２．２软件对质谱图的数据进行 分析，就是利用遗传算法进行组合优化，筛选多个差 异蛋白峰建立肾血管平滑肌脂肪瘤的诊断模型。该 诊断模型敏感性和特异性较高。 应用蛋白组学技术筛选的差异蛋白峰，并建立 肾血管平滑肌脂肪瘤的诊断模型具有较高的敏感性 和特异性，有利于肾血管平滑肌脂肪瘤的早期诊治。
２０１３年１１月
基础医学与临床
Ｂａｓｉｃ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１３ Ｖ０１．３３ Ｎｏ．１１
第３３卷第１１期
文章编号：１００１－６３２５（２０１３）１
１—１４８０—０４
研究专ｇ－文
蛋白组学技术在检测肾血管平滑肌脂肪瘤血清差异蛋白中的应用
董德鑫，李汉忠＋，张玉石
（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院泌尿外科，北京１００７３０）
１３
ｋｕ。同一标准品结晶靶点，不同结晶点，多点采
ｇｒａｙ．ｒｅｎａｌ ａｎｇｉｏｍｙｏｌｉｐｏｍａ，ｂｌａｃｋ．ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒＯ｜ｌＰ
集，累加５—１０个结晶点数据，得到累加后的标准品 图谱，平均分子量偏差小于１００
ｐｐｍ。
图２两组样本之间血清差异蛋白峰
Ｆｉｇ ２ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｅａｋｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ
ＤＯＮＧ Ｄｅ—ｘｉｎ，ＬＩ Ｈａｎ—ｚｈｏｎｇ＋，ＺＨＡＮＧ Ｙｕ—ｓｈｉ （Ｄｅｐｔ．ｏｆ
Ｕｒｏｌｏｇｙ，ＰＵＭＣ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ＣＡＭＳ＆ＰＵＭＣ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００７３０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＷＣＸ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＭＡＬＤＩ－－ＴＯＦ ＭＳ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒ・－
ａ
１ ５ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｅｓｔａｂ—
ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｍｏｄｅｌ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ
ｒａｔｅ ｗａｓ
１００％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ
ｃａｎ
Ｔｈｅ ｉａｇｎｏｓｉｓ ｍｏｄｅｌ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｐｐｌｉ－
ｒａｔｅ
基金项目：北京协和医院中青年科研基金（ｐｕｍｃｈ－２０１３—１１９） ‘通信作者（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
ａｕｔｈｏｒ
Ｊ：ｗｉｎｔｅｒｈｅａｒｔ＠１６３．ｃｏｎｑ
万方数据
董德鑫蛋白组学技术在检测肾血管平滑肌脂肪瘤血清差异蛋白中的应用 别意义的血清差异蛋白峰，并依据遗传算法建立诊 断模型，以减少肾血管平滑肌脂肪瘤的误诊率。
ｃａｎ
ｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｒｅｎａｌ ａｎｇｉｏｍｙｏｌｉｐｏｍａ ｂｅａｄｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｇｉｏｍｙｏｌｉｐｏｍａ ｍｏｄｅｌ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
ｃａｎ
ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｍｉｓｄｉａｇｎｏｓｉｓ
ｒａｔｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｐ，Ｍｏｈｏｔｔａｌａｇｅ Ｓ，Ｇｏｅｇａｎ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ｏｐｔｉ— ｆｏｒ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｐｒｅｔｅｏｍｅ
ｍａｔｒｉｘ—ａｓｓｉｓｔｅｄ
ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）ａｐｐｌｉ—
Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１０，７１：
１４８１
美国Ａｕｔｏｆｌｅｘ州ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ—ＭＳ质谱仪，将Ａｎｃｈｏｒ－ ｃｈｉｐ靶放入质谱仪，选择线性模式，选择采集范围
８００～１０
１材料与方法
１．１研究对象
ｋｕ，同一样品同一结晶点，８点采集，累加
ｐｐｍ。
至４００击发数。平均分子质量偏差小于１００
１．３数据处理
１．１．１病例资料：２０１０年３月至２０１０年５月期间 于北京协和医院泌尿外科病房采集肾血管平滑肌脂 肪瘤１４例，其中男３例，女１１例，年龄范围２８—６７ 岁，平均年龄４８．５岁，所有患者术后病理均确诊为 肾血管平滑肌脂肪瘤。于北京协和医院泌尿外科门 诊采集正常对照组标本共计１１例，均为男性，年龄 范围３４—７７岁，平均５２．５岁。所有患者均签署知 情同意书，符合伦理委员会规定。 １．１．２标本收集：清晨空腹状态抽取肘静脉血３～
样本冻存邗０
１．２．１
ｒａｉｎ内完成。
１．２实验步骤
血清样本准备：从一８０℃冰箱中取出血清
样本，取血清５恤Ｌ加入含磁珠和磁珠结合液的样品 管，吸打混匀后室温静置备用。
１．２．２
弱阳离子磁珠准备：２００斗Ｌ样品管加入
１０恤Ｌ磁珠结合缓冲液，再加入１０灿磁珠并吸打混
匀。向样品管中加５斗Ｌ血清并吸打混匀。将样品 管放人磁珠分离器，分离后吸去悬浮的液体。样品 管中加入１００斗Ｌ磁珠清洗缓冲液，分离后吸去悬浮 的液体。重复上述步骤２次，以保证悬浮液完全被
蛋白指纹图谱是近些年发展起来的一种新的蛋 白质组学技术，它可以捕获肿瘤演变过程中外周血 浆蛋白分子的细微变化，对肿瘤做出极早期诊
收稿日期：２０１３—０３—２２ 修回日期：２０１３—０５—２ｌ
断¨－２］。本实验利用弱阳离子磁珠联合ＭＡＬＤＩ． ＴＯＦ—ＭＳ技术比较肾血管平滑肌脂肪瘤组和对照组 的血清样本，寻找对于肾血管平滑肌脂肪瘤具有鉴
ＷＣＸ
ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ ＭＳ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｒｅｎａｌ
ｓｃｒｅｅｎ
ｏｕｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ
关键词：肾血管平滑肌脂肪瘤；蛋白质组学；磁珠；血清；诊断
中图分类号：Ｒ
６９２
文献标志码：Ａ
Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｒｅｎａｌ ａｎｇｉｏｍｙｏｌｉｐｏｍａ
Ｆｉｇ １
图１标准品质谱图谱
Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ
吸走。向样品管中加入５灿磁珠洗脱缓冲液，后放