我国分子细胞工程技术培育超细毛羊的研究

甘肃超细毛羊胎儿发育中后期毛囊形态发生中Wnt10b、β-catenin及FGF18基因表达研究甘肃超细毛羊是我国特有的优质绒毛动物品种，其细毛具有极高的经济价值。

然而，甘肃超细毛羊的早期胚胎发育和毛囊形态发生的机制尚不清楚。

为了探究毛囊发育的分子机制，本研究以甘肃超细毛羊为研究对象，通过对毛囊形态发生中Wnt10b、β-catenin和FGF18基因表达的研究，揭示了其在胎儿发育的中后期中的重要作用。

首先，我们利用免疫组织化学和原位杂交技术对甘肃超细毛羊中Wnt10b、β-catenin和FGF18基因的表达进行了研究。

结果显示，在胎儿发育的中后期，Wnt10b和β-catenin基因的表达量明显增加，与毛囊发育密切相关。

同时，FGF18基因的表达也呈现出增加的趋势。

这表明Wnt10b、β-catenin和FGF18基因可能在甘肃超细毛羊胎儿的毛囊形态发生中起着重要的调控作用。

进一步的研究表明，Wnt10b/β-catenin信号通路可能参与调控胚胎期毛囊的形成。

我们通过应用Wnt10b和β-catenin抑制剂，发现胚胎期毛囊的形成受到明显的抑制，其数量和发育程度较低。

而对FGF18基因的过表达实验结果则显示，胎儿发育中的毛囊数量和发育程度增加。

这些结果均提示Wnt10b、β-catenin和FGF18基因在调控甘肃超细毛羊胚胎期毛囊发育中起着重要的作用。

此外，我们还进一步研究了Wnt10b、β-catenin和FGF18基因的表达水平与毛囊生长周期的相关性。

结果显示，在毛囊发育和生长周期中，Wnt10b和β-catenin基因的表达量逐渐增加，而FGF18基因的表达量逐渐下降。

这表明Wnt10b和β-catenin基因在毛囊的生长周期调控中起到了促进作用，而FGF18基因则可能起到抑制作用。

这对于深入理解甘肃超细毛羊的毛囊发育和生长机制具有重要意义。

综上所述，甘肃超细毛羊胎儿发育中后期的毛囊形态发生受到Wnt10b、β-catenin和FGF18基因的调控。

受理编号：新疆维吾尔自治区科技计划项目申请书项目名称：新吉细毛羊（超细型细毛羊）综合养殖技术申请项目类型：科技攻关项目申请单位：塔城地区种羊场（公章）推荐部门: 塔城地区畜牧科技研究推广中心（公章）申请人：电话：电子邮箱：联系人：电话：电子邮箱：通讯地址：邮编：起止时间：2016 年 1 月至2017 年12 月申请日期：2015 年10 月14 日填写说明一、《项目申请书》编写要求本申请书为自治区科技攻关（含重大专项）和重点项目计划、自治区高技术研究发展计划、自治区科技成果转化专项资金项目申报的统一的申请书，请严格按要求填写各项内容。

具体要求如下：1. 总体目标集中、明确；研究任务和内容重点突出；所选的技术路线可行；经费预算根据充分；相关证明文件等附件齐全。

2. 内容详实，文字精炼，数据可靠。

外来语要同时用原文和中文表达。

第一次出现的缩写词，须注出全称。

3. 在申请书中引用他人研究成果时，必须以脚注或其他方式注明出处。

对于伪造、篡改科学数据，抄袭他人著作、论文或者剽窃他人科研成果等科研不端行为，一经查实，将根据情节轻重采取相应处罚措施。

4. 填写中篇幅不够的栏目可自行加页。

采用A4幅面复印纸双面印刷，封面纸质同内页，一式三份。

二、相关指标填写要求申请人：指项目组组长或项目主持人。

申请项目类型： 01.重大专项；02.科技攻关项目；03.国际科技合作项目；04.软科学研究项目；05.高技术研究发展项目； 06.科技成果转化专项资金项目。

推荐部门：指项目申请单位所属行业部门或所在地州市科技行政管理部门等具有推荐资格的单位。

单位性质：01.事业型研究院所；02.大专院校；03.政府机关；04.群众团体；05.其他事业单位；06.转制为企业的科研院所；07.国有企业；08.集体企业；09.私营企业；10.联营企业、股份有限公司、有限责任公司、股份合作企业； 11.其他内资企业。

技术来源：01.国外技术；02.中科院及国家部委属科研院所和高等学校；03.区外属科研院所和高等学校；04.区内属科研院所和高等学校；05.区外企业及所属科技机构；06.区内企业及所属科技机构；07.引进技术本单位消化创新；08.自有技术；09.其他。

超细型细毛羊基因组DNA的AFLP检测研究贺三刚;黄锡霞;史洪才;田可川;徐新明;劳荃蘅【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2008(035)007【摘要】利用AFLP标记对超细型细毛羊品系纯度进行检测,旨在为评价该品系细毛羊的遗传特性,采用Taq Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,利用6对引物对24只细毛羊基因组DNA进行分析,共获得226个AFLP标记,1对引物获得的标记数在29～50之间.新吉超细型细毛羊相似系数AFLP研究结果为0.914～0.982,本研究为评价新吉超细型细毛羊遗传稳定系数提供了相关的参数.【总页数】5页(P32-36)【作者】贺三刚;黄锡霞;史洪才;田可川;徐新明;劳荃蘅【作者单位】新疆畜牧科学院农业部家畜繁育生物技术重点开放实验室,乌鲁木齐,830000;新疆农业大学动物科学学院,乌鲁木齐,830052;新疆农业大学动物科学学院,乌鲁木齐,830052;新疆畜牧科学院农业部家畜繁育生物技术重点开放实验室,乌鲁木齐,830000;新疆畜牧科学院畜牧所,乌鲁木齐,830000;新疆畜牧科学院畜牧所,乌鲁木齐,830000;新疆农业大学动物科学学院,乌鲁木齐,830052【正文语种】中文【中图分类】Q75【相关文献】1.山西瘦肉型猪(SD-Ⅲ系)基因组DNA的AFLP和RAPD检测研究 [J], 朱文进;郭传甲;张桂贤2.山西瘦肉型猪(SD-Ⅲ系)基因组DNA的AFLP检测研究 [J], 朱文进;苏咏梅;关学敏;岳文斌;姜玉锁;张美俊;张桂贤;郭传甲3.贵州小型香猪基因组DNA的AFLP检测研究 [J], 吴丰春;魏泓;甘世祥;周建华;马静4.角蛋白26基因在超细型和细型细毛羊皮肤组织中的表达差异 [J], 田月珍;马依拉·吐尔逊;艾买提·买买提;狄江;吴伟伟;田可川;黄锡霞;徐新明;哈尼克孜·吐拉甫;付雪峰;张艳花5.超细型细毛羊新品系AFLP技术体系的建立 [J], 贺三刚;黄锡霞;田可川;史洪才;魏霞;徐新明;张艳花因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

新疆天川华风生物科技发展公司与新疆畜牧科学研究院携手引进国际先进的JIVET(幼畜超排)技术，快速扩繁新疆纯种美利奴超细型绵羊，加快推动自治区超细毛羊产业化发展。

新疆天川华风生物科技发展公司今年初从河北华风国富良种繁育有限责任公司引进纯种超细型美利奴绵羊796只，羊毛细度为16―18微米。

其中公羊355只，母羊441只，这在新疆畜牧史上是第一次大规模引进系谱齐全的纯澳美利奴超细毛羊。

目前，这群羊已基本适应了新疆的饲养环境，已产羔羊39只。

6月7日，天川华风公司与新疆畜牧科学院携手，聘请中国农业大学知名教授，对17只小母羊运用幼畜超排技术，对近200只新疆本地羊进行了胚胎移植，并同时完成了400只空腹母羊的人工受精配种工作，预计到今年底将会有近400只小羔羊诞生。

幼畜超排技术是使4―8周龄的母羔羊进行超数排卵80―100枚，运用试管授精和人造子宫培养胚胎发育成熟后，移植到受体母羊体内继续妊娠，效率是成年羊胚胎生产、移植的3―5倍，生产成本只是成年羊胚胎移植的1/3。

中国高原型细毛羊种质特性探究引言：中国是世界上重要的畜牧业大国之一，养殖业对于国民经济的进步具有重要的增进作用。

中国高原型细毛羊作为中国特有的羊种，在高原地区广泛分布，对于当地人民的肉食和农业进步具有重要意义。

本文旨在探究中国高原型细毛羊的遗传特性、生长发育特点、适应能力以及肉质品质，为该羊种的育种提供科学依据。

一、遗传特性：中国高原型细毛羊的遗传特性是探究该羊种的基础，主要包括繁殖力、生长速度、抗病能力等。

通过对不同地区的中国高原型细毛羊进行探究发现，该羊种繁殖力较强，母羊的繁殖期短，受胎率高。

生长速度方面，该羊种的生长速度较快，能够适应高原地区的恶劣环境。

抗病能力方面，中国高原型细毛羊具有较强的抗疾病能力，对于常见的肺部疾病具有较好的反抗力。

而且，该羊种具有较好的适应性，能够适应高寒地区的寒冷环境。

二、生长发育特点：中国高原型细毛羊的生长发育特点是探究该羊种生产效益的重要因素之一。

该羊种生长迅速，特殊是在高原地区，由于寒冷的气候和丰富的草场资源，可以更好地满足羊的生长需求。

探究发现，中国高原型细毛羊在诞生后迅速增长，1岁时体重能够达到50公斤以上。

此外，该羊种对于饲料的利用率较高，通过合理饲养管理，能够提高其生产性能。

三、适应能力：中国高原型细毛羊在高原地区的适应能力是其奇特之处之一。

由于高原地区气候寒冷，气压低，氧气稀薄，对于动物的生长发育有较大的影响。

中国高原型细毛羊通过长期的自然选择，形成了适应高原环境的奇特特性，例如毛发富有弹性，胸腔较大，心肺功能较强等。

这些特点使得该羊种能够在高原地区以较低的成本获得较高的肉食产值。

四、肉质品质：中国高原型细毛羊肉质鲜美，受到消费者的青睐。

探究发现，该羊种肉质细嫩，脂肪含量适合，肉色红润，口感鲜美。

这些特点使得中国高原型细毛羊的肉品在市场上具有竞争力，备受青睐。

结论：中国高原型细毛羊作为中国奇特的羊种，在遗传特性、生长发育特点、适应能力以及肉质品质等方面具有优势。

2020年第8期 吉林畜牧兽医·草食动物·CaoShi DongWu探讨优质超细毛羊纤维直径选育效果李武臣1，狄 江2，徐新民2*1.新疆新源县巩乃斯种养场，新疆新源 835808；2.新疆畜牧科学院，新疆乌鲁木齐 830011在羊毛纤维试验中，纤维直径是比较重要的性能指标之一，同时也是超细毛羊育种中的关键经济指标，其直接决定了羊毛的纺纱性能及经济价值，还有纤维直径变异系数、标准差等细度变异指数对羊毛纱线和织物的质量也有一定影响。

因此，本文则主要对优质超细毛羊的纤维直径选育效果进行详细探讨。

1 优质超细毛羊品种中国美利奴羊（新疆型）是以澳洲美利奴公羊与新疆细毛羊、波尔华斯羊通过杂交培训而成。

该品种体型呈长方形、体格较大，被毛为白色，且密度比较大，细度在60～70支左右，是目前比较先进的细毛羊品种之一，且羊毛品质及产量已处于世界同类细毛羊的领先水平。

随着我国科研技术的不断提高，我国培育出的一种新型超细毛羊品种-苏博美利奴羊，该品种以进口澳洲美利奴超细型公羊为父本，然后以新吉细毛羊、敖汉细毛羊及中国美利奴羊核心优良品种为母本，采取级进杂交方法，并通过横交、杂交及纯繁等方法而培育出的一种超细毛羊新品种，其羊毛纤维直径在17.0～19.0 µm 之间，具有羊毛品质好、产量高、抗逆性强、适宜放牧及繁殖存活率高等特点。

2 优质超细毛羊养殖基地巩乃斯种羊场属于中国美利奴羊的主要养殖基地之一，位于新疆天山巩乃斯河畔，是中国美利奴羊的原始繁育基地，横跨特克斯、巩留、新源及尼勒克四个县七个区，属于寒温带半干旱大陆性气候，降雨量比较充足。

该草场于2014年开始对苏博美利奴羊进行大量繁殖，而饲养方式以夏季自然放牧，冬春季舍饲为主。

还有为了满足超细毛羊发育需求，一般会根据超细毛羊的喂养标准，来制定严格的饲喂方式，并制定适当的放牧锻炼，以此提高超细毛羊的品质，但其生产性能受环境、温度及饲养方式等非遗传因素影响，会使优质超细毛羊的遗传进展受到混淆或降低。

科技成果——分子标记与频密繁殖提高绵羊产
羔数技术
技术领域
生态养殖产业
技术开发单位
河北省畜牧兽医研究所
成果简介
高繁BMPR1B基因型显著影响绵羊超排卵效果，该基因作为分子标记辅助选种可显著提高绵羊胎产羔数；首次发现小尾寒羊线粒体基因存在三个显著影响产羔数的突变位点。

将上述技术组装集成了分子标记与频密繁殖提高绵羊产羔数技术。

主要技术指标
使羔羊断乳提早到30日龄，母羊断乳后30天发情配种，产羔间隔缩短至7个月，每只母羊年增产1.2只羔羊；采用多胎基因标记技术使小尾寒羊胎平均产羔数由1.93只提高到2.31只，提高0.38只。

技术效果
应用三年五产频密繁殖技术，累计推广基础母羊39.2万只；应用分子标记辅助选种技术，累计推广含有高繁基因的种羊1万只。

三年累计获纯收益14189.96万元。

适用范围
保定、张家口、承德、邯郸、秦皇岛等地山区。

中国畜牧兽医 2024,51(4):1420-1427C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 体细胞克隆技术扩繁超细型二狼山绒山羊的应用研究卿玉波1,2,程 雯1,2,角德灵1,2,刘 城1,3,郝志强4,郭建雄1,李钰莹1,3,张筱琳1,3,李 臻4,5,李效宇4,5,王 文6,魏红江1,2(1.云南省小型猪基因编辑与异种器官移植重点实验室,昆明650201;2.云南农业大学动物医学院,昆明650201;3.云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;4.内蒙古中科正标生物科技有限公司,巴彦淖尔015000;5.内蒙古正标种畜有限公司,巴彦淖尔015000;6.中国科学院昆明动物研究所,昆明650201)摘 要:ʌ目的ɔ通过体细胞克隆技术生产超细型二狼山绒山羊克隆个体,为该技术在地方优质羊品种资源扩繁及新品种培育中的应用提供理论依据㊂ʌ方法ɔ选择1只4岁龄羊绒细度为13.89μm 的二狼山绒山羊(ȶ),采集耳组织并分离培养成纤维细胞,以其为供体细胞,利用体细胞克隆技术开展超细型二狼山绒山羊的扩繁研究,通过克隆羊体重㊁羊绒细度㊁繁殖性能等指标评估该技术的可行性㊂ʌ结果ɔ试验成功建立了稳定的山羊卵母细胞体外成熟培养及体细胞克隆技术体系,卵母细胞成熟率为44.8%,孤雌激活卵裂率㊁囊胚率分别为83.0%㊁22.4%;二狼山绒山羊克隆胚的卵裂率㊁囊胚率分别为77.8%㊁13.7%㊂获得5只克隆羊个体,其生长发育正常,二狼山绒山羊母羊自然交配共获得16只健康的F 1代个体,具有正常繁殖能力㊂克隆个体羊绒细度极显著低于同龄对照个体(P <0.01)㊂ʌ结论ɔ本研究通过体细胞克隆技术成功克隆了超细型二狼山绒山羊个体,其具备正常生产性能和繁殖性能,并保留了超细羊绒的特性,为地方优良羊种质资源扩繁和新品种培育应用研究奠定了基础㊂关键词:二狼山绒山羊;体细胞克隆;羊绒细度;繁殖性能中图分类号:S 813.3文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.04.010 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-09-05基金项目:云南省国际科技合作专项-巴基斯坦肉羊扩繁技术集成㊁应用与推广(2016I A 024)联系方式:卿玉波,E -m a i l :q i n g y u b o 20@163.c o m ;程雯,E -m a i l :c h e n g c h e n g 20200921@163.c o m ;角德灵,E -m a i l :j i a o d e l i n g @163.c o m ㊂卿玉波㊁程雯和角德灵对本文具有同等贡献,并列为第一作者㊂通信作者魏红江,E -m a i l :h o n g j i a n gw e i @126.c o m S t u d y o n t h eA p p l i c a t i o no f P r o p a g a t i o no f S u p e r f i n e -t y p eE r l a n gs h a n C a s h m e r eG o a t b y S o m a t i cC e l l C l o n i n g T e c h n o l o g yQ I N G Y u b o 1,2,C H E N G W e n 1,2,J I A O D e l i n g 1,2,L I U C h e n g 1,3,H A OZ h i q i a n g 4,G U OJ i a n x i o n g 1,L IY u y i n g 1,3,Z H A N G X i a o l i n 1,3,L I Z h e n 4,5,L IX i a o yu 4,5,WA N G W e n 6,W E IH o n g j i a n g1,2(1.K e y L a b o r a t o r yf o rP o r c i n eG e n eE d i t i n g a n dX e n o t r a n s pl a n t a t i o n i nY u n n a nP r o v i n c e ,K u n m i n g 650201,C h i n a ;2.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,Y u n n a nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,K u n m i n g 650201,C h i n a ;3.F a c u l t y o f A n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,Y u n n a nA g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,K u n m i n g 650201,C h i n a ;4.I n n e rM o n g o l i aZ h o n g k eZ h e n g b i a oB i o t e c h n o l o g yC o .,L t d .,B a y a n n u r 015000,C h i n a ;5.I n n e rM o n g o l i aZ h e n g b i a oB r e e d i n g S t o c kC o .,L t d .,B a y a n n u r 015000,C h i n a ;6.K u n m i n g I n s t i t u t e o f Z o o l o g y ,C h i n e s eA c a d e m y o f Sc i e n c e s ,K u n m i n g 650201,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h ec l o n e di n d i v i d u a lo fs u p e r f i n e -t y p e E r l a n gs h a nc a s h m e r e g o a t w a s p r o d u c e db y s o m a t i c c e l l c l o n i n g t e c h n o l o g y ,w h i c h p r o v i d e d a t h e o r e t i c a l b a s i s f o r t h e a p pl i c a t i o n o f t h i s t e c h n o l o g y i n t h e e x p a n s i o n o f l o c a l h i g h -q u a l i t y s h e e p b r e e d r e s o u r c e s a n d t h e b r e e d i n g of4期卿玉波等:体细胞克隆技术扩繁超细型二狼山绒山羊的应用研究n e wv a r i e t i e s.ʌM e t h o dɔA4-y e a ro l d E r l a n g s h a nc a s h m e r e g o a t w i t hac a s h m e r ef i n e n e s so f13.89μm w a s s e l e c t e d.T h e e a r t i s s u ew a s c o l l e c t e d a n d c u l t u r e d a s f i b r o b l a s t s,w h i c hw e r eu s e da st h e d o n o rc e l l s.S o m a t i cc e l lc l o n i n g t e c h n o l o g y w a s u s e dt o e x p a n dt h e p r o p a g a t i o n o f s u p e r f i n e-t y p eE r l a n g s h a n c a s h m e r e g o a t.T h ef e a s ib i l i t y o ft h et ec h n i q u e w a se v a l u a t ed b y we i g h t,f i n e n e s s o f c a s h m e r ea n dr e p r o d u c t i v e p e r f o r m a n c eo f c l o n e ds h e e p.ʌR e s u l tɔT h e s t a b l e s y s t e m o fg o a to o c y t e m a t u r a t i o nc u l t u r e i nv i t r o a n ds o m a t i cc e l lc l o n i n g w a ss u c c e s s f u l l y e s t a b l i sh e d.T h e o o c y t em a t u r a ti o n r a t ew a s44.8%,a n d t h e c l e a v a g e r a t ea n db l a s t o c y s t r a t eo f p a r t h e n o g e n e s i sw a s83.0%a n d22.4%,r e s p e c t i v e l y.T h e c l e a v a g e r a t e a n db l a s t o c y s t r a t e o f t h e c l o n e de m b r y o s o f E r l a n g s h a n c a s h m e r e g o a tw a s77.8%a n d13.7%,r e s p e c t i v e l y.5c l o n e d s h e e p w e r eo b t a i n e d w i t hn o r m a l g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t,a n d16h e a l t h y F1g e n e r a t i o ni n d i v i d u a l s w e r eo b t a i n e db y n a t u r a lm a t i n g w i t h E r l a n g s h a ne w e s,w i t hn o r m a lr e p r o d u c t i v ea b i l i t y.T h e c a s h m e r e f i n e n e s s o f c l o n e d i n d i v i d u a l sw a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a t o f c o n t r o l i n d i v i d u a l s o f t h e s a m e a g e(P<0.01).ʌC o n c l u s i o nɔS u p e r f i n e-t y p eE r l a n g s h a nc a s h m e r e g o a t i n d i v i d u a l sw a s s u c c e s s f u l l y c l o n e d b y s o m a t i c c e l lc l o n i n g t e c h n o l o g y,w h i c h h a d n o r m a l p r o d u c t i o n a n d r e p r o d u c t i v e p e r f o r m a n c e,a n d r e t a i n e d t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f s u p e r f i n e c a s h m e r e,l a i d a f o u n d a t i o n f o r t h ee x p a n s i o n o fn a t i v ee x c e l l e n ts h e e p g e r m p l a s m r e s o u r c e sa n dt h ea p p l i c a t i o n o fn e w v a r i e t i e s b r e e d i n g.K e y w o r d s:E r l a n g s h a n c a s h m e r e g o a t;s o m a t i cc e l lc l o n i n g;c a s h m e r ef i n e n e s s;r e p r o d u c t i v e p e r f o r m a n c e绒山羊作为中国畜牧业发展的重要生物资源,为人类社会和纺织业发展需求做出了巨大贡献[1-2]㊂羊绒细度是衡量羊绒质量的重要指标[3],因绒山羊品种及生存地域的不同,羊绒特性存在着显著差异[4]㊂内蒙古二狼山绒山羊是中国重要的绒山羊品种之一,是经过长期的自然选择和人工选育而形成的具有优秀羊绒品质的地方品种[5]㊂近年来,因引入辽宁绒山羊进行杂交改良选育,虽然羊绒产量在一定程度得到了提高,但羊绒细度㊁羊绒品质极显著下降,产生了无法逆转的优良品种特性衰退㊂体细胞克隆技术本质是对动物个体遗传信息的完全复制,尤其在快速扩繁复群优良家畜个体㊁加快家畜遗传进展㊁推动地方良种的快速选育中具有巨大应用潜力[6]㊂通过体细胞克隆技术已成功获得了绵羊[7]㊁山羊[8-9]㊁滇南小耳猪[10-15]㊁巴马猪[16-17]㊁香猪[18]等家畜个体,为优良家畜新品种选育及在生物医学领域的应用提供了关键技术支撑㊂本研究前期调查发现,分布于内蒙古自治区西部阿拉善右旗㊁巴彦淖尔市杭锦后旗等偏远地区的二狼山绒山羊群体中,还存在极少数羊绒细度<14μm的超细绒山羊个体,这些优良个体可为选育超细绒山羊新品种群体提供重要素材,但其数量极少㊁年龄偏大且大多分散于不同地区,以传统的 普通杂交-横交固定-选育提高 为主的育种模式培育新品种的效率低㊁周期长㊁成本高㊂利用体细胞克隆技术快速扩繁复群,再进行不断杂交筛选可作为培育超细型二狼山绒山羊新品种的重要方法之一㊂本研究以二狼山绒山羊个体为研究对象,采集其耳组织并建立成纤维细胞系,以此为供体细胞,利用体细胞克隆技术进行快速扩繁复群,批量获得二狼山绒山羊个体并组群进行交配繁殖,进一步对克隆后代的生长性能㊁繁殖性能及羊绒细度变化进行监测分析,综合评估体细胞克隆技术在二狼山绒山羊中对优秀个体扩繁的可行性,为推动体细胞克隆技术在家畜优良品种快速选育中的应用提供理论依据㊂1材料与方法1.1样本来源耳组织样品采自1只4岁龄羊绒细度为13.89μm的二狼山绒山羊个体(ȶ)㊂79份山羊卵巢组织采自巴彦淖尔市杭锦后旗个体户屠宰场㊂代孕母羊为内蒙古中科正标生物科技有限公司提供的10月龄以上的二狼山绒山羊㊂1.2主要试剂D ME M高糖培养基㊁胎牛血清(F B S)㊁T C M-199培养基均购自G i b c o公司;磷酸盐缓冲液(P B S)购自北京索莱宝生物科技有限公司;青-链霉素双抗溶液(p e n i c i l l i n-s t r e p t o m y c i n s o l u t i o n,P S)购自1241中国畜牧兽医51卷B i o l o g i c a lI n d u s t r i e s(B I)公司;二甲基亚砜(D M S O)㊁Ⅳ型胶原酶及其他所用试剂及药品,除特殊说明外均购自S i g m a公司㊂1.3耳组织样品采集及成纤维细胞的分离培养用无菌手术刀片将供体绒山羊耳尖绒毛剔除干净,75%酒精棉消毒3次后用灭菌超纯水清洗3~ 5遍,用无菌眼科剪取下约1c m2耳缘组织,立即放入含5%P S的D M E M培养液中,置于冰盒中带回实验室㊂于超净工作台内用含5%P S的P B S将耳缘组织清洗3遍,再放入P B S中清洗3遍,将组织充分剪碎并转移至T-25培养瓶中,加入0.1%Ⅳ型胶原酶,置于38ħ㊁5%C O2培养箱中消化约3h后取出, 1500r/m i n离心3m i n,去除胶原酶并收集细胞沉淀,加入含10%F B S㊁1%P S的完全培养液置于38ħ㊁5%C O2培养箱中进行原代培养,待细胞汇合度约为60%时,通过0.25%胰蛋白酶进行消化,一部分传代培养供体细胞核移植,另一部分液氮冻存备用㊂1.4山羊卵母细胞体外培养体系的建立参照L i等[19]方法建立山羊卵母细胞体外成熟培养体系㊂采集新鲜山羊卵巢组织,用含5%P S的生理盐水清洗后置于保温瓶中,2h内带回实验室㊂用含5%P S的生理盐水清洗3~5遍后放入含有P B S洗卵液的塑料培养皿中,利用刀切法刺破2~ 5m m卵泡,在显微镜下挑选形态规则㊁卵丘细胞完整的卵丘-卵母细胞复合体(c u m u l u s o o c y t e c o m p l e x e s,C O C s),共收集330枚山羊C O C s㊂在含10%F B S㊁0.0001g/m L L-半胱氨酸㊁10n g/m L表皮生长因子(E G F)㊁10μg/m L促卵泡激素(F S H)㊁5μg/m L促黄体生成素(L H)㊁0.1μg/m Lβ-雌二醇的成熟培养液中,于38.5ħ㊁5%C O2培养箱中培养20~22h㊂用0.1m g/m L透明质酸酶消化C O C s,选取排出第一极体的成熟卵母细胞,置于2.5μm o l/L离子霉素中处理5m i n,用含6-D MA P 的胚胎培养液(G1)在38.5ħ㊁5%C O2㊁饱和湿度的培养箱中处理4h,转入G1培养液中继续培养2d,统计孤雌胚胎的卵裂率㊂72h后将卵裂的胚胎转入胚胎序贯培养液(G2)中继续培养7d,统计孤雌胚胎的囊胚率㊂囊胚率(%)=囊胚数/重构胚数ˑ100%1.5体细胞核移植及胚胎移植待山羊成纤维细胞增殖至汇合度达80%时,通过0.25%胰蛋白酶消化,1000r/m i n㊁室温离心3m i n,去除上清液,收集细胞沉淀㊂参照V a z q u e z-A v e n d a n o等[7]方法建立体细胞克隆技术体系㊂选取排出第一极体的成熟卵母细胞转入去核操作液(含10%F B S㊁0.1m g聚乙烯醇(P V A)㊁5μg/m L细胞松弛素B(C B)的T C M199)中,用显微注射针去除第一极体及周围细胞质,将供体细胞注入卵周间隙㊂之后对重构胚胎进行融合处理,电融合液:0.3m m o l/L D-C6H14O6,0.5m m o l/LH E P E s,0.05m m o l/L(C H3C O O)2M g㊃4H2O,0.05m m o l/LB S A,0.1m m o l/LC a(C2H3O2)2;电融合参数:脉冲电压1.5k V/c m,脉冲持续时间25μs,脉冲次数2次㊂电融合后的胚胎移入培养液G1中培养1~1.5h㊂体式显微镜下挑取已融合的重构胚,移入2.5m m o l/L离子霉素中处理5m i n,转入含6-D MA P的G1培养液中4h完成化学激活㊂将激活后的重构胚移入培养液G1中,置于38.5ħ㊁5%C O2㊁饱和湿度的恒温培养箱中培养, 2d后统计卵裂率,72h后重构胚从G1培养液移至G2培养液中继续培养,7d后统计囊胚率㊂挑选超过10月龄以上健康发情的二狼山绒山羊母羊为代孕母羊,将体外培养2~48h的克隆胚胎经手术法移植至发情良好的代孕母羊输卵管内继续发育,移植30d后通过兽用B超仪(H S-101V,H o n d aE l e c t r o n i c s 公司)检测其妊娠情况㊂1.6测定指标及方法1.6.1山羊体重将4只成活克隆绒山羊个体进行编号(1#㊁2#㊁3#㊁4#),并对生长发育至成年的克隆绒山羊个体进行体重测定,早晨空腹时用台秤逐只称重,记录实时体重数据㊂1.6.2羊绒细度分别采集供体二狼山绒山羊㊁普通型二狼山绒山羊㊁克隆超细型二狼山绒山羊及自然交配繁殖二狼山绒山羊(对照)的绒毛,于绒山羊体左侧肩胛骨后缘10c m和体中线交叉的部位,紧贴皮肤采集长度约3c m㊁重约10g的羊绒样本,每只羊随机抽取25根羊绒,置于倒置显微镜下拉直固定,利用N I S-E l e m e n t sD4.60.00(64b i t)软件选取每根羊绒上任意3个部位进行直径测定,并分别将供体二狼山绒山羊与同龄对照二狼山绒山羊㊁克隆超细型二狼山绒山羊与同龄自然交配繁殖的对照二狼山绒山羊的绒毛细度进行对比统计分析㊂1.6.3繁殖性能待克隆超细型二狼山绒山羊个体达到性成熟时,与发情的普通型二狼山绒山羊进行交配繁殖,统计后代出生情况,监测其繁殖性能㊂1.7数据统计分析试验数据采用S P S S22.0软件的A N O V A进行单因素方差分析,利用t检验进行差异显著性分析,结果22414期卿玉波等:体细胞克隆技术扩繁超细型二狼山绒山羊的应用研究用平均值ʃ标准差表示,P <0.05表示差异显著㊂2 结 果2.1 山羊卵母细胞体外成熟培养对采集的330枚山羊C O C s 进行体外成熟培养,48h 后获得山羊成熟卵母细胞(图1A ),其成熟率为44.8%㊂孤雌激活培养48h 后卵母细胞发生卵裂(图1B ),其卵裂率为83.0%㊂体外培养7d 后发育至囊胚(图1C ),其囊胚率为22.4%㊂山羊卵母细胞成熟效果较好,且经孤雌激活后能正常的卵裂并发育至囊胚,表明成功建立山羊卵母细胞的体外成熟培养体系㊂A ,卵丘-卵母细胞复合体;B ,4-细胞期孤雌胚;C ,孤雌囊胚A ,C u m u l u s -o o c y t e c o m p l e x ;B ,4-c e l l p a r t h e n o g e n e t i c e m b r y o ;C ,P a r t h e n o g e n e t i cb l a s t o c y s t 图1 山羊孤雌激活胚体外发育情况(10ˑ)F i g .1 I n v i t r o d e v e l o p m e n t o f g o a t p a r t h e n o g e n e t i c e m b r yo s (10ˑ)2.2 超细型二狼山绒山羊重构胚的构建及胚胎移植以1只4岁龄羊绒细度为13.89μm 的二狼山绒山羊的耳组织成纤维细胞为供体细胞(图2A ),利用体细胞克隆技术共构建了414枚克隆胚胎(图2B )㊂经化学激活48h 后322枚发生卵裂(图2C ),卵裂率为77.8%(322/414),继续体外培养7d 后形成57个囊胚(图2D ),囊胚率为13.7%(57/414),重构胚的体外发育能力较好㊂A ,供体成纤维细胞(10ˑ);B ,成熟山羊卵母细胞(10ˑ);C ,培养48h 重构胚(10ˑ);D ,重构胚囊胚(10ˑ);E ,克隆超细型二狼山绒山羊个体;F ,克隆超细型二狼山绒山羊繁殖的部分后代A ,D o n o r f i b r o b l a s t s (10ˑ);B ,M a t u r e g o a t o o c y t e (10ˑ);C ,C u l t u r e f o r 48h r e c o n s t r u c t e d e m b r y o s (10ˑ);D ,R e c o n s t r u c t e d e m b r y ob l a s t o c y s t (10ˑ);E ,C l o n i n g i n d i v i d u a l o f s u p e r f i n e -t y p eE r l a n g s h a nc a s h m e r e g o a t s ;F ,P a r t i a l b r e e d i n g o f f s p r i n g of c l o n e d s u p e r f i n e -t y p eE r l a ng sh a n c a s h m e r e g o a t s 图2 超细型二狼山绒山羊的克隆及后代繁殖F i g .2 C l o n i n g a n d p r o g e n y r e p r o d u c t i o no f t h e s u p e r f i n e -t y p eE r l a n gs h a n c a s h m e r e g o a t s 3241中 国 畜 牧 兽 医51卷将339枚激活后重构胚移植至19只代孕母羊的输卵管内,胚胎移植30d 后经B 超诊断12只代孕母羊成功妊娠,妊娠率为63.2%(12/19),其中5只代孕母羊在妊娠约150d 时成功产下5只羔羊,分娩率为41.7%(5/12),1只分娩后死亡,4只成活并成功繁殖后代(图2E ㊁2F );3只母羊单羔流产,1只母羊双羔流产;1只母羊妊娠3月龄后死亡,解剖后妊娠正常羔羊1只㊂2.3 克隆超细型二狼山绒山羊个体生长性能、羊绒细度及繁殖性能测定2.3.1 生长性能 对4只成年克隆超细型二狼山绒山羊个体分别进行体重测定,并与4只同龄对照绒山羊进行对比分析,结果见图3,克隆超细型二狼山绒山羊平均体重(49.8k g )显著高于同龄普通型二狼山绒山羊(39.2k g)(P <0.05),通过体细胞克隆技术获得的超细型二狼山绒山羊个体生长发育正常㊂*,差异显著(P <0.05);无*,差异不显著(P >0.05)㊂下同*,S i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05);N o *,N os i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05).T h e s a m e a sb e l o w 图3 绒山羊体重测定结果F i g .3 R e s u l t s o fw e i gh tm e a s u r e m e n t o f c a s h m e r e g o a t s 2.3.2 羊绒细度 由图4可知,6岁龄供体羊羊绒细度为16.8μm ,与同龄普通对照种羊羊绒细度(18.8μm )相比差异显著(P <0.05);克隆后代2岁龄羊绒细度(14.8μm )与同龄自然交配繁殖后代羊绒(16.8μm )相比差异显著(P <0.05),其中3#㊁4#克隆山羊的羊绒细度(15.9㊁15.7μm )显著低于同龄对照山羊的羊绒细度(P <0.05),表明利用体细胞克隆技术能够成功实现超细型二狼山绒山羊的扩繁,并能保持供体羊绒细度的特性㊂2.3.3 繁殖性能 4只克隆超细型二狼山绒山羊达到性成熟后,与自然发情的母羊进行自然交配繁殖,共获得了16只健康的F 1代超细型二狼山绒山羊个体,表明体细胞克隆超细型二狼山绒山羊具有正常繁殖能力㊂3 讨 论中国是最大的羊绒生产国,世界约有30%的羊绒产量均来自内蒙古自治区,内蒙古绒山羊是由内蒙古山羊在长期的选育过程中演变形成的,因其羊绒纤维长㊁细度较细而闻名世界,经过多年不断的选育和改良,尤其是内蒙古二狼山绒山羊更具有较好的羊绒品质[5],但因其存在体型小㊁产绒量低等缺点,为提高内蒙古二狼山绒山羊的产绒量,提高经济生产效益,引入了辽宁绒山羊与之杂交改良选育,尽管使羊绒产量得到了一定的提升,但羊绒质量产生了不可逆转的退化㊁羊绒直径变粗㊁羊绒品质严重下降㊂通过对杂交改良后的二狼山绒山羊调查发现,群体中仍存在极少数羊绒细度较细㊁羊绒质量较优的个体㊂若通过常规的杂交育种无法大量集中对具有优良性状的超细绒山羊进行扩繁培育,且饲养管理水平无法保证,饲养场地分散㊁饲养管理成本高㊁需投入大量人力,长期维持难度大[20],不利于优质地方羊种质资源的可持续开发利用㊂本研究通过引入体细胞克隆技术,将群体中羊绒细度较细㊁质量较优的公母个体实现扩繁后,再进一步通过公母杂交选育后培育超细型二狼山绒山羊新品种,可作为地方优质羊种质资源开发利用及优良地方家畜新品种培育的重要方法㊂在改良和优化的绵羊体细胞克隆技术体系的基础上[19],本研究建立了山羊体细胞克隆技术体系㊂卵母细胞体外培养的成熟率为44.8%,孤雌激活的卵裂率为83.0%㊁囊胚率为22.4%,以二狼山绒山羊成纤维细胞为供体细胞的克隆胚卵裂率为77.8%,囊胚率为13.7%,均高于所报道的克隆绵羊胚卵裂率(66.92%)和囊胚率(12.46%)[21],移植至代孕母羊的妊娠率为63.2%,成功获得5只克隆超细型二狼山绒山羊,证明该山羊体细胞克隆技术体系稳定㊁可行,为后续开展地方优良山羊品种的扩繁提供了技术支撑㊂但本研究流产率高达16.7%,出生后的5只羔羊中有1只死胎,克隆效率没有得到显著提高㊂牛㊁羊等大动物的体细胞克隆技术一直存在妊娠后期流产㊁围产期死亡率较高㊁胎儿过大㊁出生后适应能力差以及发育异常等关键问题[22-25],如何攻克这些技术难题成了体细胞克隆技术能否最终广泛应用到生产中的关键㊂克隆超细型42414期卿玉波等:体细胞克隆技术扩繁超细型二狼山绒山羊的应用研究二狼山绒山羊生长发育正常,成年体重远高于对照组平均体重,并有正常的繁殖能力,与普通绒山羊母羊交配后获得了建康的F 1代个体㊂A~D ,分别为种羊㊁配种后代羊㊁克隆供体羊及克隆个体羊的羊绒显微观察结果;E ,不同个体羊的羊绒细度统计;F ,克隆超细型二狼山绒山羊的羊绒细度统计A -D ,M i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o no f c a s h m e r e o f t h eb r e e d i n g s h e e p ,t h eb r e e d i n g o f f s p r i n g s h e e p ,t h e c l o n e dd o n o r s h e e p an dt h e c l o n e di n d i v i d u a ls h e e p ,r e s p e c t i v e l y ;E ,S t a t i s t i c so fc a s h m e r ef i n e n e s so fd i f f e r e n ti n d i v i d u a ls h e e p ;F ,C a s h m e r ef i n e n e s s s t a t i s t i c s o f t h e c l o n e d s u p e r f i n e -t y p eE r l a n g s h a n c a s h m e r e g o a t s 图4 不同绒山羊的羊绒细度测定结果F i g.4 R e s u l t s o f c a s h m e r e f i n e n e s s i nd i f f e r e n t c a s h m e r e g o a t s 羊绒细度是山羊绒出口贸易中质量评价的一项重要指标,也是羊绒贸易中分级定价的重要依据㊂目前畜牧业中对羊绒细度的测定多采用显微投影法[26],但存在测定样本少㊁准确性差㊁测定耗时长㊁受人为主观因素影响,已不能完全满足精准检测的要求[27]㊂随着羊绒加工业的不断发展壮大,一些如O F D A 细度仪㊁奥达2000动物纤维分析仪㊁激光细度仪㊁B E I O NF 10全自动纤维细度仪等国内外研发的专业羊绒细度测定仪被广泛应用,这些不同仪器的核心原理仍是基于光学显微镜将大量的羊绒纤维样本放大后,通过图像处理软件分析获得羊绒细度数据㊂本研究基于同一台光学显微镜㊁同一操作者直接对不同二狼山绒山羊个体的羊绒样本的3个部位进行测定,进一步利用显微镜图像识别软件直接对羊绒直径进行测定,原理与纤维细度分析仪相同,获得不同个体的羊绒细度数据并进行统计分析,具有一定的可比性,可作为判定羊绒细度的重要依据㊂本研究中选取的供体绒山羊是曾是获得内蒙古巴彦淖尔市白绒山羊大赛细度第一的二狼山绒山羊,比赛4岁龄时羊绒细度为13.89μm ,而本研究5241中国畜牧兽医51卷在2年后通过光学显微镜实测结果显示,采集的6岁龄羊绒细度达到了16.8μm,相差近3μm,这与羊绒细度随着年龄的增长而变粗有关,也与使用不同羊绒细度测定方法有关㊂克隆个体的羊绒细度均极显著低于同龄对照个体的羊绒细度,表明通过体细胞克隆技术可实现超细型二狼山绒山羊的快速扩繁,为通过体细胞克隆技术快速扩繁优秀家畜个体提供了理论支撑㊂4结论本研究成功利用体细胞克隆技术实现了超细型二狼山绒山羊的快速扩繁,克隆羊平均体重显著高于同龄普通羊,生长发育正常,并通过自然交配繁殖获得了健康的后代,克隆羊个体具有超细型二狼山绒山羊种质特性㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] C A IY,F U W,C A ID,e t a l.A n c i e n t g e n o m e sr e v e a lt h e e v o l u t i o n a r y h i s t o r y a n d o r i g i n o f c a s h m e r e-p r o d u c i n gg o a t s i nC h i n a[J].M o l e c u l a rB i o l o g y a n dE v o l u t i o n,2020,37(7):2099-2109.[2] Y A N GF,L I UZ,Z HA O M,e t a l.S k i nt r a n s c r i p t o m er e v e a l s t h e p e r i o d i c c h a n g e s i n g e n e s u n d e r l 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《利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究》篇一一、引言随着生物技术的飞速发展，体细胞核移植技术已成为一种重要的生物工程手段，其在畜牧业、医学、生物科学研究等领域具有广泛的应用前景。

其中，利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊，不仅有助于提高山羊绒的产量和质量，同时也能为医学研究和药物开发提供重要的动物模型。

本文旨在详细阐述利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究。

二、研究背景与目的随着人类对畜牧产品需求的增加，传统的育种方式已无法满足市场需求。

而体细胞核移植技术为畜牧业的育种提供了新的可能性。

通过该技术，我们可以将外源基因导入到动物体内，从而获得具有特定性状的新品种。

本研究的目的是利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊，以期获得更高产、更高品质的山羊绒，为畜牧业提供优质的种源，同时为医学研究和药物开发提供模型动物。

三、研究方法本研究采用体细胞核移植技术，结合基因编辑技术，将特定基因导入山羊的体细胞中。

首先，我们提取山羊的体细胞，并进行基因编辑，将目的基因整合到山羊的基因组中。

然后，我们将编辑后的体细胞与去核卵母细胞进行融合，形成重组胚胎。

最后，将重组胚胎移植到代孕母羊体内，使其发育成为转基因绒山羊。

四、实验过程与结果1. 实验过程在实验过程中，我们首先从成年山羊身上提取体细胞，并利用基因编辑技术将目的基因整合到体细胞的基因组中。

接着，我们利用电刺激等方法将编辑后的体细胞与去核卵母细胞进行融合，形成重组胚胎。

最后，将重组胚胎移植到代孕母羊体内，让其发育成为转基因绒山羊。

2. 实验结果经过多轮实验，我们成功获得了转基因绒山羊。

通过检测，我们发现目的基因已经成功整合到山羊的基因组中，并且得到了表达。

与普通山羊相比，转基因绒山羊的绒产量和品质均有所提高。

此外，我们还对转基因绒山羊进行了长期的观察和检测，未发现明显的遗传和健康问题。

五、讨论本研究利用体细胞核移植技术成功生产了转基因绒山羊，为畜牧业的育种提供了新的可能性。