质粒消除方法及消除效果的评价研究

利用连续传代法去除质粒实验目的：利用连续传代法使质粒丢失，以便进行下一步的基因敲除实验。

具体实验方案如下：1、首先需鉴定我公司的菌种是否为营养缺陷型菌株。

取Lysine单菌落，在基本琼脂培养基上划线，37℃培养，每天观察菌体生长情况，如果该菌能在基本培养基上生长，则确定该菌为非营养缺陷型，如果不能在基本培养基上生长，则可以确定该菌为营养缺陷型菌株。

如果鉴定Lysine菌为营养缺陷型，那么需要确定它是哪种氨基酸缺陷型，鉴定的具体方案如下：（1）挑取Lysine单菌落接种于5ml LB（含有25 μg/mL卡那霉素）液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养30h。

（2）取1.5mL培养液于离心管中，12000rpm离心5min，弃去上清液，菌体用生理盐水洗涤2次，打匀管底菌团，每次12000rpm离心5min，最终悬浮于1.5mL生理盐水中，取1ml菌悬液涂布于基本琼脂培养基上，在培养皿的中央分别放置蘸有5g/L苏氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸+蛋氨酸和以上五种氨基酸混合液的滤纸片，37℃温箱中培养，定期观察，若某种氨基酸周围有生长圈，即表明为该类营养物质的营养缺陷型菌株。

如果鉴定出Lysine菌为某种氨基酸营养缺陷型，那么在后续用的基础培养基中均需加入该氨基酸以确保菌体能够生长。

2、连续传代首先，以时间为横坐标，菌液OD值为纵坐标做一条菌体生长曲线，具体步骤如下：（1）配置牛肉膏蛋白胨液体培养基（2）按一定量分装到试管里（需要13*3支，3支一组），灭菌。

（3）冷却后取Lysine菌悬液，用移液枪分别接种到试管培养基中(接种比列同大发酵罐)（4）把12组放入37度摇床培养，另一组马上测OD600值，三个值取平均数，偏差太大者舍去（5）在2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时后分别测定其他组的OD值。

（6）将得到的值做图，确定对数生长中期所对应的时间。

然后挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基，在37℃以200 r/min振荡培养使Lysine菌达到对数生长中期，取50 μL菌液转接到5 mL无抗性的基本液体培养基中，37 ℃震荡培养。

中药对细菌R 质粒消除作用的研究概况韩伟1,张铁2,钟秀会1(1.河北农业大学动物科技学院,保定　071001;2.河北农业大学中兽医学院,定州　073000) 中图分类号:S 853.74 文献标识码:B 文章编号:167127236(2006)0820052203 质粒是细菌内染色体外具有独立复制能力的对细菌生存非必需的小型共价闭合环状双链DNA 分子,作为遗传因子,在细菌细胞内普遍存在。

细菌的某些表型特征,包括抗性、代谢能力、致病性、共生现象、接合转移等往往由质粒控制(吴乃虎等,1998)。

细菌质粒包括F 因子(fertility facto r )、R 因子(re 2sistance facto r )、Co l 因子(co liconogen ic facto r )、T i 因子(tum o r inducing p las m id )、巨大质粒(m ega 质粒)和降解性质粒等。

其中R 因子又称为R 质粒,R 质粒上携带着耐药基因,赋予了细菌对某些抗生素收稿日期:2005212207作者简介:韩伟(1980-),女,河北人,硕士生,主要从事中草药防治畜禽传染病方面的研究。

通讯作者:钟秀会。

的耐药性。

R 质粒能以接合、转化、转导等方式在菌株之间以较高的频率转移(M azodier 等,1989;Farrar 等,1983;M azadier 等,1991),由耐药菌株转移到敏感菌株;在细胞分裂时,R 质粒也同时进行复制而使子细菌也带有耐药质粒,从而使抗药性能够以更快的速度传播。

R 质粒可自宿主细菌内自发消除,但很缓慢,其消除频率为10-2～10-8(李苌清等,2003)。

自20世纪60年代以来,发现各种理化因素均可消除质粒,如高温培养、紫外线照射、电穿孔法、SD S (刘金华等,2000)、高温SD S 双重处理(黄艳飞等,2004;刘皈阳等,2001),溴化乙锭(林健梅等,1998)、吖淀橙(刘春等,2003)等可影响质粒消除,抗生素也具有质粒消除作用(A ooper 等,1984;W eisser 等,1986;谢一俊　Am erican Book s Inc ,1995,186.12Ghadially F N .U ltra structure patho logy of the cell and m atrix(2nd ed )[M ].Butter wo rth s ,1982,149.13M ak iko S F ,H enning U ,O t ávia L C ,et al .Facile D etecti on of M itochondrial DNA M utati ons in T umo rs and Bodily F luids [J ].Science ,2000,287:2017～2019.14M erkel I S ,Good C B ,N ales m ik M ,et al.Ch ronicPneumocystiscarinh infecti on of the liver .A case repo rt and review of the literature [J ].C lin Gastroentero l ,1992,15:55～58.15R adovanovic J ,Todo rovic V ,Bo ricic I ,et al .Comparativeultrastructural studies on m itochondrial patho logy the liver of AD IS patients :clusters of m itochondria ,p ro tuberances ,“m ini m itochondria ”,vacuo les ,and virus 2like particles [J ].U ltrastruct Patho l ,1999,23:19.16Shap iro S H ,K lavins J V .Concentric m em branous bodies andgiant m itochondria in hepatocytes from a patient w ith A I D S [J ].U ltrastruct Patho l ,1993,17:557～563.The Ultra structure Change of M itochondr i a and M itochondr i a D isea sesPEN G J ie ,GUAN T ao ,GAO Hong(D epartm ent of A ni m al Science and T echno logy ,Yunnan A griculture U niversity ,Kunm ing 650201,Ch ina )Abstract :T he m itochondria is a comp licated ,at the sam e ti m e a sensitive and changeable o rganelle .T he change in the cell ,o ther environm ental facto r ,usually cause m itochondria structure and functi on’s abno r m ality ,so the research about its ultra structure patho logical change and physi o logical functi on has been constant all the ti m e ,and developm ent is fast ,its result of study is often regarded as the index of the m edical diagno sis on disease on clinic .F ind m itochondria ultra structure patho logical change and physi o logical usually have relati on among A I D S ,cancer ,heart disease ,etc .w ith different disease functi on already now .Study m itochondria ultra structure patho logical change to si m p lify step of diagno sing ,judgepatho logical change nature ,analyze cause of disease ,treat and esti m ate p rogno sis ,etc .there are i m po rtant m eanings to p robe into .T he fo llow ing text m ainly carry on the survey from ultra structure patho logical change ,m itochondria disease .Key words :m itochondria ;ultrastructure ;patho logical change ;m itochondrial disease・25・疾病防治中国畜牧兽医　2006年第33卷第8期等,1998;Gun ics,2001)。

第27卷第1期青海大学学报(自然科学版)Vo l 127No 112009年2月Journa l of Q ingha i U niversi ty(Na ture Science)Feb 120093种中药对产酶菌R 质粒消除作用的研究杜银忠(青海大学农牧学院,青海西宁810003)摘要:用煎煮法制备的黄芩、黄连和鱼腥草中药原液,在对产β-内酰胺酶金黄色葡萄球菌测定最小抑菌浓度的基础上进行了耐药质粒(R 质粒)消除试验,并用美国国立临床实验室标准化委员会颁布的标准进行消除效果的判定。

结果表明:黄芩、黄连和鱼腥草3种中药原液对2株产β-内酰胺酶金黄色葡萄球菌耐药质粒具有不同程度的消除作用,消除率分别达到15127%、14158%和6125%及5156%、0100%和3147%。

关键词:中药原液;β-内酰胺酶;质粒中图分类号:Q949195;S85216文献标识码:A文章编号:1006-8996(2009)01-0078-04E li m i na t i on effects of thr ee C h i n ese her b s onR p l a s m i d of en zym e pr oduc i n g fun g iD U Y i n -zhong(College of Agricultu re and Ani m a l H usbandry,Q ingha i Un iversity,X ining 810003,China )A bstr a ct:S olution s p repared fr om ba ica lin,be rbe rine and houttuynia by decoction we re used to te st the ir eli m ination effec ts on r e sistance p las m id (R p las m id )of β-lacta m a se Staphylococcus aureus based on the m ini m um inh ibitory concentrat i on 1The crite ri on was referenced the U 1S 1N ationa l Comm itteef orStandardiza tionp r om ulgatedstanda rdsf o rjudg m ent ofe li m ina tion 1The results showed the three C hinese m ed icine,baicalin,berberine and houttuyn ia,had diffe rent eli m ination effec ts on resistance p las m id of t wo β-lac tama se golden Staphylococcus aureuse s and the e li m ina tion rate wa s 15127%,14158%,6125%,5156%,0100%and 3147%,respect ively 1Key wor ds:Chinese herb;β-lacta m a se;p las m id;e li m ina tion任何一种抗生素在临床用药时都会出现一种现象,即在它刚开始投入使用时,既能杀菌,又能消除细菌的耐药质粒,表现出良好的临床防治效果,若与细菌长时间接触后,它又成为诱导细菌产生耐药性或多重耐药性的诱导物,使其杀菌效率明显降低,甚至消失。

利用连续传代法去除质粒实验目的：利用连续传代法使质粒丢失，以便进行下一步的基因敲除实验。

具体实验方案如下：1、首先需鉴定我公司的菌种是否为营养缺陷型菌株。

取Lysine单菌落，在基本琼脂培养基上划线，37℃培养，每天观察菌体生长情况，如果该菌能在基本培养基上生长，则确定该菌为非营养缺陷型，如果不能在基本培养基上生长，则可以确定该菌为营养缺陷型菌株。

如果鉴定Lysine菌为营养缺陷型，那么需要确定它是哪种氨基酸缺陷型，鉴定的具体方案如下：（1）挑取Lysine单菌落接种于5ml LB（含有25 μg/mL卡那霉素）液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养30h。

（2）取1.5mL培养液于离心管中，12000rpm离心5min，弃去上清液，菌体用生理盐水洗涤2次，打匀管底菌团，每次12000rpm离心5min，最终悬浮于1.5mL生理盐水中，取1ml菌悬液涂布于基本琼脂培养基上，在培养皿的中央分别放置蘸有5g/L苏氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸+蛋氨酸和以上五种氨基酸混合液的滤纸片，37℃温箱中培养，定期观察，若某种氨基酸周围有生长圈，即表明为该类营养物质的营养缺陷型菌株。

如果鉴定出Lysine菌为某种氨基酸营养缺陷型，那么在后续用的基础培养基中均需加入该氨基酸以确保菌体能够生长。

2、连续传代首先，以时间为横坐标，菌液OD值为纵坐标做一条菌体生长曲线，具体步骤如下：（1）配置牛肉膏蛋白胨液体培养基（2）按一定量分装到试管里（需要13*3支，3支一组），灭菌。

（3）冷却后取Lysine菌悬液，用移液枪分别接种到试管培养基中(接种比列同大发酵罐)（4）把12组放入37度摇床培养，另一组马上测OD600值，三个值取平均数，偏差太大者舍去（5）在2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时后分别测定其他组的OD值。

（6）将得到的值做图，确定对数生长中期所对应的时间。

然后挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基，在37℃以200 r/min振荡培养使Lysine菌达到对数生长中期，取50 μL菌液转接到5 mL无抗性的基本液体培养基中，37 ℃震荡培养。