脂肪酶活力测定方法及其比较

万方数据

苯萃取后进行比色测定．酶的活力单位定义同平板法．酶活计算同铜皂法．

１．３．３对硝基苯酚法

对硝基苯酚法是以对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解底物产生具有颜色的对硝基苯酚，在４２０ｎｍ波长下测出其吸光光度值，再对照对硝基苯酚吸光度工作曲线得出脂肪酶活力．这样可以使操作更加简单同时可以避免金属离子的干扰［２．１８｜．酶的活力单位定义为检测条件下每分钟产生１ｂｔｍｏｌ对硝基苯酚所需的脂肪酶量，其计算公式为：脂肪酶活力一ＶＮ（Ｃ（样）一Ｃ（空白））／丁／Ｖ（稀释酶液）．式中。Ｖ反应总体积，Ｎ稀释倍数，Ｃ根据吸光度Ａ求出的对硝基苯酚的浓度，ｔ反应时间，ｙ（稀释酶液）稀释酶液的体积．

２３种方法的比较

２．１实验仪器和操作难易程度的比较

平板法所使用的主要仪器是超净工作台，微量注射器。培养皿，恒温培养箱，价格便宜，操作简单Ｌ２·１３］；滴定法仅需要酸碱滴定管、试管、恒温水浴锅、酸度计、高速组织捣碎机等一些比较常见，操作简单［”］；比色法包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法．铜皂法使用的主要仪器是分光光度计。超声波装置，仪器较常见，但操作繁琐［１５］；微乳液法使用的仪器主要是分光光度计，操作简单。精确度高Ｌ１６—１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器主要是分光光度计。操作简单［２·１８］（表１）．

２．２实验试剂及精确度的比较

平板法使用的试剂主要有维多利亚蓝、三丁酸甘油脂、罗丹明Ｂ等，该实验反应时间长且精确度差［１１］．滴定法所使用的主要试剂有氢氧化钠、酸碱指示剂、聚乙烯醇、橄榄油等［１３｜．滴定中酸碱指示剂不能很好地指示反应终点，即使用酸度计代替酸碱指示剂控制反应终点，产物中丙酮酸的干扰使实验的结果偏大［１ｌ’１９］．铜皂法中的底物有３种：榄橄油，三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂［１５］．其中榄橄油作为底物，精确度不高，当用三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂作为底物检测脂肪酶的活性。精确度较高．微乳液法使用的试剂有三油酸甘油脂，吐温一８０和正己烷，实验重复性好，精确度高Ｌ１６。１７｜．对硝基苯酚法使用的试剂主要是对硝基苯酚，稳定性好且非常精确［２．１８］（表１）．

２．３各种方法的适用范围

平板法所使用的仪器十分常见、所使用的试剂也比较便宜，但该种方法的误差较大同时需要的时间很长．因此该种方法主要应用于产脂肪酶菌种的筛选及批量酶样品的快速测定［１１］；滴定法所使用的仪器常见、操作简单，所使用的试剂比较便宜，精确度较高，适合于学生实验和具备简单仪器的实验室测定脂肪酶的活性［２］；铜皂法所使用的仪器较常见、操作繁琐、稳定性不高。但实验精确度高且试剂较便宜，大部分实验室和生物技术公司用该种方法测定脂肪酶的活性［１５］；微乳液法所使用的仪器常见、操作简单，重复性好，但试剂价格偏高，主要适用于实验室和生物技术公司对酶活性的精确测定［１６－１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器常见，但试剂对硝基苯酚价格昂贵且有毒，主要适用于实验室对酶活性的精确测定［２．１８］（表１）．

表Ｉ平板法、滴定法及比色法的比较

３结论

在脂肪酶活性检测时，可根据实验目的、实验设施及节约成本的原则选择适宜的方法和底物来检测脂肪酶活性．在活性检测过程中，酶活力单位的计算尽量在最适温度、最适ｐＨ、酶浓度以及适宜的底物浓度下进行。从而使测定的脂肪酶活性达到最大值，使结果更加准确和可信．另外，由于酶的活力单位可以根据计算和记录的方便而自行定义。给交流和工业生产造成麻烦，建议在测定脂肪酶的活力时，尽量使用国际单位来计算·４４·酶活．

致谢本文受到贵州省教育厅重点扶持学科基金和凯里学院植物学重点学科基金资助．

参考文献：

［１］ＧＵＰＴＡＲ，ＧｕｐｔａＮＲａｔｈｉＰ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｐａｓｅｓ：ａｎｏ’ｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ—ｇＹ。２００４，６４（６）：７６３—７８１．

万方数据

万方数据

脂肪酶活力测定方法及其比较

作者：雷启义， 邹凯， 周江菊， 张文华， LEI Qi-yi， ZOU Kai， ZHOU Jiang-ju， ZHANG Wen-hua

作者单位：雷启义,周江菊,张文华,LEI Qi-yi,ZHOU Jiang-ju,ZHANG Wen-hua(凯里学院环境与生命科学学院,贵州凯里,556011)， 邹凯,ZOU Kai(铜陵外国语学校,安徽铜陵,363100)

刊名：

凯里学院学报

英文刊名：Journal of Kaili University

年，卷(期)：2011,29(6)

1.GUPTA R;Gupta NRathi P Bacterial lipases:an overview of production,purification and biochemical properties[外文期刊] 2004(06)

2.阎金勇;杨江科;徐莉白地霉Y162脂肪酶基因克隆及其在毕赤酵母中的高效表达[期刊论文]-微生物学报 2008(02)

3.高贵;韩四平;王智脂肪酶活力检测方法的比较[期刊论文]-药物生物技术 2002(09)

4.ZHANG A J;GAO R J;DIAO N B Cloning,expression and characterization of an organic solvent tolerant lipase from Pseudomonas fluorescens JCM5963[外文期刊] 2009(2-3)

5.SOROR S H;Rao RCullum J Mining the genome sequence for novel enzyme activity:characterisation of an unusual member of the hormone-sensitive lipase family of esterases from the genome of Streptomyces coelicolor A3 (2)

2009(06)

6.SZTAJER H;Maliszewska I;Wieczorek J Production of exogenous lipases by bacteria,fungi,and actinomycetes[外文期刊] 1988(08)

7.HASAN F;SHAH A A Industrial applications of microbial lipases[外文期刊] 2006(02)

8.SHARMA R;CHISTI Y;BANERJEE U C Production,purification,characterization,and applications of lipases[外文期刊] 2001(08)

9.DOUGLAS G;Hayes Enzyme-Catalyzed Modification of Oilseed Materials to ProduceEco-Friendly Products[外文期刊]

2004(12)

10.孙宏丹;孟秀香;贾莉微生物脂肪酶及其相关研究进展[期刊论文]-大连医科大学学报 2000(04)

11.邬敏辰;孙崇荣;邬显章平板扩散法粗略确定碱性脂肪酶的活性[期刊论文]-无锡轻工大学学报 2000(02)

12.KOUKER G;JAEGER K E Specific and sensitive plate assay for bacterial lipases[ 1987(01)

13.杨华;娄永江国产碱性脂肪酶的测定方法特性研究[期刊论文]-中国食品学报 2006(03)

14.LOWRY R R;TINSLEY I J Rapid colorimetric determination of free fatty acids[外文期刊] 1976(07)

15.纪建业脂肪酶活力测定方法的改进[期刊论文]-通化师范学院学报 2005(06)

16.黄锡荣;张文娟;宁少芳分光光度法测定微乳液中脂肪酶的酶活[期刊论文]-化学通报(印刷版) 2001(10)

17.张海燕;丁玉;尹瑞卿脂肪酶酶活性的最新研究[期刊论文]-生物学通报 2007(03)

18.TENG Y;XU Y A modified para-nitrophenyl palmitate assay for lipase synthetic activity determination in organic solvent 2007(02)

19.张爱宏;刘国庆放射性同位标记法检测脂蛋白脂肪酶活性及其应用[期刊论文]-中国动脉硬化杂志 2003(06)

本文链接：/Periodical_qdnmzsfgdzkxxxb201106016.aspx