粗糙型布鲁菌激活四型分泌系统诱导巨噬细胞死亡的分子机制
研究
布鲁菌是人畜共患布鲁菌病的病原菌,主要引起动物流产和人的波状热。
布鲁菌的毒力主要体现在入侵吞噬细胞并在胞内存活和复制的能力。
布鲁菌侵入宿主细胞后通过表达一系列的毒力相关因子来完成胞内存活和复制过程,脂多糖（LPS）和Ⅳ型分泌系统（T4SS）是布鲁菌最为关键的两个毒力相关因子。
根据LPS的完整性,将布鲁菌分为光滑型（S型）和粗糙型（R型）。
R型布鲁菌能够诱导巨噬细胞死亡,并且该过程依赖于T4SS。
然而,R型布鲁菌致死巨噬细胞的分子机制还不清楚。
本研究利用Luciferase报告基因、Western blotting、qPCR等方法对其进行了探究,并且利用Label-free蛋白组学技术对T4SS关键效应蛋白进行筛选鉴定。
本研究中,为确定T4SS在R型布鲁菌ΔrfbE致死巨噬细胞中的作用,我们利用FITC-Annexin V/propidium iodide双荧光染色法和检测乳酸脱氢酶释放量两种方法对S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123感染巨噬细胞后的细胞毒性分别进行定性和定量检测。
结果显示,R型布鲁菌ΔrfbE诱导巨噬细胞死亡依赖于T4SS。
为探究T4SS 在ΔrfbE致死巨噬细胞中的作用,构建T4SS分泌蛋白BPE123和VceC的融合Luciferase报告菌株对S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123的T4SS分泌水平进行检测,结果表明ΔrfbE融合蛋白BPE123-Luc或Luc-VceC的分泌水平明显高于S2308。
进一步对S2308和ΔrfbE的T4SS表达差异分别用qPCR和Western blotting 进行检测,结果显示,在TSB、酸性和营养匮乏条件下,R型布鲁菌ΔrfbE的T4SS
表达量显著高于S型布鲁菌S2308。
T4SS启动子virB的Luciferase报告菌株的检测结果表明,ΔrfbE的virB启动子活性显著高于S2308。
上述试验结果表明,T4SS的表达和分泌能力在R型布鲁菌中显著高于S型布鲁菌。
为探究R型布鲁菌ΔrfbE T4SS上调表达的原因,我们利用qPCR分析了T4SS 的调控相关基因的转录水平。
结果显示,与S2308相比,ΔrfbE的VjbR上调表达,MdrA和BlxR下调表达。
为确定VjbR、MdrA和BlxR在ΔrfbE致死巨噬细胞中的作用,构建了ΔrfbE的VjbR缺失株以及MdrA和BlxR的过表达菌株,并对这些菌株的细胞毒性进行了定性和定量检测。
结果表明,ΔrfbE缺失VjbR后不再具有细胞毒性;ΔrfbE过表达BlxR后细胞毒性显著降低;但ΔrfbE过表达MdrA后细胞毒性仍然很强。
为研究VjbR和BlxR对T4SS的调控作用,我们利用qPCR分析了ΔrfbEΔvjbR和ΔrfbE（pBlxR）菌株的virB4的表达水平。
结果显示,VjbR对ΔrfbE的T4SS过表达起到了关键的作用,而BlxR只起到了一定的作用。
R型布鲁菌激活巨噬细胞凋亡或焦亡与细胞内质网压力应激IRE1α信号通路相关,为探究R型布鲁菌ΔrfbE的T4SS分泌上调对内质网应激的影响,利用Western blotting鉴定了S2308和ΔrfbE感染巨噬细胞后IRE1α磷酸化（p-IRE1α）水平。
结果显示,与S2308相比,ΔrfbE引起更强烈内质网应激。
运用p-IRE1α专性抑制剂4μ8c处理细胞后检测ΔrfbE对巨噬细胞毒性。
结果显示,抑制p-IRE1α后ΔrfbE对巨噬细胞的毒性显著降低。
该系列结果表明,R型布鲁菌通过VjbR上调和BlxR下调表达协同调控T4SS的转录并激活
IRE1α信号通路致死巨噬细胞。
我们对S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123进行了差异分泌蛋白质组学分析,以期筛选到致死巨噬细胞中起到关键作用的T4SS效应蛋白。
将三个菌株在RPMI-1640营养缺乏培养基中诱导8 h制备分泌蛋白样品,发现R型布鲁菌的蛋白分泌量明显高于S型布鲁菌。
质谱分析共鉴定肽段数9020个,蛋白质组数1131个。
GO分析发现,差异蛋白主要参与细胞过程和代谢过程等重要的生物学过程,集中分布在细胞和细胞组分,具有催化活性和结合活性的分子功能。
KEGG分析发现,差异蛋白主要位于氨基酸的生物合成、双组份系统、碳代谢、嘌呤代谢、核糖体、NOD样受体信号通路、细菌分泌系统等重要通路。
运用细菌的定向缺失和过表达技术分析了差异分泌蛋白对S型和R型布鲁菌细胞毒性的影响,结果显示,OmpW蛋白（BAB1<sub>1</sub>579）和假定蛋白
（BAB1<sub>1</sub>185）与布鲁菌的细胞毒性密切相关。
同时,我们发现R型布鲁菌ΔrfbE致死巨噬细胞与其T4SS的组分无关,而是T4SS分泌的某些效应蛋白起到了关键作用。
综上所述,本研究揭示了R型布鲁菌ΔrfbE通过上调表达VjbR和virB操纵子的转录而导致T4SS的过表达并分泌过量的T4SS效应蛋白,在VceC、OmpW蛋白（BAB1<sub>1</sub>579）和假定蛋白（BAB1<sub>1</sub>185）等多种分泌蛋白的作用下过激活p-IRE1α引起内质网压力应激最终导致巨噬细胞死亡。
本研究为粗糙布鲁菌诱导巨噬细胞死亡的分子机制提供了新的见解。
