【精品】细胞生物学实验指导讲义

细胞生物学实验室规则与操作要求为获得较好的实验结果，避免发生差错与意外事故，特制定以下规则与要求，希望实验者能严格遵守。

（一）显微镜的使用及保护①显微镜是细胞生物学实验的主要观察工具，使用时必须注意保持外观整洁、防湿、防高温、防药品侵蚀，使用时勿使染液或其它溶液沾污镜头，一旦沾污，及时用擦镜纸蘸上镜头清洗液（无水乙醚：无水乙醇＝7：3）轻轻擦拭干净。

②带光源的显微镜待电压稳定后，将电源的光亮度调节器调至最小，再打开显微镜的电源，缓慢调节光亮度适当进行量度观察，观察完毕后，则先将光亮度调节器调至最小，然后再关闭显微镜电源开关。

③镜头的清洗：实验完毕后，镜头的清洗很重要。

用擦镜纸蘸取少量镜头清洗液，先从镜头的中央开始清洗，轻轻旋转擦至镜头的边缘部分，如此重复2－3次。

④载物台必须保持清洁，必要时亦可用擦镜纸蘸少量清洗液擦试载物台。

聚光器上的污物的去除亦可采用类似的方法。

⑤使用完毕后，玻片一律取下，套上布袋.放回原处。

本桌的显微镜一律不准搬离本实验桌。

若需使用者，可到该桌使用，使用后务必保持该显微镜的清洁。

如若发现违章使用情况，必追究使用者责任，本次实验作零分计。

（二）实验时，实验室内，一律不准高声喧哗整洁，保持室内安静，认真操作，仔细做好各项观察与记录。

（三）实验室内的一切仪器、物品必须爱护。

节约材料、药品，取用时不要过量。

公用物品不得独自占用，用后归还原处。

（四）注意安全。

使用有毒物品、强酸、强碱等，应严格按照操作规程。

易燃物品远离火源。

禁止湿手拿取电源开关或接触电源。

如发生触电等事故，及时报告。

（五）取用各种试剂，要用及时盖上瓶盖。

按献宝取出所需之药品或溶液后，不得将原液倒回瓶内。

滴管、玻棒、吸管不可混用。

（六）实验中如有丢失、损坏仪器设备及用具，及时登记并报告，凡违反操作规程造成不应有的损失者，视其情节轻重，态度好坏，按有关规定处理。

（七）本实验室欢迎各位实验者对每一实验本身提出新的看法与做法，至于能否采用，视具体情况而定。

细胞⽣物学实验指导实验⼀动物细胞的传代培养⼀、实验⽬的1、熟悉细胞培养过程中的⽆菌操作技术。

2、了解细胞传代培养的基本⽅法和主要操作步骤⼆、实验原理细胞培养(cell culture)是指从机体内取出某种组织或细胞，模拟机体内的⽣理条件使其在体外⽣存、⽣长和繁殖的过程。

细胞的体外培养在细胞⽣物学和医学研究领域有着极为⼴泛的⽤途，这⼀技术已成为研究细胞⽣理、细胞增殖、细胞遗传、细胞癌变和细胞⼯程等课题的⼀项不可缺少的⼿段。

细胞培养技术的突出优点在于能为研究者提供⼤量的⽣物性状相同的细胞作为研究对象，便于⼈们在体外利⽤各种不同的⽅法从不同的⾓度研究细胞⽣命活动的规律。

另外，利⽤细胞培养技术还可使⼈们较为⽅便地研究各种物理、化学和⽣物因素对细胞结构和功能的影响。

细胞培养可分为原代培养和传代培养2种情况。

所谓原代培养(primary culture)是指直接从机体取出组织或细胞后所进⾏的⾸次培养。

⽽传代培养(subculture)是指当原代培养的细胞增殖到⼀定密度后，将其从原培养容器中取出，以1：2或其他⽐例转移到另⼀个或⼏个容器中所进⾏的再培养。

传代培养可简称传代。

在体外培养过程中，要使细胞能正常地⽣长、繁殖，需经常对其进⾏传代。

传代的累积次数就是细胞的代数。

在从事细胞培养⼯作时常常会接触到细胞系(cell line)和细胞株(cell strain)这两个容易混淆的概念。

⼀般认为，细胞系指通过原代培养并经传代后所形成的细胞群体，由于细胞系来源于原代培养，⽽原代培养物中所含的细胞种类较多，故⼀个细胞系往往由多个⽣物学性状不同的细胞群体所组成，⽽细胞株是利⽤单细胞分离培养法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中选择出的细胞群体，⼀个细胞株往往具有特殊的⽣物学性状或标记并可持续存在。

细胞培养是⼀种程序复杂、条件较多且要求严格的实验性⼯作。

由于细胞在体外的⽣长、繁殖会受到温度、营养物质、酸碱度、渗透压及微⽣物等多种因素的显著影响，故细胞培养⼯作的各个环节如培养器⽫清洗消毒、营养液配制和除菌、pH值调整、温度调节等操作都有严格的要求和规定，特别要注意⽆菌操作，这是细胞体外培养成败的关键。

实验一相差显微镜的使用一、实验目的掌握相差显微镜的原理、构造及其使用方法。

二、实验用品试剂：蒸馏水或生理盐水。

器材：相差显微镜（相差物镜、转盘聚光器、调中合轴望远镜、绿色滤色镜）、载玻片、盖玻片、牙签、滤纸条、指甲油。

三、实验原理光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位（指在某一时间上光的波动所能达到的位置）的不同。

当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。

而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化（相应发生的差异即相差），而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。

相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差（明暗差），同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。

因此可用以观察活细胞或未染色标本。

相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜（通常标有PH的标记）代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。

环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。

其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。

相板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。

它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。

调轴望远镜是用来进行合轴调节的。

相差显微镜在使用时，聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。

否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。

1.相差同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。

相位是在某一时间上，光的波动所达到的位置。

一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差太小，我们的眼睛很难分辨出这种差别的，只有变相差为振幅差（明暗之差），才能被分辨。

《细胞生物学实验》指导一、实验课名称：细胞生物学实验Experiment of Cell Biology二、实验课性质：独立设课三、适用专业：生物技术和水产养殖四、采用教材及参考书：教材：安利国主编．细胞生物学实验教程．北京：科学出版社，2004参考书：1. 杨汉民主编．细胞生物学实验（第二版）．北京：高等教育出版社，1997.72. 徐承水，党本元主编．现代细胞生物学技术．青岛：青岛海洋大学出版社，19953. 王金发主编．细胞生物学实验教程．北京：科学出版社，2003五、学时学分：课程总学时：36；课程总学分：1七、实验课考核方式：1.实验课考核成绩确定：本课程考核成绩由平时成绩（占30%）、实验报告成绩（占30%）和终期考核成绩（占40%）三部分构成。

2.平时成绩确定：由任课教师根据实验操作、问题回答和出勤情况确定，按A（优）、B （良）、C（及格）、D（不及格）四个等级评分。

3.实验报告成绩：本课程要求学生实验报告应包括以下内容：①实验目的及原理：简明；②方法与步骤：具体操作步骤、注意事项等；③结果：详细每一步的结果以及计算方法和计算结果；④分析与讨论：根据所学知识对结果进行分析讨论，阐明所得结果说明了什么问题；如果结果与理论不符，应说明可能的原因。

实验报告成绩由任课教师根据学生实验报告写作是否符合规范要求、试验结果及分析的具体情况给出。

每次报告均按A（优）、B（良）、C（及格）、D（不及格）四个等级评分，实验报告成绩为各次报告成绩的平均值。

4.终期考核成绩：实验课结束后进行笔试、口试或现场操作考核，按A（优）、B（良）、C（及格）、D（不及格）四个等级评分。

实验项目实验一、显微镜的技术参数及特殊光镜的演示实验一、要求：了解普通光镜及各种特殊光镜的构造、成像原理及应用；掌握正确的使用方法；理解显微镜的技术参数和特殊光镜的结构特点；掌握实验报告的写法。

二、实验内容：普通光学显微镜的结构及技术参数：由光学和机械两大系统构成。

细胞生物学实验指导实验一、显微镜的结构与使用方法一、实验目的1.认识显微镜的构造2.学会独立操作显微镜二、仪器和材料显微镜、擦镜纸、装片三、实验内容1.学生按编号把自己的显微镜取出，放在试验台上，在教师的指导下熟悉显微镜各部分的构造及用途，然后进行操作练习。

先用低倍镜进行对光联系，使视野明亮而均匀。

如果使用双筒目镜，还应学习目镜间距的调节。

在转换高倍物镜观察，此时应注意它的视野亮度与低倍物镜有无区别？并思考通过哪几种方法调节使得高倍物镜的视野达到要求的亮度。

2.取已制备好的装片进行观察：按低倍镜使用步骤和方法进行操作练习。

注意要使观察到的像向前移动时，玻片标本应向那个方向移动？欲使观察到的像向右移动时，拨片标本应向那个方向移动？3.观察制备好切片：细胞核、中心体、胞间连丝、有丝分裂、减数分裂、高尔基体等。

4.观察完毕后，按正规要求取下玻片，把显微镜收好。

四、作业绘制2-3中细胞结构实验二、Feulgen反应显示DNA（一）实验目的1．掌握临时制片法。

2．熟悉Feulgen反应的原理及操作步骤。

3．观察细胞中DNA的分布。

（二）实验原理Feulgen在1924年发明一种对DNA特异的组织化学染色反应，故称Feulgen反应。

DNA经酸（1mol/L HCl）水解后，DNA分子中的嘌呤和脱氧核糖连接的配糖键被打开，脱氧核糖的一端释放出醛基，并在原位与Schiff试剂反应形成特异性的紫红色产物。

该产物能特异地吸收峰值为550~570nm的光波。

并且在一定的浓度范围内，对550~570nm光波的吸收值与DNA 含量成正比关系，既符合化学计量学关系。

此法既可定位用于细胞或组织化学染色反应，观察DNA的分布，又可用显微分光光度计和图像分析仪对细胞或组织中DNA的含量进行定量分析。

紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。

对照组或采取不经盐酸处理，或预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应。

细胞生物学实验指导（12生工）细胞生物学实验教案实验一：特殊显微镜的使用及显微摄影术一、实验目的：1、掌握暗视野显微镜、相差显微镜的原理、构造及其使用方法。

2、掌握显微摄影装置及其操作技术，独立完成显微摄影全过程。

二、实验原理：暗视野显微镜应用丁达尔现象，装配暗示场聚光器，是入射光从聚光器斜向照明被检样品。

暗视野显微镜利用样品的散射光和放射光进行观察，只能观察物体的存在与运动而不能辨清其细微结构。

暗视场照明是照明光线仅照亮被检样品而不能进入物镜，使视场背景暗黑，样品明亮的照明方法。

相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，通过衍射和干涉现象，将肉眼看不到的相差，变为明暗的振幅差而能看到。

相差显微镜应用于生物学的主要价值，在于对透明的活体进行直接观察，无需采用是细胞致死的固定和染色的方法。

0lympus BH系列的BHS和BHT型显微镜有摄影装置，通过摄影装置，拍摄显微视场中被检样品。

三、实验仪器与试剂1、材料：洋葱鳞茎、人口腔细胞；2、器材：暗视场显微镜、相差显微镜、Olympus显微镜、活体生物样品、擦镜纸、消毒牙签、镊子、滴管、纱布、吸水纸、载玻片、盖玻片3、试剂：生理盐水（0.9%）、2%碘液、香柏油、二甲苯。

四、实验步骤与方法（一）口腔上皮细胞的制备及染色1、把载玻片和盖玻片擦拭干净；2、用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水；3、用消毒牙签在自己漱净的口腔内壁轻轻地刮几下；4、把牙签上的碎屑放在生理盐水中轻涮几下；5、盖上盖玻片；6、在盖玻片的一侧滴一滴稀碘液；7、用吸水纸吸引,使染液浸润标本的全部。

（二）洋葱鳞茎内表皮装片制作1、把载玻片和盖玻片擦拭干净；2、用滴管在载玻片的中央滴一滴蒸馏水；3、用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮置于蒸馏水中；4、盖上盖玻片；5、在盖玻片的一侧滴一滴稀碘液；6、用吸水纸吸引,使染液浸润标本的全部。

（三）分别用暗视场显微镜和相差显微镜观察（四）显微摄影的使用将装片置于显微摄影镜下,选一清晰的视野进行拍摄并打印出来。

《细胞生物学》实验指导书（不太全供参考）适用专业:生物科学、生物技术实验目录实验一植物原生质体的分离与融合•••]实验二动物细胞原代培养•••3实验三细胞传代培养…彳实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察••Y实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测“I实验六环境因素诱变染色体改组的观察实验七红细胞膜蛋白的分离及其电泳检测 (11)实验一植物原生质体的分离与融合实验项目类型:综合性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：7学时一、实验目的1.掌握原生质体分离的原理与技术；2.了解细胞融合的基本原理及应用；3.初步掌握PEG融合法和电融合法.二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞.原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（叶等）获得.但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致.原生质体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后获得.原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似.但原生质体由于除去了细胞壁,所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定.常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等. 其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响.2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合.细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点的膜分子发生重组,然后由于表面张力作用,形成一个球形细胞. 原生质体分离融合和培养的意义：1.除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，为制造新杂种开辟了道路.植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景.它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一.2.原生质体可摄入外源DNA,细胞器、细菌或病毒颗粒,这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础.3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料.三、实验仪器与材料1.材料:油菜叶子、白菜花2.溶液或试剂:(1)洗涤液:甘露醇0.7mol/L,CaC12 • 2H2O3.5mmol/L,KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6),高压灭菌；(2)混合酶液:1.5%纤维素酶,1%果胶酶溶于洗涤液中(pH 5.6).(3)50%PEG(4)高pH高钙稀释液：(5)20%蔗糖溶液(6)DPD培养基：3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤(一)原生质体的制备：1.取材:取新鲜油菜叶和白菜花瓣自来水洗净，再用70%乙醇浸泡30S,0.5%次氯酸钠消毒lOmin,无菌水冲洗5次.2.酶解：材料切成1mm宽细丝，加入适量酶液，置摇床上(60〜70rpm),在25〜28°C黑暗条件下，酶解5〜7h.3.分离：用200目网过滤除去未完全消化的残渣，在lOOOrpm条件下离心5分钟,弃上清.加入3〜4ml洗涤液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液.用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20% 蔗糖溶液上(5ml离心管装3ml 20%蔗糖溶液)，在lOOOrpm条件下离心5-10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与洗涤液之间，破碎的细胞残渣沉入管底.用200 u 1移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加4ml洗涤液,1000rpm离心2-5分钟, 弃上清.（二）原生质体融合：1.将原生质体用DPD调节浓度为1*105个/mL.2.将原生质体混合物滴入小培养皿，静置8〜10分钟.3.然后滴入50%的PEG溶液，静置2分钟.4.依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml高钙高pH洗涤液.注意在第二、三次洗液加入前,用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡;最后用液体培养基洗1〜2次.制片，镜检.五、实验报告画出观察到的融合细胞，并计算融合率.六、思考题1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质体，在实验中应注意那些问题？增多数量的方法:多取材且尽量切碎，增加酶浓度，提高酶解温度，延长酶解时间，操作轻柔，勿使原生质体破碎等.提高生活力的方法:取新鲜材料,采用合适的酶浓度、作用温度和时间2.举例说明原生质体融合的应用价值.实验二动物细胞原代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：4学时一、实验目的1.掌握动物细胞原代培养的基本方法和操作过程；2.熟悉原代培养细胞观察方法.二、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养.原代培养是建立各种细胞系的第一步，该技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究.分为组织块培养法和消化法两种.三、实验仪器与材料1.材料:小鼠心、肝、脾、肾等2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、解剖器械、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.处死小鼠:将小鼠用颈椎脱臼法处死，放入75%酒精种浸泡消毒.2.取材:在超净工作台中用灭菌的解剖器械剖开小鼠腹腔，辨认并取下肝脏、脾脏和肾脏，放入灭菌的培养皿中，加入Hanks液清洗，然后加入2mL胰蛋白酶液,研磨并过滤.3.将液体转移到离心管,1200rpm离心5min收集细胞,加入适量培养液,C02培养箱培养.4.观察:逐日在倒置镜下观察细胞生长情况.五、实验报告画出细胞贴壁前和贴壁后的形态.六、思考题试述细胞原代培养成功的条件？实验三细胞传代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的1.熟练掌握贴壁细胞传代的培养方法；2.观察传代细胞贴壁、生长、繁殖过程中细胞形态的变化.二、实验原理离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养,细胞将逐渐衰老死亡.传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其它比率转移，接种到另一培养瓶的培养.贴壁培养细胞的传代通常采用胰蛋白酶消化,把细胞分散成单细胞再传代.三、实验仪器与材料1.材料:原代培养的小鼠细胞或Hela细胞2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液.(以液面盖住细胞为宜)，静置5~10分钟.2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆,相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3〜5ml新鲜培养液,吹打, 制成细胞悬液.3.将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml 左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养.五、实验报告分别画出贴壁生长的小鼠细胞和Hela细胞,并说明二者的不同.六、思考题写出细胞传代培养成功的条件？实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的了解细胞骨架的结构特征及其制备技术二、实验原理细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维.它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用.用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色或间接免疫荧光标记以后，可在显微镜下观察到细胞骨架结构.三、实验仪器与材料1.材料:洋葱鳞茎和口腔上皮细胞2.溶液或试剂：(1)M-缓冲液(2)6mmol/L(pH 6.8)磷酸缓冲液(3)l%Triton X-100(用M-缓冲液配制)(4)0.2%考马斯亮蓝R250(5)3%戊二醛3.仪器或其他用具:光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镶子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸等.四、实验步骤1.撕取洋葱鳞叶内表皮若干片,大小约lcm2,置于青霉素小瓶或小烧杯中.2.用磷酸缓冲液(PBS)浸泡片刻.3.吸去磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20分钟抽提细胞骨架以外的蛋白质,从而使骨架图像更加清晰.4.吸去TritonX-100,用M-缓冲液洗3次，每次3分钟.M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用.5.用3%戊二醛固定15-20分钟6.用PBS洗3次，每次3分钟7.考马斯亮蓝染色15分钟8.蒸馅水洗2次9.置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察.五、实验报告绘出植物细胞骨架微丝结构图.六、思考题说出各步骤的目的和一些重要试剂的在此处的作用.实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测实验项目类型:创新设计性实验所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：9学时一、实验目的1.了解细胞凋亡的概念和原理;2.掌握细胞凋亡诱导的方法;3.认识细胞凋亡的特征.二、实验原理人体内的细胞注定是要死亡的，目前人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡.坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程.表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢,DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应.凋亡是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为.其细胞及组织的变化与坏死明显不同.细胞凋亡的形态学变化: 首先细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后胞质密度增加, 核质浓缩，核膜核仁破碎,DNA降解,胞膜形成小泡，最终为为几个凋亡小体，无内容物外溢,因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬.凋亡细胞DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱,而坏死呈弥漫的连续图谱.三、实验仪器与材料1.鸡血细胞2.溶液或试剂：生理盐水,20mmol/LCaC12顺伯，姬姆萨染色剂，Tris.HCl,SDS, EDTA,乙醇，甲醇，蛋白酶K.3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤（一）细胞凋亡的诱导：1.采鸡血10ml,加0.85%的生理盐水混匀,1200r/min离心5min,弃上清液（重复三次），制备红细胞悬液，然后加入50ml血细胞保存液混匀放于4°C冰箱中备用.2.取4个试管，各加入鸡血细胞保存液2ml,在1号管中加入2ml生理盐水作为阴性对照,2号试管加入2ml 10ug/ml的顺伯溶液作为阳性对照;3号试管中加入2ml 20mmol/L的CaC12溶液进行胁迫处理;4号试管不加任何物质，实验时煮沸5 min使细胞坏死.（二）细胞凋亡的形态学观察：1.处理4h取样，用生理盐水稀释5倍，各取50ul细胞悬液均匀涂布于5 片载玻片上,晾干.2.用甲醇固定2min,然后在载玻片上滴加适量姬姆萨染液染色lOmin.3.用蒸馅水轻轻洗去染液，室温晾干，在光学显微镜下观察细胞形态变化.4.照相，并对试验组细胞进行凋亡计数统计.（三）DNA梯状条带的检测：1.离心收集鸡血细胞，弃上清.2.加入1ml的细胞裂解缓冲液重悬，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20 n 1,混匀.3.在65°C恒温水浴锅中水浴30min（也可转入37°C水浴12〜24h）,间歇振荡离心管数次.4.于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中.5.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出, 或12,000转/分离心5分钟，弃上清,晾干.6.用50ulTE 缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,并加入RNase A(10ug/ul)5ul,于37 °C 保温10〜15分钟.7.1.2 %琼脂糖凝胶,75 V电压，电泳45 min左右，8.紫外灯下观察并照相.(琼脂糖凝胶电泳:称取 1.2克琼脂糖加入100ml1*TBE),加热使之溶解，取一个凝胶模子，两端用胶布封好，水平放置.将制孔器(即梳子)放在模子一侧约0.5cm处，其底部距模子约1mm.待琼脂冷至约70°C时，加入10ul 0.5mg/ml EB,混匀，倒入模子，待冷却凝固后，取下梳子，撕去两端胶布,放入电泳槽中，使有加样孔的一端放在负极一端.在电泳槽中加入1*TBE至超过凝胶表面约1mm.加入DNA 电泳样:1.5ul DNA 。

植物组织培养一、实验目的1、掌握植物细胞无菌培养技术。

2、了解不同激素对细胞的不同诱导作用。

二、实验原理植物组织培养是20世纪60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。

它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官，组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整的再生植株。

植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔的应用前景。

组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种，幼胚培养与试管受精，抗体突变体的筛选于体细胞无体系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面的深入研究与实际应用，都必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法，深刻理解植物细胞的全能性。

三、实验用品1、材料半夏无菌苗。

2、仪器卧式灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱或培养室。

3、用具镊子、刀、牛皮纸、marker笔、棉线。

4、器皿试剂瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培养皿(直径9～11cm)。

5、药品与试剂1).药品(见下表)2).70％酒精四、实验方法1、培养基的配制配制培养基前先要配制母液。

母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。

(各类成分浓度、用量详见下表)。

表1 MS培养基母液配制(单位：mg)1).大量元素母液(10倍液)分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的(60～80℃)蒸馏水中。

一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用。

2).微量元素母液(100倍液)分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定容至1000ml。

3).铁盐母液(100倍液)称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4·7H2O溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。

细胞生物学实验一细胞分裂相的观察（综合性，3学时，生技、生工专业必修）一、实验目的1.掌握减数分裂标本的制备方法；2.掌握生殖细胞减数分裂发生过程及各个时期的染色体和细胞变化特点；3.了解植物生殖细胞的形成过程。

二、实验原理减数分裂是生殖细胞发生的一种特殊细胞分裂方式，特点是染色体复制一次，细胞分裂两次，形成4个子细胞，每个子细胞染色体数目减半。

经过受精作用后，染色体数目恢复，这样在物种延续过程中保证了遗传的相对稳定性和基因的多样性。

三、实验仪器、材料和试剂1.仪器、用具：眼科镊子、解剖针、刀片、吸水纸、显微镜、载玻片、盖玻片；2.材料：普通小麦(Triticum aestivum，2n=2x=42)或黑麦（Secale cereale，2n=2x=14）、大麦(Hordeum sativum，2n=2x=14)的幼穗（旗叶叶枕与幼穗顶部距离3～5cm，穗长约6～8cm）；或大葱（Allium fistolosum，2n=2x=16）花序（外包绿色总苞者，长2～3cm）；或玉米(Zea mays，2n=2x=20)幼穗（雄穗）。

3.试剂：苯酚品红、醋酸洋红。

注：以下染色剂的配制① 1％醋酸洋红（aceto carmine）：酸性染料，适用于压碎涂抹制片，能使染色体染成深红色，细胞质成浅红色。

配方：洋红1g ； 45％醋酸100ml。

煮沸2h左右，并随时注意补充加入蒸馏水到原含量，然后冷却过滤，加入4％铁明矾溶液1～2滴（不能多加，否则会发生沉淀），放入棕色瓶中备用。

②改良苯芬品红染色液（Carbol fuchsine）核染色剂。

配制步骤：先配成三种原液，再配成染色液。

原液A：3g碱性品红溶于100ml 70％酒精中。

原液B：取原A液10ml加入到90ml 5％石炭酸水溶液中。

原液C：取原B液 55ml，加入6ml冰醋酸和6ml福尔马林（38％的甲醛）。

（原液A和原液C可长期保存，原液B限两周内使用）染色液：取C液10～20ml，加45％冰醋酸80～90ml，再加山梨醇1～1.8g，配成10％～20％浓度的石炭酸品红液，放臵两周后使用，效果显著（若立即用，则着色能力差）。

《细胞生物学》实验指导目录实验一细胞大小测定和生物绘图法（验证性）2实验二细胞中过氧化物酶的显示（验证性）2实验三细胞内糖类的显示（验证性）2实验四细胞Feulgen反应（验证性）2实验五动物细胞培养（综合性）4实验六细胞膜通透性的观察和细胞活力测定（创新性）4实验一细胞大小测定和生物绘图法一、实验目的1. 掌握用测微尺测定细胞大小的原理和方法。

2. 掌握生物绘图的基本方法。

二、实验原理（一）测微尺的原理测微尺分物镜测微尺（简称物微尺或台微尺）和目镜测微尺（简称目微尺），两尺配合使用，可以测量细胞大小。

目微尺是一个可以放在目镜内的特制玻璃圆片，圆片中央刻有一条直线，此线分为若干格。

物微尺为一载玻片中央封固的小尺，长1mm，被等分为100格，长为0.01mm（10um）。

当测量细胞大小时，不能用物微尺直接测量细胞，而只能使用目微尺。

因目微尺测量的细胞是经物镜放大后的像，而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变，在测量时需要先用物微尺来测定，求出某一放大率时目微尺每格所代表的实际长度，然后再用以测定细胞大小。

将物微尺放在显微镜的载物台上，小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度：物测微尺格数目微尺每格所代表的实际长度= ×10um目测微尺格数例如：目微尺是100倍，其对应的物微尺使80格，则目微尺每格所代表的实际长度为80/100=8um。

测量某一细胞时，如果目微尺测得其横径为5倍，则此细胞横径为8×5=40um。

（二）生物绘图的基本要求1. 具有高度的科学性，不得有科学性错误。

形态结构要准确，比例要正确，要求真实感，立体感，精美而美观。

2. 图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。

3. 绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。

4. 绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。

《细胞生物学》重点讲义第1章—绪论1、概念：细胞生物学2、9世纪自然科学的“三大发现”：细胞学说、能量转化与守恒定律、达尔文进化论第2章—细胞基本知识概要1、概念：细胞2、如何理解细胞是生命活动的基本单位？3、病毒的结构及其增殖过程？第3章—细胞生物学研究方法略第4章—细胞膜与细胞表面1、概念：细胞膜、生物膜、细胞连接、胶原2、生物膜的基本结构特点是什么？这些特征与它的生理功能有什么关系？3、细胞连接有哪几种类型？各有何功能？第5章—物质的跨膜运输与信号传递1、概念：协同运输（共运输与对向运输）、细胞通讯、细胞识别、细胞信号通路、分子开关蛋白2、物质的跨膜运输方式与哪些？各有什么特点？3、Na+-K+泵的工作原理？4、胞饮作用与吞噬作用的比较？5、细胞有哪些方式进行通讯？各种方式之间有何不同?6、细胞有哪几种方式通过分泌化学信号进行细胞间相互通讯?第6章—细胞质基质与细胞内膜系统1、概念：蛋白质分选、信号肽、共转移、后转移2、信号假说的主要内容？第7章—细胞的能量转换—线粒体和叶绿体1、概念：呼吸、呼吸链、光合作用、光反应中心2、线粒体各结构上的标志酶分别是什么？3、光合作用的过程4、线粒体的氧化磷酸化与叶绿体的光合磷酸化的异同点5、氧化磷酸化偶联机制的化学渗透假说的内容第8章—细胞核与染色体1、概念：核孔复合体、染色体、染色质、核小体、常染色质、异染色质（结构异染色质和兼性异染色质）、2、核孔复合体的功能3、染色体DNA的三种功能元件第9章—核糖体略第10章—细胞骨架1、概念：细胞骨架、细胞核骨架2、微管和微丝的特异性药物第11章—细胞增殖及其调控1、概念：细胞周期、检验点、细胞周期同步化、联会、二价体、四分体、2、细胞周期中各个时期及其主要事件（包括有丝分裂和减数分裂）第12章—细胞分化与基因表达调控1、概念：细胞分化、细胞癌变、转分化、去分化、再分化、再生、细胞全能性、癌基因、抑癌基因2、细胞分化的影响因素3、癌细胞的基本特征4、良性肿瘤与恶性肿瘤的区别第13章—细胞衰老与凋亡1、概念：细胞衰老、Hayflick界限、细胞凋亡、细胞坏死2、细胞衰老的特征3、细胞凋亡的特征4、细胞凋亡与细胞坏死的区别。

细胞生物学实验技术实验医学研究中心编订2013-08实验一实验准备【目的】了解组织培养中实验器材的处理过程。

【概述】目前多数的实验室还达不到用后即弃的条件，常要反复使用一些器皿，在组织细胞培养中器材的清洗、消毒灭菌仍是重要环节，是一项繁重而艰苦的工作,而且工作量很大, 其主要目的是去除器皿上杂质及其对细胞生长有影响的物质及各种微生物。

【材料】1.玻璃器皿：培养瓶，血清瓶，试管，吸管2.塑料器皿：枪头，EP管【操作步骤】（一）玻璃器皿的处理玻璃器皿用于培养细胞、细胞冻存、培养用液的存放等。

提供细胞生长的玻璃表面不但要清洁干净，而且要带适当电荷。

苛性碱清洗剂会使玻璃表面带的电荷不适于细胞附着，需以HCL或H2SO4中和。

清洗玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，且不能残留任何毒性物质。

为了保证清洗的质量，一般玻璃器皿的处理分为六个个步骤。

1.浸泡：新的玻璃器皿首先用自来水初步刷洗，5％稀盐酸溶液中浸泡过夜。

使用过的玻璃器皿用1‰的新洁尔灭或清水浸泡。

泡时应将器皿完全浸入水中，使水进入器皿内而无气泡空隙遗留。

2.刷洗：一般多用毛刷和洗涤剂或洗衣粉进行洗涤，以去除器皿内外表面的杂质。

3.浸酸：酸就是清洁液，由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水桉一定比例配制而成,具有很强的氧化作用，去污能力很强，对玻璃器皿无腐蚀作用。

经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的未刷洗掉的微量杂质可被4.流水灌满、倒掉，须重复十次以上，然后，再用蒸馏水漂洗2～3次，最后用三蒸水漂洗一次。

烤箱内烘干备用。

5.包装：包装的目的是防止消毒灭菌后再次受到污染，所以经清洗烤干的器材应严格包装后再进行消毒灭菌处理。

6.消毒灭菌：包括干热消毒和湿热消毒。

干热消毒一般在烤箱中进行，主要用于消毒玻璃器皿，需加温到160℃，保持90～120min方能杀死芽孢。

湿热消毒是一种有效的消毒方法,一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。

因物品不同，其有效灭菌压力和时间不同，一般物品（如布类、金属器械、玻璃器皿等）消毒的要求是101.33kpa（相当于15磅,121℃）20min，某些培养用液、橡胶制品、塑料器皿等要求为67.55kpa (相当于10磅,115℃)10min。

高等学校实验教材：细胞生物学实验指导
细胞生物学实验指导是提供给高等学校的实验教材，它涵盖了细胞生物学的基本概念和实验技术，可以帮助学生们熟悉细胞生物学的概念，掌握有关实验技术，深入地研究和研究细胞生物学。

细胞生物学实验指导包括了生物化学实验、分子生物学实验以及细胞生物学实验，这些实验可以帮助学生们更加深入地了解细胞生物学的概念，从而提高研究成绩。

生物化学实验主要是研究细胞内的物质的组成、变化和功能；分子生物学实验则是研究细胞内分子的结构和功能；而细胞生物学实验则是研究细胞和细胞之间的关系，以及细胞的形态及其变化。

细胞生物学实验指导中针对每一种实验，都有详细的步骤和图表，以便学生们更好地理解概念，更加准确地完成实验，从而更好地掌握细胞生物学，不断提高研究成绩。

细胞生物学实验指导中还有一些有趣的实验，例如，观察单细胞生物的形态，观察细胞周期，分离细胞核，提取细胞质等，这些实验可以直观地让学生们了解细胞生物学的概念和实验技术，进一步提高研究效率。

细胞生物学实验指导为高等学校的学生提供了一个系统性、实用性的研究平台，让学生们可以更好地研究和研究细胞生物学，进而更好地掌握这门学科，提高研究成绩。

细胞生物学实验讲义吴锦程梁杰编莆田学院环境与生命科学系生物技术专业2021年2月目录1.前言 (3)2. 实验一普通光学显微镜及暗视野显微镜的使用 (4)3. 实验二荧光和相差显微镜及其使用.............. .164. 实验三细胞膜的渗透性.................................................. .235. 实验四细胞凝集反响...................................................... .276. 实验五叶绿体的别离与荧光观察 (29)7. 实验六线粒体与液泡的超活染色与观察 (32)8. 实验七酸性磷酸酶的显示方法(选做〕....................... .369. 实验八植物细胞原生质流动及其影响因素(选做〕 (39)10. 实验九植物细胞骨架的观察(选做〕 (41)前言细胞生物学是当前生命科学中核心学科之一，也是重要的专业根底课，其理论与实验技术已广泛地用于研究细胞的形态结构、基因表达与克隆、病毒、细菌、胚胎发育、远缘杂交、人类疾病的发病机制、药物机理等领域，随着分子生物学的研究渗入，分子细胞生物学也得到了突飞猛进的开展。

目前许多综合大学、农业、医学及药科大学把细胞生物学作为本科生和研究生的必修课或根底理论课，同时也开设了专门的细胞生物学实验课，学生们通过实验，进一步地加深了对理论课的理解，也为今后的专业实验课和毕业论文实验奠定了根底。

本讲义精心选择了细胞生物学中的常规实验，作为教材面向本系生物技术专业本科生进行讲授。

实验一普通光学显微镜及暗视野显微镜的使用一、实验目的1. 强化普通光镜结构和使用技能的知识，掌握让其发挥最正确效能的方法。

2. 了解暗场显微镜的构造和原理，并掌握它们使用方法。

二、实验用品1. 材料与标本：载玻片、盖玻片、牙签，香柏油、生物永久装片、擦镜纸、洋葱。

细胞生物学实验讲义细胞内DNA和RNA的显示一、目的要求1、掌握显示细胞内DNA和RNA的方法。

2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布位置。

二、实验原理核酸是酸性的，它们对于碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力。

利用这两种染料的混合液处理细胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色，这种颜色上的差异由DNA 和RNA聚合程度的不同所引起，因为甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色；而派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA相结合使其染成红色。

这样细胞中的DNA和RNA可被区别开来。

三、器材与试剂1、器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、注射器。

2、材料：鸡血。

3、试剂：0.2mol/L醋酸缓冲溶液、2%甲基绿染液、1%派洛宁染液、甲基绿·派洛宁混合染液。

4、试剂的配制（1）2mol/L醋酸缓冲溶液：用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中，混匀。

再称取醋酸钠（NaAC·3H2O）2.72g 溶于100ml蒸馏水中，使用时按2：3的比例混合两液即成。

（2）2%甲基绿染液：称取 2.0g去杂质甲基绿溶于100ml0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中即成。

甲基绿粉中往往混有影响染色效果的甲基紫，它们必须预先除去，其方法是将甲基绿溶于蒸馏水中，放在分液漏斗中加入足量的氯仿（三氯甲烷）用力振荡，然后静置，弃去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重复数次，直至氯仿中无甲基紫为止，最后放入40 C温箱中干燥后备用。

（3）1%派洛宁染液：称取1g派洛宁（吡罗红）溶于100ml0.2/L醋酸缓冲溶液中混匀。

（4）甲基绿派洛宁混合染液：将2%的甲基绿液和1%的派洛宁液以5：2的比例混合均匀即可。

该液应现配现用，不宜久置。

四、内容与方法1、取鸡血一小滴在干净的载玻片一端，用另一载玻片的一端紧贴血滴，待血液沿其边缘展开后，以30~400角向玻片的另一端推去，制成较薄的血涂片，室温下晾干。