2012高二生物同步课件：5.3 血红蛋白的提取和分.

②配制：1-2种缓冲剂+蒸馏水(调节缓冲剂的 比例可以得到不同pH范围内使用的缓冲液)。
③举例：H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等， 本实验使用的是磷酸缓冲液NaH2PO4/Na2HPO4。
二、实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步：
样品采集
➢ 样品处理
红细胞的洗涤 血红蛋白的释放
3.在血红蛋白分离过程中如果红色带区歪曲、 散乱、变宽，与其有关的是 ( B ) A．凝胶色谱柱的制作 B．色谱柱的装填 C．洗脱过程 D．样品的处理
充分搅拌10分钟 (磁力搅拌器)
甲苯：溶解红细胞的细胞膜
4.分离血红蛋白溶液
混合液
离心管
2000r/m 10分钟
溶液分层
甲苯层(无色透明) 脂溶性物质沉淀层(白色薄层固体)
血红蛋白水溶液层(红色透明液体)
杂质沉淀层(暗红色)
滤纸过滤→分液漏斗中静置→分出红色透明液体
5.透析 ①透析袋：玻璃纸(常用)、肠衣、膀胱膜等 ②原理：小分子自由进出，大分子留在袋内
③作用：除去样品中的小分子杂质， 或用于更换样品的缓冲液。
④作用：20mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0),12h
6.凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米,内径1.6厘米的玻璃管,两端磨平
柱高度会影响分离效果，一般不超过1米，高度 不足会导致达不到分离效果。柱直径不影响效 果，但直径过大会造成洗脱液体积增加，样品 稀释度过大，实验现象不明显，应不超过2cm。
4.你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的 色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？
①凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检 查凝胶是否装填均匀；②加入大分子有色物质， 例如蓝色葡聚糖-2000或红色葡聚糖，观察色 带移动的情况。

血液组成成分 阅读思考： 血浆 血细胞 1. 血液由 ______ 和________两部分组成。
2. 血细胞中_______ 红细胞 细胞数量最多，细胞的含量最 血红蛋白 高的有机化合物是 _____________。 条β -肽链 构 2条α-肽链 3. 该化合物是由 _____________ 和2 ____________ 成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和 亚铁血红素 CO2结合的 ______________________基团。
2）材料：凝胶
凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。 内部有许多贯穿的通道.
混合物 上 柱
洗 脱
大分子流动快 小分子流动慢
收 集 大分子
收 集 小分子
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。
2．凝胶电泳法： 电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 1）原理： 不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、 形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、 阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运 动速度不同。 思考：蛋白质为什么带有电荷？ 在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷
人教版选修1
专题5 DNA和蛋白质技术
课题3 血红蛋白的提取和分离
一、基础知识：
（一）蛋白质提取和分离原理
（二）蛋白质提取和分离的方法
1、凝胶色谱法：又称分配色谱法
2、电泳法
（三）缓冲溶液
二、实验操作－－实验步骤 样品处理 和粗分离 血液组成成分
1.洗 涤 红 细 胞 纯 化 2.释放血红蛋白
3.分离血红蛋白 纯度鉴定 4.透析血红蛋白
2、凝胶色谱柱的装填
材料：交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液 “G”表示什么？75代表什么？

血红蛋白的提取和分离
课题背景
蛋白质是生命活动不可缺少的物质。对蛋白质的研究与应用， 首先需要获得纯度较高的蛋白质。3月2日14时14分上海交通大 学陶生策研究团队完成了首款新型冠状病毒蛋白质组芯片的构 建。包含新型冠状病毒（SARS-CoV-2）绝大多数的蛋白质 本课题的实验理想的材料又是什么？原因是？ 人、猪、牛、羊等哺乳类动物成熟的红细胞无细胞核，结构简 单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。
①琼脂糖凝胶电泳广泛应用于核酸的研究中，用于分离大分子核酸（DNA）。 ②SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳则广泛应用于分离蛋白质和相对分子质量较小的核酸。
带电性质、分子大小和形状的 不同，使分子迁移速度不同 加入待分 离的样品
极阴
阳极
溶
液
槽
琼
脂
分子向阳极移动 缓冲液
胶
凝胶电泳原理示意图
电泳槽
三、实验操作： 蛋白质（血红蛋白）提取和分离步骤 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
3、样品的加入和洗脱 注意：洗脱过程不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否 则重新填装。
缓冲 液
色谱柱成功标志： 红色区带均匀一致地移动
（三）血红蛋白纯度鉴定方法：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。
血红蛋白的提取和分离各操作的主要目的
操作 红细胞的洗涤 血红蛋白的释放
分出下层的 红色透明液体
滤纸 过滤
转 移
静置 片刻
血红 蛋白
烧杯
分液漏斗
4、透 析（粗分离）目的：只能除去样品中分子量较小的杂质，将蛋
白质与小分子杂质，不能将不同各种蛋白质分离（纯化：凝胶色谱法） ①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有 300ml的物质的量浓度为20mmol/l的pH为7.0磷酸缓冲液中，透析12 小时。 ②原理：透析袋能小分子使自由进出，而将大分子蛋白质保留在袋内。

〔2〕目的： 去除杂蛋白
思考：①柠檬酸钠作用？ 防止血液凝固
②生理盐水作用？ 维持红细胞渗透压稳定
1.红细胞的洗涤：
注意：洗涤次数、离心速度、离心时间。
洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高、 时间过长会使白细胞一同沉淀，达不到别离效果
流程：样品处理—>粗别离—>纯化—>纯度鉴定 2 .血红蛋白的释放：
红
蛋 凝胶色谱法 白 凝胶电泳法 的
原理
分离过程
提
缓冲溶液
组成
作用
取
和
别 离
蛋白质的
样品处理
提取别离
粗分离
纯化
纯度鉴定
5下面关于对血红蛋白提取和别离的样品的处 理措施中，正确的选项是 BC(D )多
A．采集血样后要高速短时问离心获得血细胞
B．洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗 涤次数，否那么血浆蛋白无法除净。
C．在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释 放出血红蛋白
D．释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血 红蛋白和其他杂质别离开来
50cm高
〔三〕纯化——凝胶色谱法
3.样品的参加和洗脱 注加意样：时洗注脱意过 ：程①不使能吸发管生管洗口脱沿液管流壁干环，绕露移出动凝胶颗粒的现 象②，贴否壁那加么样重新③填不装要。触及破坏凝胶面
1.调液面
2.加样 3.再调液面
4.洗脱
5.收集
缓冲液 凝胶
7.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因
注意：也可将凝胶放在洗脱液中膨胀，为了加速膨 胀，可将参加洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，不但 节约时间，还能除去微生物及排除胶粒内的空气。
〔三〕纯化——凝胶色谱法
〔3〕凝胶色谱柱的装填方法 ①固定：将色谱柱处置固定在支架上

纯度鉴定：一般用__S_D__S_—__聚__丙__烯__酰__胺__凝__胶__电__泳___方法来测定蛋白质的纯度
2.凝胶色谱操作 凝胶色谱柱的制作 ↓ 凝胶色谱柱的装填：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入 凝胶色谱柱内 ↓
平齐
凝胶床内
色谱柱底端
顶端
|过程评价| 1.凝胶色谱法和电泳法分别利用了蛋白质的相对分子质量的大小和所带电荷性质不同
A.蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向 着与其所带电荷相反的电极移动 B.蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少 C.蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度取决于其相对分子质量的大小 D.电泳结果表明溶液中的蛋白质可能有两种，也可能只有一种 解析 蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带的电荷，故其移 动速度与本身所带电荷多少无关，而由其分子大小决定。SDS可使蛋白质变性形成肽 链，故结果所示可能是一种蛋白质(有两种肽链)，也可能是两种蛋白质。 答案 B
|联想·质疑| ★蛋白质的粗分离
★纯化蛋白质
★血红蛋白含有四条肽链，每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子 氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。
洗涤红细胞和血红蛋白的释放所用的液体分别是什么？ 提示：生理盐水和蒸馏水。
1.凝胶色谱法
科学探究1 蛋白质的分离原理与方法
凝胶色谱法和电泳法的比较
内容 分离依据 分离动力
凝胶色谱法
电泳法
分子带电性质的差异、分子大小、 分子相对分子质量的大小
形状等
重力

身体记忆法小妙招
超级记忆法--故 事法
• 鲁迅本名：周树人 • 主要作品：《阿Q正传》、、 《药》、 • 《狂人日记》、《呐喊》、《孔 乙己》 • 《故乡》、《社戏》、《祝福》（图。片来自网络）
• 阿Q吃错了药，发狂地喊着孔乙
超级记忆法-记忆 方法
TIP1：NPC代入，把自己想成其中的人物，会让自己的记忆过程更加有趣 （比如你穿越回去，成为了岳飞的母亲，你会在什么背景下怀着怎样的心情在 背 上刺下“精忠报国”四个字）；
1.实践是检验真理的唯一标准。前面你可能觉得自己学的都还不错， 那么最 后这步帮你再次验证，也帮你进一步加深理解；
2.把你学到的内容分享给别人； 3.如果别人通过你的语言能比较容易的理解，说明你掌握的还不错； 4.如果你觉得费了九牛二虎之力，别人却依然搞不懂， 除去语言表达等方面的问题，很大的原因是你自己还没搞清楚这个知识；
如何利用规律实现更好记忆呢？
超级记忆法-记忆
规律
记忆后
选择巩固记忆的时间 艾宾浩斯遗忘曲线
超级记忆法-记忆 规律
TIP1：我们可以选择巩固记忆的时间！ TIP2：人的记忆周期分为短期记忆和长期记忆两种。 第一个记忆周期是 5分钟 第二个记忆周期是30分钟 第三个记忆周期是12小时 这三个记忆周期属于短期记忆的范畴。
2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中， 关于蛋白质的叙述，正确的是
A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相 对分子质量较大的蛋白质
B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相 对分子质量较大的蛋白质
C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相 对分子质量较大的蛋白质
D 二者根本无法比较
3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同 蛋白质的电泳迁移率完全取决于

二、实验操作
采集得到猪血
初次离心后的结果
3次洗涤后的结果
二、实验操作
（一）样品处理和粗分离
2.血红蛋白的释放
加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的 甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟 （加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。
目的分析：
①蒸馏水的作用是____使__红__细__胞__大__量__吸__水__胀__裂____。 ②加入甲苯的作用是__溶__解__红__细__胞__的__细__胞__膜______。 ③充分搅拌的目的是__加__速__红__细__胞__的__破__裂_______。
一、基础知识
（三）电泳
3.类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。
蛋白质在聚丙烯酰 胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少 以及分子的大小等因素。
一、基础知识
（三）电泳
3.类型: SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋
白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定 的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成 蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白 质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷 差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
二、实验操作
（二）凝胶色谱操作
1.凝胶色谱柱的制作
2.凝胶色谱柱的装填
3.样品的加入和洗脱
二、实验操作
（二）凝胶色谱操作
1.凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平 ②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，
再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。 注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面， 否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 ③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。 ④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 ⑤安装其他附属结构。

用SDS测定蛋白质分子量得方法
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋 白质得分子量时,可选用一组已知分子量得 标准蛋白同时进行电泳,根据已知分子量得 标准蛋白得电泳区带位置,可以测定未知蛋 白质得分子量。市场上有高分子量、次高 分子量及低分子量得标准蛋白试剂出售。
二、实验操作
(一)蛋白质提取和分离步骤 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
上清液中已没有黄色:红细胞洗涤干净。
洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。
(2)血红蛋白得释放: 加蒸馏水到原血液体积, 加40％体积得甲苯 (溶解细胞膜) 置于磁力搅拌器搅拌10min(加速细胞破裂)
红细胞破裂,释放出血红蛋白
(3)分离血红蛋白溶液:
①过程:将搅拌好混合液转移到离心管内,以2000r/min得速度 离心10 min。
水分
血浆
血
固体物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等
液
白细胞
血细胞 血小板
两个α－肽链
红细胞 血红蛋白 两个β一肽链
（最多） （90％） 四个亚铁血红素基团
血红蛋白得特点: 血红蛋白
两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁血红素基团
每个肽链环绕一个亚铁血红素基团, 此基团可携带一分子O2或一分子CO2, 血红蛋白因含有血红素而 呈红色。
凝胶色谱法
3、提取分离方法
凝胶电泳法
(一) 凝胶色谱法(分配色谱法)
1、概念:
根据被分离物质得蛋白质相对分子质量得 大小,利用具有网状结构得凝胶,来进行分离。
2、凝胶:
大多数凝胶就是由多糖类化合物(如葡聚糖或琼脂 糖)构成得多孔小球体,内部有许多贯穿得通道。
3、凝胶色谱法得原理
①当相对分子量不同得蛋白质通过凝胶时,相对分 子量较小得蛋白质容易进入凝胶内部得通道,路程 较长,移动速度较慢;