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i b r e x a f u n g e r p治疗外阴阴道念珠菌病的研究进展赵调红黎云(庆阳市人民医院妇产科,庆阳745000)ʌ摘要ɔi b r e x a f u n g e r p是一种新型的三萜类葡聚糖合成酶抑制剂,可抑制真菌细胞壁上β-(1,3)-D-葡聚糖的生物合成,具有生物利用度高㊁安全性良好㊁发生药物相互作用少等优势,并且对念珠菌属(包括唑类和棘白菌素耐药菌)均具有抗菌活性㊂因目前咪唑类抗真菌药物耐药逐渐增多㊁外阴阴道念珠菌病易复发等特点,亟需寻找新的替代疗法㊂该文主要综述i b r e x a f u n g e r p的作用机制㊁药代动力学以及关键临床试验对外阴阴道念珠菌病的疗效及安全性㊂ʌ关键词ɔi b r e x a f u n g e r p;外阴阴道念珠菌病;抗真菌药;β-(1,3)-D-葡聚糖ʌ中图分类号ɔ R519.3ʌ文献标志码ɔ A ʌ文章编号ɔ1673-3827(2023)18-0550-04外阴阴道念珠菌病(v u l v o v a g i n a l c a n d i d i a s i s, V V C)是由念珠菌感染引起的常见外阴阴道炎症,白念珠菌是最常见的致病菌,但近年来非白念珠菌感染呈上升趋势,包括光滑念珠菌㊁近平滑念珠菌等㊂70%~75%的女性一生中至少会患1次V V C,其中45%有2~5次复发,29%有620次复发,6%有超过20次复发,且10%~20%的女性会被诊断为复杂的V V C,现有的抗真菌药治疗效果不理想,严重影响女性的生活质量[1-2]㊂随着针对葡聚糖合成酶抗真菌药物的引入,棘白菌素(卡泊芬净㊁米卡芬净㊁阿尼芬净)对侵袭性真菌感染的治疗产生了巨大影响,然而,因其缺乏口服制剂限制了在特殊人群中的使用[3]㊂另外,唑类和棘白菌素对白念珠菌和光滑念珠菌耐药已被报道,导致临床使用受限[4],唑类抗真菌药物发生药物相互作用的缺点,也限制该药物在多种合并症患者中的使用[5]㊂2021年6月美国食品药品管理局(F D A)批准i b r e x a f u n g e r p上市,是唯一一种用于治疗V V C的口服非唑类抗真菌药物,其作用靶点主要是真菌细胞壁上的β-(1,3)-D-葡聚糖酶,是真核生物所特有的酶,不存在于人类,因此人体不良反应少见[6]㊂其作用机制与棘白菌素相似,主要非竞争性抑制β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶,虽然i b r e x a f u n g e r p产生耐药的葡聚糖酶分子靶点与棘白菌素作用分子靶作者简介:赵调红,女(汉族),硕士.E-m a i l:2465962502@q q.c o m 通信作者:黎云,E-m a i l:809004787@q q.c o m点部分重合,但i b r e x a f u n g e r p有独立的结合位点,对棘白菌素耐药菌仍有活性[7-8]㊂本文就i b r e x a-f u n g e r p的作用机制㊁药代动力学以及关键临床试验对外阴阴道念珠菌病的疗效及安全性进行综述㊂1作用机制β-(1,3)-D-葡聚糖约占真菌细胞壁组成成分的65%~90%,使其成为抗菌药物作用的主要靶点[9]㊂抑制β-(1,3)-D-葡聚糖生物合成破坏了细胞内外的渗透压平衡,导致高渗透性破坏细胞壁使细胞裂解死亡,i b r e x a f u n g e r p与棘白菌素具有相似的作用机制,通过非竞争性抑制β-(1,3)-D-葡聚糖合酶发挥作用,i b r e x a f u n g e r p对念珠菌属具有杀菌作用,对曲霉菌属具有抑菌作用[10-11]㊂但两者的酶结合位点不同,导致棘白菌素和i b r e x a f u n-g e r p耐药菌株之间的交叉抗性非常有限,β-(1,3)-D-葡聚糖合酶是一种跨膜糖基转移酶复合物,由同源基因F K S1和F K S2编码的催化亚基组成,棘白菌素的抗性是由于编码F K S基因的F k s1区域突变引起,它的长期广泛使用导致念珠菌对棘白菌素产生耐药,尤其是光滑念珠菌和耳念珠菌菌, i b r e x a f u n g e r p对具有F K S基因突变的棘白菌素耐药菌光滑念珠菌具有较强的活性[12-13]㊂2药理学i b r e x a f u n g e r p与血浆白蛋白的结合率高达99%,口服后经胃肠道吸收,在侵袭性念珠菌病鼠模型中,小鼠㊁大鼠和犬的生物利用度分别约为51%㊁45%和35%[14]㊂口服给药后以剂量依赖性积聚在阴道黏膜和分泌物中,阴道中的含量比相应血浆水平高2~5倍,i b r e x a f u n g e r p主要经肝脏的细胞色素C Y P3A4同工酶广泛代谢㊂另有研究证㊃055㊃中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M y c o l,D e c e m b e r2023,V o l18,N o.6实,在酸性环境下i b r e x a f u n g e r p比氟康唑具有更高的抗菌活性,表明i b r e x a f u n g e r p在治疗阴道念珠菌感染方面具有治疗优势[15]㊂i b r e x a f u n g e r p的药代动力学已在健康志愿者的多项Ⅰ期研究中进行了评估,单次口服10~1600m g后,i b r e x a f u n-g e r p血浆浓度峰值出现在4~6h,最大血药浓度(C m a x)以单相方式下降,浓度-时间曲线下的平均面积(A U C0-ɕ)和C m a x在10~1600m g范围内与剂量成正比[16]㊂药效学方面,体外研究结果表明,i b r e x a f u n-g e r p对耐棘白菌素的白念珠菌和曲霉有抗菌活性,降低了最低抑菌浓度(m i n i m a l i n h i b i t o r y c o n-c e n t r a t i o n,M I C90)和半数最低抑菌浓度(I C50),且对F K S1和F K S2基因突变的光滑念珠菌也有显著的抗性[17];另外该药对耐伊曲康唑的烟曲霉㊁黄曲霉和黑曲霉均有抗菌活性,其最低有效浓度(m i n i m a l e f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n,M E C)为0.03~ 0.5㊁0.06和0.12μg㊃m L-1[18];i b r e x a f u n g e r p和米卡芬净对念珠菌和非念珠菌均有较强的体外抗菌活性,且两种药物体外活性相似,但i b r e x a f u n-g e r p对近平滑念珠菌和非念珠菌的M I C显着低于米卡芬净[19]㊂i b r e x a f u n g e r p和艾沙康唑联合治疗侵袭性肺曲霉病能够延长生存期㊁减少肺部损伤并且减少真菌残留,与单一疗法相比,两者具有协同作用[20]㊂3药物相互作用体外结果表明,i b r e x a f u n g e r p是C Y P3A4的底物和细胞色素P450(C Y P)2C8的抑制剂,对其他C Y P同工酶几乎没有活性,并在健康受试者中进行了Ⅰ期临床试验研究i b r e x a f u n g e r p的药物-药物相互作用潜力,研究评估了i b r e x a f u n g e r p与单剂量或多剂量罗格列酮(C Y P2C8底物)和他克莫司(C Y P3A4底物)共同给药后的相互作用潜力,研究发现罗格列酮及其代谢物不受与i b r e x a f u n-g e r p共同给药的影响,另外对他克莫司的(C m a x)也无影响㊂因此,i b r e x a f u n g e r p与C Y P介导的药物发生相互作用的可能性很低[21-22]㊂4三项关键的临床试验三项临床试验(D O V E㊁V A N I S H303和V A N I S H306)[23-25]均评价了i b r e x a f u n g e r p的治疗疗效,在这3项试验中,V V C均经显微镜证实,每个样本的阴道p Hɤ4.5,并对红斑㊁水肿和抓痕采用外阴阴道体征和症状(V S S)评分,评分范围为0~3分(0分无;3分为严重);治愈访视(T O C)时间分别为:Ⅱ期临床试验(D O V E)第10天,Ⅲ期临床试验V A N I S H303和V A N I S H306在第11ʃ3天,随访(F U)访视分别在第25天和25ʃ4天㊂主要结果的评估指标是V V C临床治愈(外阴阴道体征和症状完全消退)的患者的百分比,也就是V S S 评分为0,并包括以下次要终点:T O C访视时真菌学根除的患者百分比㊁T O C访视时达到临床改善(V S Sɤ1)和F U访视时症状缓解(第25ʃ4天)㊂4.1外阴阴道念珠菌病的Ⅱ期临床研究D O V E(N C T03253094)[23]一项随机㊁双盲㊁剂量研究的Ⅱ期临床试验,纳入患有中度至重度急性V V C的患者评估i b r e x a f u n g e r p和氟康唑治疗V V C的有效性和安全性,并确定最佳口服剂量㊂186名患者被随机分配到6个治疗组,给予i b r e x a-f u n g e r p300m g每日两次为期1d(n=27)和氟康唑150m g为期1d(n=24)的治疗㊂T O C访视第10天,i b r e x a f u n g e r p和氟康唑的临床治愈率分别为51.9%和58.3%,真菌学根除率分别为63.0%和62.5%;F U访视第25天临床治愈率分别为70.4%和50.0%,真菌学根除分别为48.1%和37.5%㊂常见的不良反应是轻度的胃肠道反应,与氟康唑相比,i b r e x a f u n g e r p患者需要较少的不良反应缓解药物(3.7%和29.2%)㊂由于此研究为2期剂量评价试验,未进行统计学分析,所提供的分析均为描述性分析,样本量较小,需要更多的研究来确定观察到的差异是否具有临床意义,总的来说,i b r e x a f u n g e r p对中度至重度V V C的疗效与氟康唑相似㊂4.2外阴阴道念珠菌病的Ⅲ期临床研究V A N I S H303(N C T03734991)[24]是一项随机㊁双盲㊁安慰剂对照的Ⅲ期临床研究,评估口服i b r e x a f u n g e r p与安慰剂对照对急性V V C患者的疗效和安全性,该项研究纳入376名患者按照2ʒ1随机分配,接受i b r e x a f u n g e r p300m g(每日2次)和匹配的安慰剂对照,治疗1d;测试的主要终点是T O C就诊时(第10天)临床治愈率(第10天所有外阴症状和体征完全消失),次要终点为T O C 访视时真菌学根除率和总体成功率(临床治愈和真菌学根除率)㊂试验结果表明,与安慰剂相比,㊃155㊃中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M y c o l,D e c e m b e r2023,V o l18,N o.6i b r e x a f u n g e r p在主要终点和所有关键次要终点均显示出统计学优势,i b r e x a f u n g e r p的患者临床治愈率显著高于安慰剂组(50.5%v s.28.6%,P= 0.001),真菌学根除率(49.5%v s.19.4%,P< 0.001),总成功率(36.0%v s.12.6%,P< 0.001)㊂该试验的不足之处主要是该研究纳入的非白念珠菌感染患者较少,对此临床疗效未确定,结果仅限于白念珠菌相关的V V C患者㊂基于以上研究,i b r e x a f u n g e r p耐受性良好,在白念珠菌引起的V V C患者中效果较好㊂V A N I S H306(N C T03987620)[25]是一项随机㊁双盲㊁安慰剂对照的Ⅲ期临床试验,旨在进一步评估口服i b r e x a f u n g e r p与安慰剂对照在急性V V C 患者中的疗效和安全性;将纳入的366名患者以2ʒ1的比例随机分配接受i b r e x a f u n g e r p300m g (每日2次)和匹配的安慰剂对照,治疗1d;测试的主要终点是T O C访视时临床治愈(第10天所有外阴症状和体征完全消失),次要终点包括T O C访视真菌学根除率和总体成功率(临床治愈和真菌学根除率);试验结果显示,i b r e x a f u n g e r p在主要终点和所有关键次要终点方面在统计学上均优于安慰剂,接受i b r e x a f u n g e r p的患者在T O C就诊时的临床治愈率显着高于接受安慰剂的患者(63.3% v s.44.0%,P=0.007),真菌学根除率(58.5% v s.29.8%,P<0.001),总体成功率(46.1%v s.28.4%,P=0.022),且在随访中,口服i b r e x a f u n-g e r p的患者与安慰剂相比,症状持续缓解(73.9% v s.52.4%,P=0.001),以上结果均表明i b r e x a-f u n g e r p在急性V V C患者中有效㊂5安全性与耐受性Ⅰ期临床试验中超过1000名健康受试者口服高负荷剂量的i b r e x a f u n g e r p(1250m g和750 m g)持续7d,最常见不良事件(a d v e r s e e v e n t, A E)是轻中度的腹泻㊁腹痛㊁恶心㊁呕吐,并未观察到与治疗相关的严重A E,且耐受性良好[21-22];根据Ⅱ临床试验报道,i b r e x a f u n g e r p治疗后不良反应缓解药物使用率明显低于氟康唑(3.7%v s.29.2%)[23];V A N I S H303[24]研究中,与安慰剂(16.9%)相比,口服i b r e x a f u n g e r p患者(39.7%)报道了与治疗相关的A E,大多数是轻中度的胃肠道反应,包括腹泻(22.3%)㊁腹痛(5.3%)㊁恶心(10.9%)㊂V A N I S H306[25]研究中,与安慰剂(4%)相比,口服i b r e x a f u n g e r p患者(14.8%)报道了与治疗相关的A E,i b r e x a f u n g e r p的患者中,ȡ2%的治疗相关A E是恶心(6.4%轻度,0.3%中度,0.3%重度),腹泻(5.7%轻度,1.0%中度);综上临床试验数据显示,i b r e x a f u n g e r p具有良好的安全性和耐受性,发生治疗相关的严重或需要停药治疗的A E少见㊂6总结与展望i b r e x a f u n g e r p是F D A批准的首个广谱三萜类抗真菌药,它利用了葡聚糖合成酶抑制剂良好的药物活性,且具有口服和静脉给药的优势,对广泛的白念珠菌和非白念珠菌以及对氟康唑耐药的菌株均具有体外杀菌活性,治疗中度至重度V V C有效,Ⅱ期剂量临床试验显示该药与氟康唑有相似的疗效,在两项Ⅲ期临床试验中与安慰剂相比具有优势㊂但还需要更多的临床试验来评估其在特殊人群包括妊娠期㊁哺乳期和复杂V V C患者中的有效性和安全性㊂参考文献[1]D E N N I N G D W,K N E A L E M,S O B E L J D,e t a l.G l o b a lb u r d e n o f r ec u r r e n t v u l v o v a g i n a l c a nd i d i a s i s:a s y s te m a t i cr e v i e w[J].L a n c e t I n f e c t D i s,2018,18(11):e339-e47.[2]WO R K OW S K I K A,B O L A N G A.S e x u a l l y t r a n s m i t t e dd i se a s e s t r e a t m e n t g u i d e l i n e s,2015[J].MMWR R e c o mmR e p,2015,64(R 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寡糖研究新进展寡糖(oligosaccharides) ,亦称低聚糖,由2～9个单糖单元经苷键结合而成。
根据结合的单糖个数,可分为双糖、三糖、四糖直至九糖,分子式为(C6H10O5 ) n , n = 2～9。
许多寡糖及其糖缀合物因独特的结构而成为重要的生命物质,如乳果糖、大豆低聚糖、异麦芽糖等不仅以其缀合物起作用,而且其本身具有重要的生理功能,可作为促双歧杆菌生长因子,有拮抗机体过氧化损伤及降脂作用。
目前,我国功能性寡糖的研发尚处于起始阶段,对一些功能显著、市场前景好、附加值高的寡糖产品的研发相对滞后。
人们对寡糖在食品、医药及农业方面的开发寄予厚望。
1 寡糖的分类寡糖类组分多以游离状态存在于植物体和果实中。
构成寡糖的单糖主要是葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等五碳糖和六碳糖。
根据寡糖的单糖组成可分为同寡糖和杂寡糖,前者由同类单糖组成,后者由不同单糖组成;根据分子中是否存在游离的半缩醛羟基,还可分为还原性寡糖和非还原性寡糖,前者为糖基2糖基2糖的形式,后者为糖基2糖基2糖苷的形式;根据生物学功能可分为普通寡糖和功能性寡糖,前者可被机体消化吸收,产生能量,如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽寡糖等,后者具有特殊的生理学功能但不被肠道吸收。
还有一类寡糖是在侧链上修饰不同的化学基团,如胺基、羟基、硫酸基等,此类产物有糖醛酸、胺基糖、脱氧糖等。
2 寡糖的提取与制备目前主要有从天然产物直接提取、酶催化合成或酶解天然多糖、酸水解天然多糖和化学合成等4种途径。
2. 1 天然产物直接提取从天然原料中提取未衍生化的寡糖产品十分困难。
目前适用此法的寡糖有棉籽糖(从甜菜提取) 、大豆寡糖(从大豆乳清提取) 、黑曲霉寡糖(从菌体提取)等。
近年此法不断取得进展。
武卫红用不同体积的75 %乙醇室温提取鲜地黄中的总寡糖。
Kotiguda等用70 %乙醇室温浸泡菜豆, 130 r/min摇床提取13 h,用薄层色谱和纸色谱在提取液中检测到筋骨草糖(六糖) 。
第43 卷第 2 期2024 年2 月Vol.43 No.2254~260分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO（Journal of Instrumental Analysis）QuEChERS/超高效液相色谱-串联质谱法同时测定大米中16种香豆素和香兰素及其衍生物邓楠1，尹芳平1，刘川1，汪辉1，2*，向芬1，陈娅娅3（1．长沙市食品药品检验所，湖南长沙410036；2．国家酒类产品质量检验检测中心（湖南），湖南长沙410036；3．张家界市高级技工学校，湖南张家界427000）摘要：建立了大米中16种香豆素和香兰素及其衍生物的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法。
大米样品采用1%甲酸乙腈提取，150 mg C18与450 mg无水MgSO4吸附剂净化，采用Agilent SB-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）分离，0.2%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸铵）和乙腈为流动相梯度洗脱，在电喷雾离子源正负离子模式下采用多反应监测模式（MRM）进行测定，以基质匹配标准溶液内标法定量。
结果显示，16种待测组分在各自质量浓度范围内线性关系良好（r≥0.998），方法检出限为0.001~0.400 mg/kg，定量下限为0.004~0.600 mg/kg，平均回收率为71.3%~120%，相对标准偏差（RSD，n=6）为1.6%~6.5%，日内RSD（n= 6）为1.0%~8.8%，日间RSD（n=3）为0.60%~14%。
该法前处理简单易操作、灵敏度高、准确性好，适用于大米中香豆素与香兰素及其衍生物的同时检测。
关键词：QuEChERS；超高效液相色谱-串联质谱；大米；香豆素；香兰素；衍生物；同位素内标中图分类号：O657.7；TS207.3文献标识码：A 文章编号：1004-4957（2024）02-0254-07Simultaneous Determination of 16 Coumarins and Vanillins andTheir Derivatives in Rice by QuEChERS/Ultra-high Performance Liq⁃uid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryDENG Nan1，YIN Fang-ping1，LIU Chuan1，WANG Hui1，2*，XIANG Fen1，CHEN Ya-ya3（1．Changsha Institute for Food and Drug Control，Changsha 410036，China；2．National Liquor ProductQuality Supervision and Inspection Center（Hunan），Changsha 410036，China；3．Zhangjiajie Senior Technical School，Zhangjiajie 427000，China）Abstract：A ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/ MS） method was established for the determination of 16 coumarins and vanillins and their derivatives in rice. The rice sample was extracted by acetonitrile with 1% formic acid，purified with a combined dadsorbent with 150 mg C18 and 450 mg anhydrous MgSO4. The chromatography separation for the an⁃alytes was achieved on an Agilent SB-C18 column（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），and gradient elution was performed using 0.2% formic acid solution（containing 5 mmol/L ammonium formate） and acetoni⁃trile. The analytes were determined by multiple reaction monitoring（MRM） of electrospray ionization in positive and negative ion modes，and quantified by matrix-matched internal standard method. The 16 components measured had good linear relationships within their respective mass concentration ranges（r≥0.998）. The limits of detection were 0.001-0.400 mg/kg，and the limits of quantitation were 0.004-0.600 mg/kg.Average recoveries of the 16 components ranged from 71.3%to 120%，the relative standard deviations（RSDs，n=6） ranged from 1.6% to 6.5%，the intra-day RSDs（n=6）ranged from 1.0% to 8.8%，and the inter-day RSDs（n=3） ranged from 0.60% to 14%. The method is simple and easy to operate，with high sensitivity and accuracy，and is suitable for the simultaneous determination of coumarins and vanillins and their derivatives in rice.Key words：QuEChERS；UPLC-MS/MS；rice；coumarins；vanillins；derivative；isotope inter⁃nal standard收稿日期：2023－08－16；修回日期：2023－10－22基金项目：湖南省自然科学科药联合基金项目（2022JJ80037）∗通讯作者：汪辉，硕士，高级工程师，研究方向：食品和化妆品成分分析，E-mail：wanghuei158@doi：10.12452/j.fxcsxb.23081602255第 2 期邓楠等：QuEChERS/超高效液相色谱-串联质谱法同时测定大米中16种香豆素和香兰素及其衍生物大米是中国人饮食结构中必不可缺的食材，其质量安全关乎人民的身体健康。
基因毒性杂质研究专栏㊀基金项目:中国食品药品检定研究院关键技术研究基金(Ｎｏ.ＧＪＪＳ－２０２２－４－１)ꎻ＃同为第一作者ꎬ∗同为通信作者作者简介:黄海伟ꎬ男ꎬ副主任药师ꎬ研究方向:药品质量安全研究ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｈｕａｎｇｈｗ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎꎻ袁松ꎬ男ꎬ助理研究员ꎬ研究方向:化学药品质量控制研究ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｙｕａｎｓｏｎｇ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎ通信作者:刘阳ꎬ男ꎬ研究员ꎬ研究方向:药品质量安全研究ꎬＴｅｌ:０１０－５３８５１５７１ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｙａｎｇｌｉｕ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎꎻ张庆生ꎬ男ꎬ主任药师ꎬ研究方向:药品质量安全研究ꎬＴｅｌ:０１０－５３８５１３７５ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｚｑｓ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎＵＨＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ法测定盐酸普萘洛尔缓释片中基因毒性杂质Ｎ－亚硝基普萘洛尔黄海伟＃ꎬ袁松＃ꎬ张娜ꎬ张龙浩ꎬ刘阳∗ꎬ张庆生∗(中国食品药品检定研究院ꎬ国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室ꎬ北京１０２６２９)摘要:目的㊀建立盐酸普萘洛尔缓释片中基因毒性杂质Ｎ－亚硝基普萘洛尔的超高效液相色谱－串联质谱(ＵＨＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ)检测方法ꎮ方法㊀ＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＣＳＨＴＭＣ１８色谱柱(３.０ｍｍˑ１５０ｍｍꎬ１.７μｍ)ꎬ１０ｍｍｏｌ Ｌ－１甲酸铵的水溶液(含０.１％甲酸)作为流动相Ａꎬ乙腈溶液(含０.１％甲酸)作为流动相Ｂꎬ梯度洗脱ꎬ流速为０.５ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬ柱温为５０ħꎬ进样器温度为５ħꎬ进样体积为１０μＬꎬ采用多反应监测(ＭＲＭ)模式ꎬ对盐酸普萘洛尔缓释片中的Ｎ－亚硝基普萘洛尔进行定量检测ꎮ结果㊀Ｎ－亚硝基普萘洛尔在１~２０ｎｇ ｍＬ－１范围内具有良好的线性关系ꎮ低㊁中㊁高３个浓度的加样回收率(ｎ＝３)在９８.４％~１０３.２％之间ꎬＲＳＤɤ２.７％ꎮ检测限和定量限分别为０.０９ｎｇ ｍＬ－１和０.３ｎｇ ｍＬ－１ꎮ检出盐酸普萘洛尔缓释片中基因毒性杂质Ｎ－亚硝基普萘洛尔含量为１.８μｇ ｇ－１ꎮ结论㊀该方法灵敏度高㊁专属性强ꎬ可用于测定盐酸普萘洛尔缓释片中的Ｎ－亚硝基普萘洛尔ꎬ为盐酸普萘洛尔缓释片的质量控制提供参考ꎮ关键词:Ｎ－亚硝基普萘洛尔ꎻ基因毒杂质ꎻ盐酸普萘洛尔缓释片ꎻ含量测定ꎻ超高效液相色谱－串联质谱中图分类号:Ｒ９２７.１㊀文献标志码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２３)０７－０４８１－００４ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２３.０７.００９ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｍｐｕｒｉｔｙＮ－ｎｉｔｒｏｓｏ－ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌｉｎＰｒｏｐｒａｎｏｌｏｌＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅＳｕｓｔａｉｎｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅＴａｂｌｅｔｓｂｙＵＨＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳＨＵＡＮＧＨａｉｗｅｉ＃ꎬＹＵＡＮＳｏｎｇ＃ꎬＺＨＡＮＧＮａꎬＺＨＡＮＧＬｏｎｇｈａｏꎬＬＩＵＹａｎｇ∗ꎬＺＨＡＮＧＱｉｎｇｓｈｅｎｇ∗(ＮＭＰＡＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＱｕａｌｉｔｙＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＤｒｕｇｓꎬＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０２６２９ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎＵＨＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＮ－ｎｉｔｒｏｓｏ－ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌｉｎＰｒｏｐ￣ｒａｎｏｌｏｌＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅＳｕｓｔａｉｎｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅＴａｂｌｅｔｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＴｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＮ－ｎｉｔｒｏｓｏ－ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎａＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＣＳＨＴＭＣ１８ｃｏｌｕｍｎ(１５０ｍｍˑ３.０ｍｍꎬ１.７μｍ)ｗｉｔｈ１０ｍｍｏｌ Ｌ－１ａｍｍｏｎｉｕｍｆｏｒｍａｔｅａｑｕｅｏｕｓｓｏ￣ｌｕｔｉｏｎ(ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ０.１％ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄ)ａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＡａｎｄａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅｓｏｌｕｔｉｏｎ(ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ０.１％ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄ)ａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＢｕｎｄｅｒａｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎａｔａｆｌｏｗｒａｔｅｏｆ０.５ｍＬ ｍｉｎ－１ａｎｄａｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆ５０ħ.Ｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｎｉ￣ｔｏｒｉｎｇ(ＭＲＭ)ｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎａｔｒｉｐｌｅｑｕａｄｒｕｐｏｌｅｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｉｎｐｏｓｉｔｉｖｅｍｏｄｅ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｗａｓｉｎｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｉｔｙｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ１~２０ｎｇ ｍＬ－１.Ｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ(ｎ＝３)ａｔｌｏｗꎬｍｉｄｄｌｅａｎｄｈｉｇｈｓｐｉｋｅｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｗｉｔｈｉｎ９８.４％~１０３.２％ｗｉｔｈＲＳＤｕｎｄｅｒ２.７％.Ｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｓ０.０９ｎｇ ｍＬ－１ꎬａｎｄｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｗａｓ０.３ｎｇ ｍＬ－１.ＵｓｉｎｇｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｍｅｔｈｏｄꎬｗｅｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅＮ－ｎｉｔｒｏｓｏ－ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌｉｎＰｒｏｐｒａｎｏｌｏｌＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅＳｕｓ￣ｔａｉｎｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅＴａｂｌｅｔｓｗａｓ１.８μｇ ｇ－１.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄａｃｃｕｒａｔｅꎬｗｈｉｃｈｃａｎｂｅａｐｐｌｉｅｄｆｏｒｔｈｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＮ－ｎｉｔｒｏｓｏ－ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌｉｎＰｒｏｐｒａｎｏｌｏｌＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅＳｕｓｔａｉｎｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅＴａｂｌｅｔｓꎬｐｒｏｖｉｄｉｎｇｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆＰｒｏｐｒａｎｏｌｏｌＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅＳｕｓｔａｉｎｅｄＲｅｌｅａｓｅｔａｂｌｅｔｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏ－ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌꎻＧｅｎｏｔｏｘｉｃｉｍｐｕｒｉｔｙꎻＰｒｏｐｒａｎｏｌｏｌｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅｔａｂｌｅｔｓꎻＡｓｓａｙꎻＵＨＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ㊀㊀盐酸普萘洛尔化学名称为１－异丙基－３－(１－萘氧基)－２－丙醇盐酸盐(见图１Ａ)ꎬ盐酸普萘洛尔为非选择性竞争抑制β受体阻滞剂[１]ꎬ临床上常用于高血压㊁心律失常和心绞痛的治疗[２－３]ꎮ２０２２年３月加拿大卫生部(ＨｅａｌｔｈＣａｎａｄａ)发布通告ꎬ辉瑞制药公司自愿召回６０㊁８０㊁１２０㊁１６０ｍｇ４种规格共２９批次盐酸普萘洛尔缓释胶囊ꎬ此次召回是因为在这些批次中检测出超过每天允许摄入量的Ｎ－亚硝基普萘洛尔(见图１Ｂ)[４－５]ꎮＮ－亚硝基类化合物具有直接或间接的致癌作用ꎬ长期小剂量接触或单次较大剂量接触都可能致癌[６－８]ꎬ亚硝胺类化合物是由于药物生产过程中发生了某些副反应而产生ꎮ自２０１８年缬沙坦中Ｎ－二甲基亚硝胺(ＮＤＭＡ)检出以来ꎬ又有Ｎ－二乙基亚硝胺(ＮＤＥＡ)㊁Ｎ－亚硝基－Ｎ－甲基－４－氨基丁酸(ＮＭＢＡ)等杂质陆续在药品中检出ꎬ国家药品监督管理局㊁美国食品药品监督管理局(ＦＤＡ)以及欧洲药品管理局(ＥＭＡ)都发布了有关药品中遗传毒性杂质控制策略㊁检测方法以及限度要求等指导原则ꎬ多个药品因Ｎ－亚硝基类化合物超出每日允许摄入量被召回[９－１１]ꎮ已报道的Ｎ－亚硝基类化合物主要分为两类ꎬ一类与药物本身结构无关ꎬ在药品生产过程中由残留溶剂等引入ꎬ例如ＮＤＭＡ㊁ＮＤＥＡ等ꎻ一类则直接与药物本身相关ꎬ通常是原料药中的仲胺结构与微量残留的亚硝酸盐反应生成相应的杂质[１２－１４]ꎮＮ－亚硝基普萘洛尔属于上述的第二类杂质ꎬ只在普萘洛尔相关制剂中被发现ꎮ目前尚无该基因毒性杂质检测及限度的相关报道ꎬ本文拟采用超高效液相色谱－串联质谱(ＵＨＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ)建立盐酸普萘洛尔缓释片中Ｎ－亚硝基普萘洛尔的检测方法ꎬ为盐酸普萘洛尔中遗传毒性杂质检查和质量控制提供参考依据ꎮ１㊀材料１.１㊀仪器㊀Ａｇｉｌｅｎｔ１２９０－６４７０液相色谱－串联三重四级杆质谱仪(美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司)ꎬ配备电喷雾离子源(ＥＳＩ)和Ｍａｓｓｈｕｎｔｅｒ数据处理系统ꎻＸＰ２０５ＤＲ型电子分析天平(瑞士Ｍｅｔｔｌｅｒ公司)ꎬＭｉｌｌｉ－Ｑ超纯水纯化系统(美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司)ꎮ１.２㊀药物与试剂㊀甲醇(质谱级ꎬ美国ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎ￣图１㊀盐酸普萘洛尔(Ａ)及Ｎ－亚硝酸普萘洛尔(Ｂ)的结构式ｔｉｆｉｃ公司)ꎬ乙腈(质谱级ꎬ美国Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司)ꎬ甲酸(质谱级ꎬ德国Ｍｅｒｃｋ公司)ꎬ甲酸铵(质谱级ꎬ美国ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司)ꎬ水为超纯水ꎬＮ－亚硝基普萘洛尔对照品(批号:ＰＮ２０２２０３１２ꎬＰＥＲＩＤＡ公司ꎬ纯度９６.８％)ꎬ盐酸普萘洛尔缓释片(市场采购)ꎮ２㊀方法与结果２.１㊀溶液制备㊀２.１.１㊀标准曲线对照品溶液制备㊀精密称取Ｎ－亚硝基普萘洛尔对照品１０.４３ｍｇꎬ置１００ｍＬ量瓶中ꎬ加甲醇使溶解并稀释至刻度ꎬ摇匀ꎬ作为对照品储备液ꎮ精密量取对照品储备液０.１ｍＬꎬ置１００ｍＬ量瓶中ꎬ用甲醇稀释至刻度ꎬ摇匀ꎬ精密量取１.０㊁２.０㊁５.０㊁７.０㊁１０.０㊁１０.０ｍＬ上述溶液分别置１００㊁１００㊁１００㊁１００㊁１００㊁５０ｍＬ量瓶中ꎬ用甲醇稀释至刻度ꎬ摇匀ꎬ作为浓度分别约为１.０㊁２.０㊁５.０㊁７.０㊁１０.０㊁２０.０ｎｇ ｍＬ－１的系列线性溶液ꎮ２.１.２㊀供试品溶液制备㊀取本品１０片ꎬ精密称定ꎬ研细ꎬ混匀ꎬ精密称取约相当于盐酸普萘洛尔２０ｍｇ的细粉ꎬ置１５ｍＬ离心管中ꎬ精密加入甲醇５ｍＬꎬ涡旋３ｍｉｎꎬ滤过ꎬ取续滤液作为供试品溶液ꎮ２.２㊀色谱及质谱条件㊀２.２.１㊀色谱条件㊀采用ＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＣＳＨＴＭＣ１８(１５０ｍｍˑ３.０ｍｍꎬ１.７μｍ)色谱柱ꎻ以１０ｍｍｏｌ Ｌ－１甲酸铵的水溶液(含０.１％甲酸)作为流动相Ａꎬ乙腈溶液(含０.１％甲酸)作为流动相Ｂꎬ梯度洗脱:０.０~５.０ｍｉｎꎬ５０％Ｂꎻ５.０~７.０ｍｉｎꎬ５０％Ｂң７０％Ｂꎻ７.０~９.０ｍｉｎꎬ７０％Ｂꎻ９.０~９.０ｍｉｎꎬ７０％Ｂң５０％Ｂꎻ９.０~１３.０ｍｉｎꎬ５０％Ｂꎻ流速为０.５ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬ柱温为５０ħꎬ进样器温度为５ħꎬ进样体积为１０μＬꎮ２.２.２㊀质谱条件㊀采用电喷雾离子源(ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎｉｚａｔｉｏｎＳｏｕｒｃｅꎬＥＳＩ)ꎬ正离子检测模式ꎬ干燥气温度为３００ħꎬ干燥气流量为６Ｌ ｍｉｎ－１ꎬ喷雾电压为３５ｐｓｉꎬ鞘气温度为３５０ħꎬ鞘气流量为１０Ｌ ｍｉｎ－１ꎬ毛细管电压为４５００Ｖꎮ采集方式为多反应监测(ＭｕｌｔｉｐｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｎｉｔｏｒꎬＭＲＭ)模式ꎬ以ｍ/ｚ２８９.２ң７２.２作为定量离子对ꎬ碎裂电压为７８Ｖꎬ碰撞电压为１２Ｖꎬ以ｍ/ｚ２８９.２ң１４５.１作为定性离子对ꎬ碎裂电压为７８Ｖꎬ碰撞电压为１２Ｖꎮ２.３㊀方法学考察㊀２.３.１㊀专属性试验㊀取甲醇作为空白溶剂和 ２.１.１ 项下１ｎｇ ｍＬ－１的对照品溶液ꎬ分别进样ꎬ记录色谱图(见图２)ꎬ在所建立的色谱和质谱条件下ꎬＮ－亚硝基普萘洛尔的保留时间为６.７４ｍｉｎꎬ峰型良好ꎬ空白溶剂对检测无干扰ꎮＡ.甲醇溶液ꎻＢ.对照品溶液图２㊀甲醇和对照品溶液提取离子流色谱图２.３.２㊀检测限与定量限试验㊀取 ２.１.１ 项下１ｎｇ ｍＬ－１的线性溶液ꎬ以甲醇为稀释剂逐步稀释ꎬ分别在信噪比(Ｓ/Ｎ)为１０ʒ１和３ʒ１时作为定量限和检测限ꎬ测得Ｎ－亚硝基普萘洛尔的定量限和检测限分别为０.３㊁０.０９ｎｇ ｍＬ－１ꎮ２.３.３㊀线性关系考察㊀精密量取 ２.１.１ 项下系列线性溶液ꎬ进样检测ꎬ记录色谱图ꎮ以Ｎ－亚硝基普萘洛尔峰面积Ｙ为纵坐标ꎬ以质量浓度Ｘ(ｎｇ ｍＬ－１)为横坐标进行线性回归ꎬ得Ｎ－亚硝基普萘洛尔的线性回归方程为Ｙ＝２５６３.３８Ｘ－１６１.３８(ｒ＝０.９９９９)ꎬ结果表明在１.０１~２０.１９ｎｇ ｍＬ－１浓度范围内ꎬＮ－亚硝基普萘洛尔峰面积与质量浓度之间呈良好的线性关系ꎮ２.３.４㊀精密度和重复性试验㊀取 ２.１.１ 项下５.０ｎｇ ｍＬ－１的线性溶液连续进样６次ꎬ得Ｎ－亚硝基普萘洛尔峰面积的ＲＳＤ为１.１３％ꎬ结果表明系统精密度良好ꎮ取盐酸普萘洛尔缓释片ꎬ按 ２.１.２ 项下方法平行制备６份供试品溶液ꎬ进样检测ꎬ按标准曲线法计算Ｎ－亚硝基普萘洛尔含量ꎬ计算得６份供试品溶液中Ｎ－亚硝基普萘洛尔含量的ＲＳＤ为３.５８％ꎮ结果表明方法具有良好的重复性ꎮ２.３.５㊀稳定性试验㊀取 ２.１.１ 项下５.０ｎｇ ｍＬ－１的线性溶液ꎬ放置于进样盘ꎬ分别在０㊁８ｈ进样检测ꎬ结果Ｎ－亚硝基普萘洛尔峰面积的相对偏差为２.９６％ꎬ结果表明５ħ条件下对照品溶液在８ｈ内稳定ꎻ取 ２.３.４ 项下１份重复性试验供试溶液ꎬ放置于进样盘ꎬ分别在０㊁２㊁５㊁７ｈ进样检测ꎮ结果Ｎ－亚硝基普萘洛尔峰面积的ＲＳＤ(ｎ＝４)为２.６６％ꎬ结果表明５ħ条件下供试品溶液在７ｈ内稳定ꎮ２.３.６㊀提取效率试验㊀取盐酸普萘洛尔缓释片ꎬ按 ２.１.２ 项下方法平行制备２份供试品溶液ꎬ其中１份涡旋３ｍｉｎꎬ另一份涡旋１０ｍｉｎꎬ进样检测ꎬ按标准曲线法计算Ｎ－亚硝基普萘洛尔含量ꎬ计算得２份供试品溶液中Ｎ－亚硝基普萘洛尔含量相对标对偏差为３.７７％ꎮ结果表明涡旋３ｍｉｎ可提取完全ꎮ２.３.７㊀回收率试验㊀取盐酸普萘洛尔缓释片ꎬ精密称定ꎬ研细ꎬ混匀ꎬ精密称取细粉约５７ｍｇ(约相当于盐酸普萘洛尔２０ｍｇ)ꎬ置１５ｍＬ离心管中ꎬ精密加入 ２.１.１ 项下１０ｎｇ ｍＬ－１(高浓度)㊁５ｎｇ ｍＬ－１(中浓度)㊁２ｎｇ ｍＬ－１(低浓度)的线性溶液５ｍＬꎬ涡旋３ｍｉｎꎬ滤过ꎬ取续滤液作为回收率溶液ꎬ每个浓度点平行制备３份ꎬ进样检测ꎬ结果见表１ꎬ低㊁中㊁高浓度点的回收率分别为９８.４％(ＲＳＤ２.７％ꎬｎ＝３)㊁１０１.６％(ＲＳＤ１.１％ꎬｎ＝３)㊁１０３.２％(ＲＳＤ１.５％ꎬｎ＝３)ꎬ结果表明回收率良好ꎮ表１㊀加样回收率结果编号加入量检测量本底回收率平均回收ＲＳＤ５２６.１０６１.７４３５.１８１０１.７６１０１.６１.１２.４㊀样品测定㊀按 ２.１ 项下制备盐酸普萘洛尔缓释片供试品溶液ꎬ照 ２.２ 项下条件进样检测ꎬ记录色谱图ꎬ以峰面积按标准曲线法计算供试品溶液中Ｎ－亚硝基普萘洛尔的含量ꎬ测得盐酸普萘洛尔缓释片中Ｎ－亚硝基普萘洛尔含量为１.８μｇ ｇ－１ꎮ３㊀讨论由于盐酸普萘洛尔供试品溶液浓度较高ꎬ普萘洛尔峰与Ｎ－亚硝基普萘洛尔峰需要达到较大的分离度ꎬ才能将普萘洛尔峰切入废液不至于干扰杂质的检测ꎬ所以首先对不同类型的色谱柱进行了考察ꎬ最终选用ＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＣＳＨＴＭＣ１８色谱柱ꎬＮ－亚硝基普萘洛尔峰型良好ꎬ且可与普萘洛尔峰完全分离ꎬ但两者洗脱时间较长ꎬ为提高实验效率在此基础上对色谱条件进行优化ꎬ增加有机相比例以缩短分析时间ꎻ不同流动相系统对色谱保留和杂质的质谱响应影响非常大ꎬ对流动相系统进行了考察ꎬ当采用乙腈为流动相时体系ꎬＮ－亚硝基普萘洛尔出峰较快ꎬ且质谱响应增强ꎬ可满足分析的分离度要求ꎮ前期的试验显示Ｎ－亚硝基普萘洛尔在甲醇中易溶ꎬ在乙腈中微溶ꎬ以甲醇－水作为溶剂为较优选择ꎬ但缓释片加极少量水后即成凝胶状无法进样检测ꎬ为保证提取完全和样品检测的准确性ꎬ选择了以甲醇作为溶剂ꎬ以甲醇作为溶剂时ꎬ存在一定的溶剂效应ꎬＮ－亚硝基普萘洛尔峰前沿ꎬ峰形变宽ꎬ灵敏度降低ꎬ为此ꎬ采用较大内径的色谱柱ꎬ并增加进样体积至１０μＬꎬ即可满足Ｎ－亚硝基普萘洛尔检测灵敏度的要求ꎮ目前未见Ｎ－亚硝基普萘洛尔的毒理学数据ꎬ暂无明确控制限度ꎬ提示药品研发生产㊁相关科研机构应对杂质进行深入的毒理研究以建立合理的控制限度ꎬ保障用药安全ꎮ４㊀结论本研究建立了盐酸普萘洛尔缓释片中Ｎ－亚硝基普萘洛尔的ＵＨＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ检测方法ꎬ并进行了相关方法学验证ꎬ结果表明ꎬ所建立的方法具有良好的专属性㊁灵敏度和准确度ꎬ可准确测定盐酸普萘洛尔缓释片中潜在的Ｎ－亚硝基普萘洛尔的含量ꎬ有助于盐酸普萘洛尔缓释片的市场监管ꎬ保障药品质量安全ꎮ参考文献:[１]㊀ＧＲＥＣＯＡꎬＤᶄＥＲＭＥＡＭꎬＧＡＬＬＡＲＡＴＩＢＺꎬｅｔａｌ.Ａｆｕｒ￣ｔｈｅｒｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｏｆｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌｆｏｒｓｅｖｅｒｅｉｎｆａｎｔｉｌｅｈｅｍａｎ￣ｇｉｏｍａｓｏｆｔｈｅｆａｃｅ:ａｎｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｙ[Ｊ].ＤｅｒｍａｔｏｌＴ￣ｈｅｒꎬ２０１４ꎬ２７(４):１９８－２０２.[２]ＣＨＯＢＡＮＩＡＮＡＶꎬＢＡＫＲＩＳＧＬꎬＢＬＡＣＫＨＲꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｓｅｖｅｎｔｈｒｅｐｏｒｔｏｆｔｈｅＪｏｉｎｔｎａｔｉｏｎａｌｃｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎｐｒｅｖｅｎ￣ｔｉｏｎꎬｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎬｅｖａｌｕａｔｉｏｎꎬａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｈｉｇｈｂｌｏｏｄｐｒｅｓｓｕｒｅ－ＴｈｅＪＮＣ７ｒｅｐｏｒｔ[Ｊ].ＪＡＭＡꎬ２００３ꎬ２８９(１９):２５６０－２５７２.[３]汪传辉.普萘洛尔在临床上的合理应用[Ｊ].中国药业ꎬ１９９７(１０):２７－２８.[４]ＨｅａｌｔｈＣａｎａｄａ.Ｐｆｉｚｅｒｒｅｃａｌｌｓｄｅｒａｌ－ＬＡ(ＰｒｏｐｒａｎｏｌｏｌＨｙｄｒｏ￣ｃｈｌｏｒｉｄｅ)ｃａｐｓｕｌｅｓｄｕｅｔｏａｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｉｍｐｕｒｉｔｙ[Ｊ/ＯＬ].[２０２１－０３－０１].ｈｔｔｐｓ://ｒｅｃａｌｌｓ－ｒａｐｐｅｌｓ.ｃａｎａｄａ.ｃａ/ｅｎ/ａｌｅｒｔ－ｒｅｃａｌｌ/ｐｆｉｚｅｒ－ｒｅｃａｌｌｓ－ｉｎｄｅｒａｌ－ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ－ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ－ｃａｐｓｕｌｅｓ－ｄｕｅ－ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ－ｉｍｐｕｒｉｔｙ＃ｗｂ－ａｕｔｏ－２. [５]ＨｅａｌｔｈＣａｎａｄａ.Ｉｎｄｅｒａｌ－ＬＡ:ＮｉｔｒｏｓａｍｉｎｅＩｍｐｕｒｉｔｙ[Ｊ/ＯＬ].[２０２１－０３－０２].ｈｔｔｐｓ://ｒｅｃａｌｌｓ－ｒａｐｐｅｌｓ.ｃａｎａｄａ.ｃａ/ｅｎ/ａｌｅｒｔ－ｒｅｃａｌｌ/ｉｎｄｅｒａｌ－ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ－ｉｍｐｕｒｉｔｙ. [６]ＡＮＤＲＺＥＪＥＷＳＫＩＰꎬＫＡＳＰＲＺＹＫ－ＨＯＲＤＥＲＮＢꎬＮＡＷＲＯＣＫＩＪ.ＴｈｅｈａｚａｒｄｏｆＮ－ｎｉｔｒｏｓｏｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ(ＮＤＭＡ)ｆｏｒｍａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｗａｔｅｒｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｓｔｒｏｎｇｏｘｉｄａｎｔｓ[Ｊ].Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎꎬ２００５ꎬ１７６(１/２/３):３７－４５. [７]ＳＥＮＴＨＯＮＧＰꎬＢＯＲＩＢＯＯＮＵ.Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅꎬｃａｒｂｏｎｂｌａｃｋａｎｄｄｕｓｔｉｎｒｕｂｂｅｒｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｉｎｄｕｓｔｒｙ[Ｊ].ＩｎｔＪＯｃｃｕｐＥｎｖｉｒｏｎＭｅｄꎬ２０１７ꎬ８(３):１８１－１８３.[８]ＰＲＥＵＳＳＭＡＮＮＲ.ＣａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃＮ－ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓａｎｄｔｈｅｉｒｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎꎬ１９８４ꎬ７１(１):２５－３０.[９]ＦＤＡ.ＬｕｐｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓꎬＩｎｃ.ＩｓｓｕｅｓＶｏｌｕｎｔａｒｉｌｙＮａｔｉｏｎｗｉｄｅＲｅｃａｌｌｏｆＯｎｅＬｏｔｏｆＭｅｔｆｏｒｍｉｎＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅＥｘｔｅｎｄｅｄ－ＲｅｌｅａｓｅＴａｂｌｅｔｓＵＳＰꎬ５００ｍｇＤｕｅｔｏｔｈｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＮ－Ｎｉｔｒｏｓｏｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ(ＮＤＭＡ)[Ｊ/ＯＬ].[２０２０－０６－１１].ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｐｒｎｅｗｓｗｉｒｅ.ｃｏｍ/ｎｅｗｓ－ｒｅｌｅａｓｅｓ/ｌｕｐｉｎ－ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ－ｉｎｃ－ｉｓｓｕｅｓ－ｖｏｌｕｎｔａｒｉｌｙ－ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ－ｒｅｃａｌｌ－ｏｆ－ｏｎｅ－ｌｏｔ－ｏｆ－ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ－ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ－ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅ－ｔａｂｌｅｔｓ－ｕｓｐ－５００ｍｇ－ｄｕｅ－ｔｏ－ｔｈｅ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－ｏｆ－ｎ－ｎｉ￣ｔｒｏｓｏｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ－ｎｄｍａ－３０１０７４１８９.ｈｔｍｌ.[１０]ＨｅａｌｔｈＣａｎａｄａ.ＡｕｒｏＰｈａｒｍａＩｎｃ.ｖｏｌｕｎｔａｒｉｌｙｒｅｃａｌｌｓｏｎｅｌｏｔｏｆＡｕｒｏ－ＩｒｂｅｓａｒｔａｎＨＣＴｔａｂｌｅｔｓｂｅｃａｕｓｅｏｆｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｉｍｐｕｒｉｔｙ[Ｊ/ＯＬ].[２０１９－０４－１８].ＡｕｒｏＰｈａｒｍａＩｎｃ.ｖｏｌ￣ｕｎｔａｒｉｌｙｒｅｃａｌｌｓｏｎｅｌｏｔｏｆＡｕｒｏ－ＩｒｂｅｓａｒｔａｎＨＣＴｔａｂｌｅｔｓｂｅｃａｕｓｅｏｆｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｉｍｐｕｒｉｔｙ－Ｃａｎａｄａ.ｃａ.[１１]ＦＤＡ.ＰｆｉｚｅｒＩｓｓｕｅｓａＶｏｌｕｎｔａｒｙＮａｔｉｏｎｗｉｄｅＲｅｃａｌｌｆｏｒＴｗｅｌｖｅＬｏｔｓｏｆＣＨＡＮＴＩＸ(Ｖａｒｅｎｉｃｌｉｎｅ)ＴａｂｌｅｔｓＤｕｅｔｏＮ－ＮｉｔｒｏｓｏＶａｒｅｎｉｃｌｉｎｅＣｏｎｔｅｎｔ[Ｊ/ＯＬ].[２０２１－０７－１９].ｈｔ￣ｔｐｓ://ｗｗｗ.ｆｄａ.ｇｏｖ/ｓａｆｅｔｙ/ｒｅｃａｌｌｓ－ｍａｒｋｅｔ－ｗｉｔｈｄｒａｗａｌｓ－ｓａｆｅｔｙ－ａｌｅｒｔｓ/ｐｆｉｚｅｒ－ｉｓｓｕｅｓ－ｖｏｌｕｎｔａｒｙ－ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ－ｒｅｃａｌｌ－ｔｗｅｌｖｅ－ｌｏｔｓ－ｃｈａｎｔｉｘｒ－ｖａｒｅｎｉｃｌｉｎｅ－ｔａｂｌｅｔｓ－ｄｕｅ－ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏ. [１２]ＫＡＯＹＴꎬＷＡＮＧＳＦꎬＷＵＭＨ.ｅｔａｌ.Ａｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｐｐｒｏａｃｈｔｏｕｎｃｏｖｅｒＮ－ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｓｉｎｄｒｕｇｓｕｂ￣ｓｔａｎｃｅｓ[Ｊ].ＪＦｏｏｄＤｒｕｇＡｎａｌꎬ２０２２ꎬ３０(１):１５０－１６２. [１３]ＢＯＤＩＮＴꎬＶＯＲＡＳＩＴＶ.ＮｉｔｒｏｓａｍｉｎｅＣｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ:ＴｈｒｅａｔꎬＩｍｐａｃｔꎬａｎｄＣｏｎｔｒｏｌ[Ｊ].ＪＰｈａｒｍＳｃｉꎬ２０２１ꎬ１１０(９):３１１８－３１２８.[１４]ＳＯＮＡＬＩＳＢ.Ｃｒｉｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｒｕｇｐｒｏｄｕｃｔｒｅｃａｌｌｓｄｕｅｔｏｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ[Ｊ].ＪＭｅｄＣｈｅｍꎬ２０２１ꎬ６４(６):２９２３－２９３６.(收稿日期:２０２３－０２－２５)。
转基因植物的检测与鉴定宫雪超于丽杰高金秋哈尔滨师范大学环境与生命科学院黑龙江哈尔滨摘要对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围转基因植物的检测和鉴定方法转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述关键词转基因植物检测鉴定评价中图分类法文献标识码文章编号植物转基因实验因受体系统的限制外源基因的转化频率较低为了达到转化目的必然要获得大量的转化材料如何在数以千万计的转化植株或细胞中快速有效地检测出转基因阳性植株或细胞外源基因是否整合到植物染色体上整合的方式如何整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题就成为重要的研究课题根据外源基因表达的不同水平对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行整合水平转录水平和翻译水平本文从外源基因表达的不同水平阐述转基因植物的检测与鉴定外源基因整合水平的鉴定检测外源基因是否转化成功首先是对报告基因进行检测必要时再进行目的基因的检测检测目的基因需要采用分子杂交方法报告基因报告基因必须具有两大特点一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在二是便于检测目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因大致分为两类抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因现在常用的报告基因主要有基因基因冠瘿碱合成酶基因H基因基因基因荧光素酶基因二氢叶酸还原酶基因等近年来绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用并显示出较其他几个报告基因更大的优越性基因的检测基因具有以下优点①适用于各种生物的基因转化②检测方法简便无需底物酶辅因子等物质只要有紫外光或蓝光照射其表达产物就可以发出绿色荧光这对转化细胞的检测极为有利③便于活体检测十分有利于活体内基因表达调控的研究④检测时可获得直观信息有利于转基因植物安全性问题的研究及防范若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时很容易通过光照获得直观信息基因的检测基因也是广泛用作转基因植物细菌和真菌的报告基因尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中基因应用的最多基因端与其他结构形成的融合基因能正常表达所产生的融合蛋白仍具有活性这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件这是它的一大优点但是需要注意的是有一些植物在胚胎状态时能产生内源活性在转基因和代的子叶花粉和胚珠中检测到活性随着组织的成熟衰老表达逐渐停止在实验过程中要设定严格的阴性对照活性的检测方法有很多包括组织化学法色谱法荧光法等其中植物切片组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法转基因植株的检测聚合酶链式反应是首选的转基因产品检测方法技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段可以检测到每克样品含有～的转化基因成分对转基因产品大分子量检测的灵敏度可以达到样品含量的因为的高度特异性及检测所需的模板量仅为以内所以为外源基因整合的检测提供了便利条件尤其是在转化材料少又需及早检测的时候现在已经利用该技术对欧美杨番茄辣椒葡萄豆瓣菜小麦等转基因植物进行鉴定是转基因植物鉴定中最简单最常用的方法检测具有用量少操作简单成本低耗时少不需要同位素等优点但检测也存在缺点由于扩增十分灵敏有时会出现假阳性扩增因此检测只能作为初步结果杂交证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是杂交只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物年第期牡丹江师范学院学报自然科学版总第期收稿日期利用杂交~可以确定外源基因在植物中的组织结构和整合位置~拷贝数以及转基因植株世代外源基因的稳定性]分子杂交是进行核酸序列分析~重组子鉴定及检测外源基因整合表达的强有力手段~它具有灵敏性高~特异性强的特点~是当前鉴定外源基因整合及表达的权威方法杂交可以清除操作过程中的污染以及转化愈伤组织中质粒残留所引起的假阳性信号~准确度高~但杂交程序复杂~成本高~且对实验技术条件要求较高根据杂交时所用的方法~核酸分子杂交又可分为印迹杂交<>~斑点<>杂交或狭缝<>杂交和细胞原位<>杂交等现在已在水稻]~玉米~大白菜]~豆瓣菜]~马铃薯~杏~烟草等植物中得到广泛应用外源基因转录水平的鉴定转录水平上的检测方法主要就是杂交~它以和探针杂交的技术检测基因在转录水平上的表达杂交杂交和杂交相比~更接近性状表现~更具有现实意义~被广泛用于转基因植物的检测~]~现已用于杨树~豆瓣菜~马铃薯~草莓~烟草等转基因植物的检测中但提取条件严格~在材料内含量不如高~不适于大批量样品的检测检测<>也是检测外源在植物体内转录表达的一种方法如果从细胞总提取物中得到特异的扩增条带~则表明外源基因实现了转录此法简单~快速~但对外源基因转录的最后决定~还需与杂交的实验结果结合外源基因表达蛋白的检测外源基因编码的蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能是植物基因工程的最终目的杂交杂交是集蛋白质电泳~印迹和免疫测定为一体的检测方法它具有很高的灵敏性~可以从植物细胞总蛋白中检出的特异蛋白质~若是提纯的蛋白质~可检出～杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果~可得知被检植物细胞内目的蛋白是否表达~表达的浓度大小及大致的分子量能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录~翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现一般来讲~杂交的结果与性状表现有直接关系~]检测<酶联免疫吸附法>是一种利用免疫学原理检测抗原~抗体的技术由于酶的放大作用~使测定的灵敏度极高~可检测出的目的物~同时酶反应还具有很强的特异性除了可溶性抗原<抗体>之外~还可以检测含表面抗原的细胞该方法已用于辣椒~水稻~烟草~番茄~]等转化植株的鉴定工作中的检测虽然很灵敏~但容易出现本底过高的问题~应予以充分的注意蛋白检测试纸蛋白检测试纸是一种基于的改进方法或者~用于转基因植物表达量的检测]先将特异性抗体吸附在膜上~将膜蘸入样品溶液~蛋白质随着液相扩散~遇到抗体~发生抗原抗体反应~通过阴性对照筛选阳性结果~给出转基因成分含量的大致范围此方法操作简单~费用低~耗时少<～>原位杂交检测原位杂交技术目前在植物基因工程研究中已成为外源基因在染色体上整合定位及在组织细胞内表达定位的主要方法原位杂交技术主要有同位素原位杂交和荧光原位杂交<>~使用放射性同位素标记~放射自显影检出该方法灵敏性强~对于单拷贝的序列检出非常有效原位杂交可以分为三个层次:①染色体原位杂交~可以确定外源基因在染色体上的整合位置及整合方式~还可以研究外源基因的整合方式对外源基因遗传稳定性~外源基因表达的影响~以及不同的转化方式与外源基因整合方式的关系等重大机理问题;②组织细胞原位杂交~对特定的基因表达的进行组织细胞分布的空间定位~获得外源基因在植物组织细胞内表达情况<是否表达~表达位置~表达量等>;③外源基因表达蛋白的组织细胞免疫定位~指利用外源基因表达蛋白的抗体~通过免疫反应确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布该方法也是研究转基因植物中外源基因功能~外源蛋白稳定性及功能蛋白含量的重要手段检测方法的评估用提取方法对目的基因进行检测方法简便~适合大批量样品的分析~又能检测目的基因的完整性~是早期检测的较好方法]~~杂交分别从整合~转录~翻译水平检测外源基因~是检测外源基因最经典~最可靠的方法虽然现在出现了一些像~等功能类似~方便快捷的检测技术~然而由于其技术本身的原因~还不能取代以上技术在转基因植物检测和鉴年第期牡丹江师范学院学报!自然科学版"# !总第期"定上的权威地位随着科学技术的发展 各种新的检测方法也在不断涌现 例如生物传感器筛选法 远红外线光谱法 定量 实时基因芯片等 每种检测方法都有其自身的优点和不足 应该根据不同的检测目的和要求 选择合适的方法 在实际工作中把几种方法结合运用 可获得外源基因不同表达水平的信息 是准确检测转基因植物产品的合理策略参考文献王学聘 卞祖娴 张晋华 等 欧美杨转基因植物的 检测 林业科学 朱新产 导入外源 对小麦基因表达的影响 西北植物学报 刘建强 孙仲序 赵春芝 转基因植物鉴定方法的研究概况 山东林业科技 李乃坚 袁四清 卡那霉素胁迫对转基因烟草种子发芽的影响 广东农业学报毛慧珠 唐惕 曹湘玲 等 抗虫转基因甘蓝及其后代的研究 中国科学 辑编辑 琳莉收稿日期 基金项目 黑龙江发展高新技术产业专项资金无基质喷雾栽培法生产脱毒小薯的研究于洪涛黑龙江省农业科学院绥化研究所 黑龙江绥化摘要 研究了无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不同品种 不同苗来源及不同收获方式对块茎产量的影响 结果表明 无基质喷雾栽培法生产马铃薯小薯以扦插苗分期收获效果最佳 无基质喷雾栽培比较适合栽培早熟品种以早大白最佳 关键词 无基质 马铃薯 脱毒小薯 中图分类法 文献标识码 文章编号在马铃薯良种繁育体系中 原种的生产是关键环节 其质量的高低和数量的多少直接影响马铃薯的生产 无基质喷雾栽培法是一种极有前途的核心种薯生产方法 其主要技术是将适于马铃薯不同发育时期的营养液适时适量地喷于保持在黑暗状态下的马铃薯植株根际 使马铃薯根际获得充分的养分 促进马铃薯块茎的生长 马铃薯喷雾栽培技术在我国尚属起步阶段 提高其生产效率是生产实践中亟待解决的问题 为此 本试验对无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不年第 期牡丹江师范学院学报 自然科学版总第 期转基因植物的检测与鉴定作者：宫雪超， 于丽杰， 高金秋， GONG Xuechao， YU Lijie， GAO Jinqiu作者单位：哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江,哈尔滨,150025刊名：牡丹江师范学院学报（自然科学版）英文刊名：JOURNAL OF MUDANJING TEACHERS' COLLEGE(NATURAL SCIENCES EDITION)年，卷(期)：2007(1)被引用次数：3次1.Datta S K;A Petew hans;K Datta Herbicide-resistance rice plants from IRRI breeding line IR72 after PEG-mediated transformation of protoplasts 19922.Soryu N Transformation of cucumber plant using Agrobaeterium tarme faciens and regeneratinon from hypoceotyl exolants[外文期刊] 1996(11)3.Bryant J;S Leather Removeal of selectable marker genes from transgenic plant:needless sophistication or social necessity 19924.王学聘;卞祖娴;张晋华欧美杨转基因植物的PCR检测 1997(04)5.Morgan A J;P N Cox;D A Turner Transformation of tomoto using an Ri-plasmid rector 19876.朱新产导入外源DNA对小麦基因表达的影响[期刊论文]-西北植物学报 1999(01)7.刘建强;孙仲序;赵春芝转基因植物鉴定方法的研究概况[期刊论文]-山东林业科技 2002(05)8.李乃坚;袁四清卡那霉素胁迫对转基因烟草种子发芽的影响 1998(04)9.Shimamoto K;R Terada;T Lzawa Fertile transgenic rice plants generated from transformed protoplast 198610.毛慧珠;唐惕;曹湘玲抗虫转基因甘蓝及其后代的研究 1996(04)11.John D Plant Genetic Transformation and Gene Expression 198812.Miki B L;H Labbe;J Haffori Transformation of Brassia hapus canola Cultivars with Arabidopsis tbaliana acetohyacid synthase Genes and nalysis of 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Xing-bo转基因植物检测技术研究[期刊论文]-河北农业科学2008,12(7)3.贾月梅转基因植物检测技术的发展[期刊论文]-世界农业2007(6)4.贺熙勇.陈善春.彭爱红.HE Xi-yong.CHEN Shan-chun.PENG Ai-hong转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展[期刊论文]-热带农业科技2008,31(1)5.张莹.张永军.吴孔明.赵奎军.彭于发.郭予元.Zhang Ying.Zhang Yongjun.Wu Kongming.Zhao Kuijun.Peng Yufa.Guo Yuyuan转基因植物的检测策略和检测技术[期刊论文]-植物保护2007,33(1)6.马强.徐勤青.李栋转基因植物检测方法的研究与进展[期刊论文]-种子科技2009,27(4)7.刘信.宋贵文.沈平.厉建萌.Liu Xin.Song Guiwen.Shen Ping.Li Jianmeng国外转基因植物检测技术及其标准化研究综述[期刊论文]-农业科技管理2007,26(4)8.刘建强.孙仲序.赵春芝转基因植物鉴定方法的研究概况[期刊论文]-山东林业科技2002(5)9.芦春斌.Lu Chunbin转基因植物(农产品)中转基因成分的PCR检测[期刊论文]-种子2006,25(1)10.黄亚东.赵文.李校堃.苏志坚.吴春利.何健凡.房师松.HUANG Ya-dong.ZHAO Wen.LI Xiao-Kun.SU Zhi-jian .WU Chun-li.HE Jian-Fan.FANG Shi-Song利用放射免疫技术快速检测转基因植物[期刊论文]-农业生物技术学报2005,13(3)1.王莹.任大明盐芥T-DNA插入突变体库的建立及初步分析[期刊论文]-湖北农业科学 2011(4)2.刘松瑜.谢深喜.陶爱群.周亚洲.周力.沈程清农杆菌介导的果树转基因研究进展[期刊论文]-中国农学通报2009(9)3.王文文.孟艳玲.宗晓娟.王甲威.魏海蓉.崔海金.刘庆忠核果类果树遗传转化及检测技术研究进展[期刊论文] -山东农业科学 2013(4)引用本文格式：宫雪超.于丽杰.高金秋.GONG Xuechao.YU Lijie.GAO Jinqiu转基因植物的检测与鉴定[期刊论文]-牡丹江师范学院学报（自然科学版） 2007(1)。
江西农业学报㊀２０２１，３３（０５）：９０ ９５ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＪｉａｎｇｘｉ㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀ＤＯＩ：１０．１９３８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｘｎｙｘｂ．２０２１．０５．０１４ＱｕＥＣｈＥＲＳ－气相色谱质谱法测定果蔬菌类中１０种农药残留及基质效应研究熊潇垚，任岗，董照锋，曹秀荣，赵亚婷㊀㊀收稿日期：２０２０－１１－２５基金项目：国家重点研发计划 秦巴山区食用菌中化学污染物识别控制技术研究 （２０１９ＹＦＣ１６０６７０１）㊂作者简介：熊潇垚（１９９１─），女，陕西商洛人，农艺师，农业推广学硕士，从事农产品质量安全检测技术工作㊂（商洛市农产品质量安全检验检测中心，陕西商洛７２６０００）摘㊀要：建立了ＱｕＥＣｈＥＲＳ前处理结合气相色谱质谱法测定蔬菜㊁水果㊁食用菌中１０种农药残留的方法，研究了在该方法下１０种农药分别在西红柿㊁草莓㊁白菜㊁青菜和香菇基质中的基质效应，探讨了基质种类㊁基质浓度㊁农药浓度对基质效应的影响㊂结果表明：不同基质中的１０种农药在０．０１ ２．００μｇ／ｍＬ浓度范围内线性关系良好，平均回收率为８８．５％ １０５．７％，相对标准偏差（ｎ＝６）为０．４％ ５．１％㊂５种果蔬食用菌对１０种农药均存在不同程度的基质效应，基质种类㊁基质浓度和农药浓度均会影响基质效应强度，而颜色较深的果蔬的基质效应较强，且随着基质浓度的增加，其基质效应逐渐增强，而高浓度农药较低浓度的基质效应强㊂对于果蔬㊁食用菌农药残留的检测，必须考虑基质效应的影响㊂关键词：ＱｕＥＣｈＥＲＳ；气相色谱质谱法；基质效应；农药残留中图分类号：Ｓ４８１＋．８㊀文献标志码：Ａ㊀文章编号：１００１－８５８１（２０２１）０５－００９０－０６Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ１０ＰｅｓｔｉｃｉｄｅＲｅｓｉｄｕｅｓｉｎＥｄｉｂｌｅＦｕｎｇｉｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅｓａｎｄＦｒｕｉｔｓｂｙＱｕＥＣｈＥＲＳ－ＧＣ－ＭＳａｎｄＴｈｅｉｒＭａｔｒｉｘＥｆｆｅｃｔｓＸＩＯＮＧＸｉａｏ－ｙａｏ，ＲＥＮＧａｎｇ，ＤＯＮＧＺｈａｏ－ｆｅｎｇ，ＣＡＯＸｉｕ－ｒｏｎｇ，ＺＨＡＯＹａ－ｔｉｎｇ（ＳｈａｎｇｌｕｏＭｕｎｉｃｉｐａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔＱｕａｌｉｔｙＳａｆｅｔｙＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎａｎｄＴｅｓｔｉｎｇＣｅｎｔｅｒ，Ｓｈａｎｇｌｕｏ７２６０００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ１０ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎｆｉｖｅｅｄｉｂｌｅｆｒｕｉｔｓａｎｄｖｅｇｅｔａｂｌｅｓｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙＱｕＥＣｈＥＲＳ－ＧＣ－ＭＳ．Ｔｈｅｍａｔｒｉｘｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｏｍａｔｏ，ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ，Ｇｒｅｅｎｃａｂｂａｇｅａｎｄｓｈｉｉｔａｋｅｍｕｓｈｒｏｏｍｏｎ１０ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍａｔｒｉｘｔｙｐｅ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｓｔｉｃｉｄｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｍａｔｒｉｘｅｆｆｅｃｔｓｗｅｒｅａｌｓｏｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ１０ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍａｔｒｉｃｅｓｈａｄａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｉｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｒａｎｇｅｏｆ０．０１ ２．００μｇ／ｍＬ．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｗａｓ８８．５％ １０５．７％，ａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎ（ｎ＝６）ｗａｓ０．４％ ５．１％．Ｔｈｅｆｉｖｅｃｏｍｍｏｎｖｅｇｅｔａｂｌｅｓｈａｖｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍａｔｒｉｘｅｆｆｅｃｔｓｏｎ１０ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ．Ｔｈｅｍａｔｒｉｘｔｙｐｅ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｓｔｉｃｉｄｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｌｌａｆｆｅｃｔｅｄｔｈｅｍａｔｒｉｘｅｆｆｅｃｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｄａｒｋｅｒｆｒｕｉｔｓａｎｄｖｅｇｅｔａｂｌｅｓｈａｄｓｔｒｏｎｇｅｒｍａｔｒｉｘｅｆｆｅｃｔａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍａｔｒｉｘｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｍａｔｒｉｘｅｆｆｅｃｔｏｆｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓｗａｓｓｔｒｏｎｇｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｌｏｗｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｍａｔｒｉｘｅｆｆｅｃｔｍｕｓｔｂｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｖｅｇｅｔａｂｌｅｐｅｓｔｉｃｉｄｅｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＱｕＥＣｈＥＲＳ；ＧＣ－ＭＳ；Ｍａｔｒｉｘｅｆｆｅｃｔｓ；Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｒｅｓｉｄｕｅｓ㊀㊀２０世纪后期至２１世纪初，农药的滥用对生态环境和人类健康造成了较大的影响，引起了政府和学界的密切关注，相关法律法规体系的建立㊁检验检测机构及监管工作机构的设立㊁检验方法及标准体系的完善㊁检验仪器设备的研发生产都应运而生㊂随着社会经济的快速发展和科学技术的不断进步，人们对生活品质的期望越来越高㊂为了确保大众吃得安全㊁优质㊁营养㊁健康，食品安全工作者不断探索更快㊁更准㊁更有效的检验方法，特别是食用农产品农药残留检测取得了丰硕的研究成果㊂农产品的农药残留检测主要包括样品前处理和仪器测定２个部分㊂前处理方法对后期仪器分析影响较大，直接关系到结果的准确性和重现性㊂目前，农药残留测定使用的前处理技术主要有固相萃取（ＳＰＥ）㊁ＱｕＥＣｈＥＲＳ㊁凝胶渗透色谱（ＧＰＣ）㊁基质固相分散萃取（ＭＳＰＤＥ）㊁超临界流体萃取（ＳＦＥ）㊁加速溶剂萃取（ＡＳＥ）等㊂其中ＱｕＥＣｈＥＲＳ方法因其操作简便㊁高效安全的特点而成为目前种植业农产品农药残留检测潜力大㊁较常见的样品前处理方法［１－２］㊂采用气相色谱质谱仪（ＧＣ－ＭＳ）检测蔬菜㊁水果㊁食用菌的农药残留时，基质效应可能造成样品检测出现假阳性或者假阴性［３－１１］，因此有必要对基于ＱｕＥＣｈＥＲＳ－气相色谱质谱法测定农药残留的基质效应进行研究，以保证检测结果的准确性㊂１㊀材料与方法１．１㊀供试基质及测定项目供试基质为西红柿㊁草莓㊁白菜㊁青菜和香菇㊂选择咪鲜胺㊁嘧霉胺㊁甲霜灵㊁二甲戊乐灵㊁哒螨灵㊁苯醚甲环唑㊁虫螨腈㊁克百威㊁涕灭威㊁氟虫腈１０种具有代表性的农药㊂１．２㊀仪器与设备ＧＣＭＳ－ＱＰ２０１０Ｕｌｔｒａ气相色谱质谱仪（由日本岛津公司生产）；色谱柱：ＳＨ－Ｒｘｉ－５ｓｉｌＭＳ０．２５μｍˑ３０ｍˑ０．２５ｍｍ（由日本岛津公司生产）；涡旋仪（由美国ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ公司生产）；氮吹仪（由江苏金坛公司生产）；高速冷冻离心机（由澳大利亚Ｄｙｎａｍｉｃａ公司生产）；电子天平（由美国奥豪斯公司生产）；移液枪（由德国普兰德公司生产）：２０ ２００μＬ㊁移液管（天玻）㊂１．３㊀试剂与材料乙酸乙酯（色谱纯，由国药集团生产）；乙腈（色谱纯，由德国Ｍｅｒｃｋ公司生产）；丙酮（色谱纯，由德国Ｍｅｒｃｋ公司生产）；正己烷（色谱纯，由德国Ｍｅｒｃｋ公司生产）；ＱｕＥＣｈＥＲＳＳＰＥ柠檬酸提取包（内含４ｇＭｇＳＯ４㊁１ｇＮａＣｌ㊁０．５ｇ柠檬酸二氢钠㊁１ｇ柠檬酸钠，由日本岛津公司生产）；ＱｕＥＣｈＥＲＳＳＰＥ１５ｍＬＰＳＡ／ＧＣ－ｅ净化管（内含８８５ｍｇＭｇＳＯ４㊁１５０ｍｇＰＳＡ㊁１５ｍｇＧＣＢ，由日本岛津公司生产）；ＱｕＥＣｈＥＲＳＳＰＥ１５ｍＬＰＳＡ净化管（内含１５０ｍｇＰＳＡ㊁９００ｍｇＭｇＳＯ４，由日本岛津公司生产）㊂微孔滤膜（有机相，由中国津腾公司生产）：１３ｍｍˑ０．２２μｍ㊂陶瓷均质子：２ｃｍˑ１ｃｍ㊂标准品：环氧七氯（反式）㊁克百威㊁甲萘威㊁嘧霉胺㊁甲霜灵㊁二甲戊灵㊁氟虫腈㊁虫螨腈㊁哒螨灵㊁咪鲜胺㊁苯醚甲环唑（１００μｇ／ｍＬ）均来自农业农村部环境保护科研检测所㊂１．４㊀试验方法１．４．１㊀标准溶液的配制㊀分别准确吸取１０种农药标准溶液（１００μｇ／ｍＬ）１ｍＬ置于１０ｍＬ棕色容量瓶中，用乙酸乙酯准确定容至１０ｍＬ，得到１０μｇ／ｍＬ的混合标准储备液，在４ħ下避光保存，标准工作液根据需要现用现配㊂依次稀释配制０．０１㊁０．０５㊁０．１０㊁０．５０㊁１．００㊁２．００μｇ／ｍＬ混合标准溶液，混匀备用㊂准确吸取１００μｇ／ｍＬ的环氧七氯标准溶液３５０μＬ与６５０μＬ乙酸乙酯于１．５ｍＬ的棕色储液瓶中，混匀得到３５μｇ／ｍＬ的内标储备液，在４ħ下避光保存，备用㊂１．４．２㊀基质标准溶液的配制㊀空白基质溶液氮气吹干，加入４０μＬ内标储备液，加入１ｍＬ相应的０．０１㊁０．０５㊁０．１０㊁０．５０㊁１．００㊁２．００μｇ／ｍＬ混合标准溶液复溶㊁混匀，过微孔滤膜，待上机测定㊂１．４．３㊀ＱｕＥＣｈＥＲＳ前处理㊀样品前处理方法参考食品安全国家标准植物源性食品中２０８种农药及其代谢物残留量的测定气相色谱－质谱联用法（ＧＢ２３２００．１１３─２０１８）［１２］㊂称取１０ｇ样品（精确至０．０１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，加入１０ｍＬ乙腈㊁柠檬酸提取包（内含４ｇＭｇＳＯ４㊁１ｇＮａＣｌ㊁０．５ｇ柠檬酸二氢钠㊁１ｇ柠檬酸钠）㊁１颗陶瓷均质子，盖上离心管盖，剧烈震荡１ｍｉｎ后，在４２００ｒ／ｍｉｎ下离心５ｍｉｎ㊂吸取６ｍＬ上清液加入内含１５０ｍｇＰＳＡ㊁９００ｍｇＭｇＳＯ４的离心管中；对于深色样品，则吸取６ｍＬ上清液加入内含８８５ｍｇＭｇＳＯ４㊁１５０ｍｇＰＳＡ㊁１５ｍｇＧＣＢ的净化离心管中，涡旋混匀１ｍｉｎ㊂在４２００ｒ／ｍｉｎ下离心５ｍｉｎ后，准确吸取２ｍＬ上清液于１０ｍＬ试管中，４０ħ水浴中氮气吹至近干㊂加入４０μＬ的内标溶液，加入１ｍＬ乙酸乙酯复溶，过微孔滤膜于进样瓶中，待ＧＣ－ＭＳ分析㊂１．５㊀测定方法基于ＧＢ２３２００．８─２０１６食品安全国家标准水果和蔬菜中５００种农药及相关化学品残留量的测定气相色谱－质谱法［１３］，建立ＱｕＥＣｈＥＲＳ－ＧＣＭＳ同时测定水果㊁蔬菜和食用菌中１０种农药残留量的方法，研究了在该方法下基质种类㊁基质浓度㊁农药浓度对１０种农药的基质效应强度㊂１．５．１㊀色谱条件㊀色谱柱：ＳＨ－Ｒｘｉ－５ｓｉｌＭＳ购自岛津，进样口温度：２８０ħ，柱温：升温程序８０ħ（３ｍｉｎ）１０ħ／ｍｉｎң１５０ħ５ħ／ｍｉｎң２２０ħ１０ħ／ｍｉｎң２８０ħ（１０ｍｉｎ）；载气：高纯氦气，纯度ȡ９９．９９％；溶剂延迟：２ｍｉｎ，进样方式：不分流进样，进样量：１μＬ，柱流量：１．１６ｍＬ／ｍｉｍ㊂１．５．２㊀质谱条件㊀电离模式：电子轰击源（ＥＩ），能量为７０ｅＶ，离子源温度：２３０ħ；接口温度：２８０ħ；扫描方式：选择离子扫描（ＳＩＭ）采集［１１］㊂１０种１９㊀５期㊀㊀㊀㊀㊀熊潇垚等：ＱｕＥＣｈＥＲＳ－气相色谱质谱法测定果蔬菌类中１０种农药残留及基质效应研究农药的保留时间与质谱参数见表１㊂２㊀结果与分析２．１㊀方法的线性关系对空白西红柿基质按ＱｕＥＣｈＥＲＳ方法进行样品前处理提取净化吹干后４０μＬ的内标溶液，再用质量浓度为０．０１㊁０．０５㊁０．１０㊁０．５０㊁１．００㊁２．００μｇ／ｍＬ的溶剂标准溶液代替纯溶剂定容至１ｍＬ，得到基质标准溶液，按照上述测定方法中的ＧＣ－ＭＳ参数进行分析㊂以峰面积比率对质量浓度比率作回归曲线，其线性方程及相关系数如表２所示，１０种农药在０．１ ２μｇ／ｍＬ范围内线性关系良好，线性相关系数（ｒ）均大于０．９９㊂分别以目标组分母离子的３倍信噪比（Ｓ／Ｎ＝３）确定１０种目标物的方法检出限（ＬＯＤ），１０种农药的ＬＯＤ如表２所示，均在０．００３ ０．００９ｍｇ／ｋｇ之间㊂表１㊀１０种农药的保留时间与质谱参数序号化合物名称保留时间／ｍｉｎ定性定量离子１克百威（Ｃａｒｂｏｆｕｒａｎ）９．８１５１６４，１４９，１２２２甲萘威（Ｃａｒｂａｒｙｌ）１３．４１５１１５，１４４，１１６３嘧霉胺（Ｐｙｒｉｍｅｔｈａｎｉｌ）１８．３８５１９８，１９９，７７４甲霜灵（Ｍｅｔａｌａｘｙｌ）２０．３８０２０６，２４９，２３４５二甲戊乐灵（ＰｅｎｄｉＭｅｔｈａｌｉｎ）２２．８１０２５２，１６２，２２０６氟虫腈（Ｆｉｐｒｏｎｉｌ）２３．１０５３６７，３６９，３５１７虫螨腈（Ｃｈｌｏｒｆｅｎａｐｙｒ）２５．７５５５９，４１，２４７８哒螨灵（Ｐｙｒｉｄａｂｅｎ）３１．０６０１４７，１１７，３６４９咪鲜胺（Ｐｒｏｃｈｌｏｒａｚ）３１．１５５１８０，３０８，２６６１０苯醚甲环唑（Ｄｉｆｅｎｏｃｏｎａｚｏｌｅ）３４．６８５３２３，３２５，２６５１１环氧七氯（Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒ－ｅｐｏｘｉｄｅ）２３．２１５３５３，３５５，３５１表２㊀１０种农药的回归方程㊁相关系数㊁线性范围和检出限序号化合物名称线性方程相关系数（ｒ）检出限（ＬＯＤ）／（ｍｇ／ｋｇ）１克百威ｙ＝４．７１８４ｘ－０．１４９５０．９９７４０．００９２甲萘威ｙ＝１０．５７６０ｘ－０．０６５００．９９８９０．００３３嘧霉胺ｙ＝２６．８８８８ｘ＋０．４６４７０．９９９４０．００４４甲霜灵ｙ＝４．２０６０ｘ－０．００４３０．９９９３０．００８５二甲戊乐灵ｙ＝５．７７２９ｘ－０．０４８３０．９９９８０．００９６氟虫腈ｙ＝５．５９１７ｘ－０．０２５８０．９９９８０．００７７虫螨腈ｙ＝３４．６７６８ｘ－０．１６６２０．９９８４０．００７８哒螨灵ｙ＝２６．３６０７ｘ＋２．８４９５０．９９９６０．００９９咪鲜胺ｙ＝４．６６４０ｘ＋０．０３１４０．９９９９０．００６１０苯醚甲环唑ｙ＝２．８５６７ｘ＋０．０２５００．９９９７０．００４２．２㊀方法的回收率和精密度采用基质标准溶液－内标法定量，在西红柿空白基质中添加１０种农药进行加标回收率试验，添加水平分别为０．１㊁０．５ｍｇ／ｋｇ，每个添加水平平行６次，１０种目标物在０．１ｍｇ／ｋｇ与０．５ｍｇ／ｋｇ添加水平下的平均回收率分别为８８．５％ １０５．７％与９６．９％ １０１．４％，结果表明回收率在允许范围内㊂相对标准偏差（ＲＳＤ）为０．４％ ５．１％，试验重复性良好，准确度和精密度均可满足对农药残留分析的要求㊂表３㊀１０种农药不同添加水平下回收率和精密度结果（ｎ＝６）序号化合物名称加标量０．１ｍｇ／ｋｇ回收率／％相对标准偏差（ＲＳＤ）／％加标量０．５ｍｇ／ｋｇ回收率／％相对标准偏差（ＲＳＤ）／％１克百威１０５．７２．９１０１．４０．６２甲萘威９１．２１．２１００．８０．７３嘧霉胺１０４．８１．３１０３．６４．８４甲霜灵１００．６２．７１００．６０．７５二甲戊乐灵１００．１２．８９７．６１．６６氟虫腈１０４．６２．１１００．６０．４７虫螨腈１０５．７２．３９６．９５．１８哒螨灵８８．５３．６９９．９２．０９咪鲜胺１０５．０１．８１００．７０．８１０苯醚甲环唑１０３．５１．３１００．５２．３２．３㊀基质效应分析Ｍａｔｕｓｚｅｗｓｋｉ等［１４］提出用样品提取后的空白基质添加一定浓度农药标样与纯溶剂中同浓度农药测定结果的比值（ＭＥ值）来定量分析基质效应的方法㊂本试验沿用此方法，用ＭＥ值来评价基质效应，ＭＥ＝（空白基质中农药的信号峰面积／纯溶剂中的农药信号峰面积）ˑ１００％㊂若ＭＥ＜０．８５，说明基质对分析物的响应产生抑制作用；ＭＥ＞１．１５，则２９江㊀西㊀农㊀业㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３３卷说明基质会增强分析物的响应；０．８５＜ＭＥ＜１．１５，则表示该基质不存在基质效应，或者基质效应非常小［１５－１８］㊂样品前处理过程中存在的共提取物对目标化合物的准确定性定量产生干扰㊂通过试验计算得出１０种农药在西红柿㊁草莓㊁白菜㊁青菜㊁香菇５种蔬菜㊁水果㊁食用菌中不同浓度基质中的基质效应因子（表４）㊂表４㊀１０种农药在不同浓度果蔬基质中的基质效应因子农药种类基质体积／ｍＬ西红柿草莓白菜青菜香菇农药种类基质体积／ｍＬ西红柿草莓白菜青菜香菇克百威１１．００８０．９４１１．１３７１．１４５１．４４９氟虫腈１１．０４２０．９７９１．０５９１．１１６１．２８７２１．０１６１．２１９１．１８８１．３７３１．４５７２１．０８７１．３００１．１４９１．３０８１．３６５４１．０２３１．３０２１．５６３１．５１７１．４９５４１．１７９１．３５１１．５６４１．３８３１．３８３甲萘威１１．１０２１．１３７１．１６１１．２５８１．５２８虫螨腈１１．００７０．９４６１．０９４１．１３９１．３８６２１．１５２１．５６８１．３１３１．５３３１．５５９２１．０３９１．２２９１．１９４１．２６３１．４２４４１．１５８１．６０７１．５３１１．５３５１．６４０４１．１１５１．２８１１．５６８１．３４９１．４２６嘧霉胺１１．０４２１．１３８１．０８８１．１０６１．４７７哒螨灵１１．０８５１．０７２１．３６３１．３１４１．７８９２１．０８８１．７７８１．２２３１．３２６１．５０７２１．２２４１．５０９１．４６９１．５７４１．８７１４１．１９０２．０６４１．６６１１．４６７１．５６４４１．３７７１．５９５２．０５８１．８１６１．９６６甲霜灵１０．９４９０．８９７０．９９６１．００８１．３２９咪鲜胺１１．２５４１．２７２１．４８１１．６４１１．８５５２１．０４１１．２７５１．１５６１．２３０１．４５９２１．３９１１．７７３１．６３７１．８９６１．９０２４１．１８５１．２８９１．５８９１．３３９１．４７６４１．６１１１．８７４２．３２５２．００６２．２１０二甲戊乐灵１１．１０１０．９８９１．２０１１．４０８１．９０２苯醚甲环唑１１．２２３１．２００１．３８７１．５５５２．０２１２１．１９１１．４３５１．４２２１．７２８２．１５４２１．３１２１．６１５１．５７２１．８５７２．０７０４１．３２１１．４４９２．１０７１．９７９２．３４２４１．５０８１．７１０２．１９２２．０１６２．１３１２．３．１㊀不同种类样品对基质效应的影响㊀同一种农药在不同种类的基质中会呈现出不同的基质效应（图１），不同农药在同一基质中的基质效应也有所不同㊂对表４中不同种类的果蔬基质的数据分析发现，相较于其他４种基质，本研究的１０种农药在西红柿中的基质效应最弱，其次是白菜，而草莓㊁青菜比白菜的基质效应相对较强，说明基质效应的强弱与基质的颜色深浅也有一定的关系，深色基质由于色素的影响导致基质效应较强，前处理需要对色素进一步净化㊂而香菇中含有大量的多糖㊁嘌呤㊁核酸㊁含硫香味物质［１９］，因而其影响因素较多，导致其基质效应也相对较大㊂所以，在样品检测的前处理环节，需要对样品进行分类，将浅色样品和深色样品分类处理净化，以便减弱基质效应对检测结果的影响，使检测结果更加准确㊂图１㊀不同种类样品基质中１０种农药的基质效应２．３．２㊀基质浓度对基质效应的影响㊀对样品按照ＱｕＥＣｈＥＲＳ方法前处理，净化后，分别吸取１㊁２㊁４ｍＬ的上清液浓缩后，用相同浓度的纯溶剂标液复溶，得到不同浓度基质的样液进行分析㊂通过表４中不同种类基质的数据分析发现，当待测液中所含目标化合物浓度一定时，克百威㊁甲萘威的基质３９㊀５期㊀㊀㊀㊀㊀熊潇垚等：ＱｕＥＣｈＥＲＳ－气相色谱质谱法测定果蔬菌类中１０种农药残留及基质效应研究效应随基质浓度的增大而增强的效果不明显，其余８种农药的基质效应强度会随着基质浓度的增大而不断增强（以西红柿为例，图２）㊂在农药残留检测中，基质配标法常被使用匹配样品基质环境，在一定程度上矫正基质效应对测定的准确性带来的影响［１８］㊂图２㊀不同浓度西红柿基质中１０种农药的基质效应２．３．３㊀农药浓度对基质效应的影响㊀比较了同一种蔬菜基质（以西红柿为例），不同农药浓度（０．１０㊁０．５０㊁１．００μｇ／ｍＬ）对基质效应的影响（图３）㊂试验发现，除西红柿基质中的嘧霉胺外，其他农药在不同基质中的基质效应都会随着农药浓度的增大而逐渐增强㊂由表５可知，在农药浓度为０．１μｇ／ｍＬ时，哒螨灵在５种基质中的基质效应因子在０．６３５ １．３７９之间，基质效应不明显；而其他几种农药在５种基质中的基质效应因子在１．０２４ ２．０５１之间，基质效应较明显㊂在浓度为０．５０μｇ／ｍＬ时，１０种农药基质效应因子在１．１９０ ２．８４３之间，基质增强效应明显㊂在农药浓度为１．００μｇ／ｍＬ时，１０种农药的基质效应因子在２．１４９ ５．９２５之间，基质增强效应明显㊂说明待测组分在高浓度下有明显的基质效应，随着浓度水平的增大，基质效应也会随之增大㊂图３㊀１０种农药在不同农药浓度对果蔬基质效应的影响３㊀结论本文建立了ＱｕＥＣｈＥＲＳ－气相色谱质谱联用法测定５种蔬菜㊁水果㊁食用菌中１０种农药残留的方法，本方法在灵敏度㊁检出限指标上都有良好的表现，符合分析要求，并且前处理方法操作简单便捷，适合实际样品的测定㊂研究了西红柿㊁草莓㊁白菜㊁青菜和香菇５种基质中１０种农药的基质效应，并采用基质效应因子定量评估了基质种类㊁基质浓度㊁农药浓度对１０种农药基质效应的影响㊂结果表明，不同基质中的１０种农药在０．０１ ２．００μｇ／ｍＬ浓度范围内线性关系良好，平均回收率为８８．５％ １０５．７％，相对标准偏差（ｎ＝６）为０．４％５．１％，试验方法科学㊂５种常见蔬菜对１０种农药均存在不同程度的基质效应，基质种类㊁基质浓度４９江㊀西㊀农㊀业㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３３卷和农药浓度均会影响基质效应强度，而颜色较深的果蔬的基质效应较强，且随着基质浓度的增加，其基质效应逐渐增强；而高浓度农药较低浓度的基质效应强，对于蔬菜农药残留的检测，必须考虑基质效应的影响㊂表５㊀１０种农药在不同浓度农药的果蔬基质的基质效应因子农药种类浓度／（μｇ／ｍＬ）西红柿草莓白菜青菜香菇农药种类浓度／（μｇ／ｍＬ）西红柿草莓白菜青菜香菇克百威０．１１．１４８１．０７６１．０２４１．０４８１．０７７氟虫腈０．１１．４７９１．５０５１．４０７１．３６８１．４２５０．５１．３５５１．２２５１．４０３１．１９０１．５１７０．５１．７３２１．６６３１．７１２１．４７９１．８４９１．０２．５４３２．１４９２．８５８２．３８５２．９２１１．０３．２４０２．８０９３．５１６２．９４７３．５２６甲萘威０．１１．１０７１．５４７１．２４３１．３３４１．３７５虫螨腈０．１１．１８９１．２１４１．１４９１．０８６１．０９９０．５１．６４８１．５１２１．５９７１．３５６１．９１７０．５１．６２５１．５８６１．７２０１．３８８１．８１０１．０３．４７１３．１５４３．８４１３．３０７３．４３５１．０３．０５７２．６７０３．４３８２．７８５３．５１３嘧霉胺０．１１．６６２１．６７３１．３２４１．３３８１．３９１哒螨灵０．１１．３７９０．８７６０．８２７０．６３５０．７４５０．５１．４７４１．８５１１．５２４１．３１３１．７１４０．５１．５１６１．３９９１．５３６１．２６３１．７０５１．０２．８３７２．８２８３．１２０２．６２０３．４３１１．０２．９３６２．５４３３．２５９２．６３６３．５４４甲霜灵０．１１．５３０１．４３５１．２４５１．３１２１．６０７咪鲜胺０．１１．７７５１．７１８１．７９７１．８０５１．５４２０．５１．５９３１．５０９１．６０５１．４４４１．９０７０．５１．９０１１．９３７２．１２８１．７６７２．１０３１．０２．９００２．４４９３．１５７２．７０４３．５３１１．０３．８６４３．４３２４．５３６３．６６３４．８２９二甲戊乐灵０．１１．５５６１．４７９１．６６１１．６２８２．０５１苯醚甲环唑０．１１．６６８１．４７２１．４４９１．５０７１．６４９０．５１．７８８１．６０９２．０３９１．８２４２．８４３０．５１．７９６１．６７８１．９５７１．７２３２．３１７１．０３．６５９３．０９７４．８３７４．２６２５．９２５１．０３．４８１２．９２９４．１７７３．５１５４．５５２参考文献：［１］郑永权．农药残留研究进展与展望［Ｊ］．植物保护，２０１３，３９（５）：９０－９８．［２］杨媚．农药残留对人体的危害及检测方法分析比较［Ｊ］．甘肃农业，２０１９（１）：１１４－１１８．［３］贺利民，刘祥国，曾振灵．气相色谱分析农药残留的基质效应及其解决方法［Ｊ］．色谱，２００８（１）：９８－１０４．［４］张圆圆，刘磊，李娜，等．农药残留检测中不同蔬菜的基质效应［Ｊ］．农药学学报，２０１９，２１（３）：３２７－３３７．［５］于建华，朱梅华，吉绍长，等．色谱法测定多种农药残留的基质效应研究进展［Ｊ］．广东化工，２０１７，４４（３）：１０１－１０４．［６］易盛国，侯雪，韩梅，等．气相色谱－串联质谱法检测蔬菜农药残留基质效应与基质分类的研究［Ｊ］．西南农业学报，２０１２，２５（２）：５３７－５４３．［７］褚能明，杨俊英，李典晏，等．气相色谱 串联质谱法测定露地芹菜中丁硫克百威及其代谢物残留［Ｊ］．南方农业学报，２０１９，５０（８）：１８２２－１８２８．［８］谭阳阳，牛墨，田红．固相萃取－气相色谱质谱联用法测定蔬菜和食用菌中６种氨基甲酸酯类农药残留［Ｊ］检验检疫学刊，２０１７，２７（６）：１０－１３．［９］吴南村，张群，李春丽，等．分散固相萃取结合气相串联质谱法检测黑胡椒中１９种农药残留［Ｊ］．南方农业学报，２０１９，５０（３）：６５６－６６１．［１０］农业农村部．中华人民共和国农业农村部公告第１９９号［２００２－０５－２４］［Ｚ］．［１１］农业农村部．中华人民共和国农业农村部公告第１１５７号［２００９－０２－２５］［Ｚ］．［１２］中华人民共和国农业农村部．ＧＢ２３２００．１１３─２０１８．食品安全国家标准植物源性食品中２０８种农药及其代谢物残留量的测定气相色谱－质谱联用法［Ｓ］．北京：中国标准出版社，２０１８．［１３］农业农村部．ＧＢ２３２００．８─２０１６．食品安全国家标准水果和蔬菜中５００种农药及相关化学品残留量的测定气相色谱－质谱法［Ｓ］．北京：中国标准出版社，２０１６．［１４］ＭａｔｕｓｚｅｗｓｋｉＢＫ，ＣｏｎｓｔａｎｚｅｒＭＬ，Ｃｈａｖｅｚ－ＥｎｇＣＭ．ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｔｈｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｍａｔｒｉｘｅｆｆｅｃｔｉｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｂａｓｅｄｏｎＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ［Ｊ］．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，７５（１３）：３０１９－３０３０．［１５］许文娟，王振刚，丁葵英，等．ＱｕＥＣｈＥＲＳ／液相色谱－串联质谱法测定５种蔬菜中１７种氨基甲酸酯类农药的基质效应研究［Ｊ］．分析测试学报，２０１７，３６（１）：５４－６０．［１６］吴学进，刘春华，罗金辉，等．ＱｕＥＣｈＥＲＳ净化 超高效液相色谱 串联质谱法同步测定荔枝中１０种植物生长调节剂残留［Ｊ］．南方农业学报，２０２０，５１（１０）：２５３２－２５３９．［１７］于杰，李晓玉，李淑娟，等．ＬＣＭＳＭＳ测定果蔬中氨基甲酸酯类农药的基质效应研究［Ｊ］．食品研究与开发，２０１３，３４（２３）：４１－４４．［１８］许晓敏，李凌云，林桓，等．基质效应对液相色谱串联质谱分析农药残留的影响研究［Ｊ］．农产品质量与安全，２０１９（６）：１１－１５，２０．［１９］徐炎炎，李森，张芹，等．气质联用和液质联用中基质效应的分析和总结［Ｊ］．农药，２０１７，５６（３）：１６２－１６７．（责任编辑：曾小军）５９㊀５期㊀㊀㊀㊀㊀熊潇垚等：ＱｕＥＣｈＥＲＳ－气相色谱质谱法测定果蔬菌类中１０种农药残留及基质效应研究。
上海应用技术学院研究生课程《高等天然产物化学》试卷2014 / 2015 学年第1 学期课程代码：NX0702013论文题目：乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究进展姓名：芮银146061414康满满146061409专业：制药工程学院：化工学院乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究进展芮银，陈祎桐，康满满摘要：本文阐述了乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)的研究进展，介绍了用于药物治疗的乙酰胆碱酯酶抑制剂的各种来源如植物、微生物等，及其抑制乙酰胆碱的活性物质。
在此基础上，总结了几种现代分析技术，对AChEIs进行筛选，大大加快AD药物资源的开发利用进程。
这些方法主要有基于比色法的Ellman's法及相关的改进方法、薄层显色法、荧光显色法、电喷雾质谱法等。
但是，到目前为止，现代分析技术在AD药物资源中的应用还处在起步阶段。
关键词：乙酰胆碱酯酶抑制剂，筛选方法，薄层显色法，荧光显色法The progress of acetylcholinesteraseinhibitorsRui Yin, Chen Yitong, Kang ManmanAbstract：In this artical, the research elaborates progress of acetylcholinesterase inhibitors (AChEI), and introduces a variety of sources for drug treatment acetylcholinesterase inhibitors such as plants, microorganisms, and its active ingredients. On this basis, the review summarizes several modern analytic techniques such as Ellman's method which based on the colorimetric method, TLC chromogenic method, fluorescent color method, Electrospray ionization mass spectrometry and so on. However, at present, the application of modern analytic techniques in AD drug resources is still in infancy.Key word: Acetylcholinesterase inhibitors, Screening Methods, TLC chromogenic method, Fluorescent color method目录摘要.................................................................................................错误!未定义书签。
㊃论 著㊃[收稿日期]2023-01-11[基金项目]邢台市重点研发计划项目(2021Z C 111)[作者简介]薛云(1987-),女,河北邢台人,河北省邢台市第三医院主管检验师,医学学士,从事病原微生物研究㊂*通信作者㊂E -m a i l :37044209@q q.c o m N G -T e s t C A R B A5在血培养肠杆菌科细菌碳青霉烯酶检测中的优势及其检测效能薛 云,刘向芹,张 凯*(河北省邢台市第三医院检验科,河北邢台054000) [摘要] 目的探讨N G -T e s tC A R B A5在血培养肠杆菌科细菌碳青霉烯酶含量检测的应用价值㊂方法收集我院临床标本中分离培养的已知基因型别的62株肠杆菌目细菌,包含耐碳青霉烯肠杆菌科细菌38株和对碳青霉烯敏感的肠杆菌科细菌24株,分别采用N G -T e s tC A R B A5试剂盒㊁C a r b aN P 和m C I M 试验检测待测菌株的主要碳青霉烯酶,并采用P C R 法对碳青霉烯酶基因表型进行测序确认和K a p p a 一致性检验;再从38株耐碳青霉烯菌株中随机取出20株菌株进行模拟血培养,并对其进行N G -T e s tC A R B A5试剂盒㊁C a r b aN P 法和m C I M 法检测和K a p p a 一致性检验分析㊂结果38株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌菌株的耐药药物均为美罗培南和/或亚胺培南,P C R 扩增测序结果表明,分别有33株菌株携带有耐药基因,5株菌株未携带常见耐药基因㊂N G -T e s tC A R B A515m i n内检测到K P C ㊁N D M ㊁I M P ㊁K P C +N D M 以及N D M+I M P 的敏感度和特异度均为100%㊂C a r b aN P 法和m C I M 法的敏感度分别为93.94%㊁96.97%,特异度分别为80.00%㊁100.00%,与基因测序结果一致性K a p pa 值分别为0.857㊁0.902(P <0.05)㊂20株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌模拟血培养,大肠杆菌㊁阴沟肠杆菌㊁肺炎克雷伯菌㊁产酸克雷伯菌分别有6株㊁5株㊁4株㊁5株,N G -T e s tC A R B A5敏感度和特异度均为100.0%,与基因测序结果一致性K a p p a 值为1.000;C a rb aN P 法和m C I M 法的敏感度分别为87.50%㊁93.75%,特异度均为100%,与基因测序结果一致性K a p p a 值分别为0.812㊁0.898(P <0.05)㊂结论N G -T e s tC A R B A5检测过程简单㊁高效,检测结果准确度高,大大简化了临床上检测碳青霉烯酶的复杂流程,有助于增强院内感染控制和及时指导临床治疗㊂[关键词] 碳青霉烯酶;N G -T e s tC A R B A5;C a r b aN P 试验 d o i :10.3969/j .i s s n .1007-3205.2023.11.017 [中图分类号] R 37-33 [文献标志码] A [文章编号] 1007-3205(2023)11-1334-06A d v a n t a g e s a n d e f f i c a c y o fN G -T e s t C A RB A5i n t h e d e t e c t i o no f c a r b a pe n e m a s e i nb l o o d c u l t u r e d e n t e r o b a c t e r i a c e a e b a c t e r i aX U EY u n ,L I U X i a n g -qi n ,Z H A N G K a i *(D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b ,t h eT h i r d H o s p i t a l o f X i n g t a i C i t y ,H e b e iP r o v i n c e ,X i n gt a i 054000,C h i n a )[A b s t r a c t ] O b je c t i v e T oe x p l o r et h ea p p l i c a t i o n v a l u eof N G -T e s t C A R B A 5i nt h e d e t e c t i o no fc a r b a pe n e m a s ec o n t e n t i nb l o o dc u l t u r e de n t e r o b a c t e r i a c e a eb a c t e r i a .M e t h o d s A t o t a lo f62s t r a i n so fe n t e r o b a c t e r i a c e a eb a c t e r i a w i t h k n o w n g e n et y p e s w e r ec o l l e c t e df r o m c l i n i c a l s p e c i m e n s o f o u r h o s p i t a l ,i n c l u d i ng 38s t r a i n s o f c a r b a p e n e mr e s i s t a n t e n t e r o b a c t e r i a c e a e b a c t e r i a a n d24s t r a i n so f c a r b a pe n e m s e n s i t i v ee n t e r o b a c t e r i a c e a eb a c t e r i a .N G -T e s tC A R B A5k i t ,C a r b aN Pa n dm C I Mt e s t sw e r e u s e d t o d e t e c t t h em a j o r c a r b a pe n e m a s e s of t h e s t r a i n s t ob e t e s t e d ,a n dP C R w a s u s e d t os e q u e n c e t h e c a r b a p e n e m a s eg e n e ph e n o t y p e s f o r c o n fi r m a t i o na n d K a p p a c o n s i s t e n c y t e s t .T h e n20s t r a i n sw e r er a n d o m l y s e l e c t e df r o m 38c a r b a pe n e m r e s i s t a n t s t r a i n sf o r s i m u l a t e db l o o dc u l t u r e ,a n dt e s t e dw i t h N G -T e s tC A R B A5k i t ,C a r b aN P m e t h o da n dm C I M m e t h o da n dK a p p ac o n s i s t e n c y t e s t .R e s u l t s T h ed r u g r e s i s t a n c eo f 38c a rb a p e n e m ㊃4331㊃第44卷第11期2023年11月河北医科大学学报J O U R N A L O F H E B E I M E D I C A L U N I V E R S I T YV o l .44 N o .11 N o v . 2023r e s i s t a n tE n t e r o b a c t e r i a c e a es t r a i n s w e r e m e r o p e n e m a n d/o r i m i p e n e m.P C Ra m p l i f i c a t i o na n d s e q u e n c i n g r e s u l t ss h o w e dt h a t33s t r a i n sc a r r i e dd r u g r e s i s t a n c e g e n e s,a n d5s t r a i n sd i dn o tc a r r y c o mm o nd r u g re s i s t a n c e g e n e s.T h es e n s i t i v i t y a n ds p e c if i c i t y o fN G-T e s tC A R B A5i nd e t e c t i n g K P C,N D M,I M P,K P C+N D M a n d N D M+I M P w i t h i n15m i n w e r e100%.T h e s e n s i t i v i t y o fC a r b aN P m e t h o da n d m C I M m e t h o dw a s93.94%a n d96.97%,r e s p e c t i v e l y,a n d t h e s p e c i f i c i t y w a s80.00%a n d100.00%,r e s p e c t i v e l y.T h eK a p p av a l u e sw e r e0.857a n d0.902 (P<0.05),w h i c h w e r ec o n s i s t e n t w i t ht h er e s u l t so f g e n es e q u e n c i n g.T w e n t y c a r b a p e n e m r e s i s t a n tE n t e r o b a c t e r i a c e a eb a c t e r i aw e r e c u l t u r e d i n s i m u l a t e db l o o d.T h e r ew e r e6,5,4a n d5 s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i,E n t e r o b a c t e r c l o a c a e,K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e a n d K l e b s i e l l a a c i d o g e n e s,r e s p e c t i v e l y.T h e s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y o fN G-T e s t C A R B A5w e r e100.0%,a n d t h eK a p p av a l u e w a s1.000,w h i c h w e r ec o n s i s t e n tw i t ht h er e s u l t so f g e n es e q u e n c i n g.T h e s e n s i t i v i t y o fC a r b aN P m e t h o da n d m C I M m e t h o dw e r e87.50%a n d93.75%r e s p e c t i v e l y,a n d t h e s p e c i f i c i t y w a s100%.T h e K a p p av a l u e s w e r e0.812a n d0.898(P<0.05),w h i c h w e r e c o n s i s t e n tw i t ht h er e s u l t so f g e n es e q u e n c i n g.C o n c l u s i o n T h ed e t e c t i o n p r o c e s so fN G-T e s t C A R B A5i ss i m p l e,e f f i c i e n ta n da c c u r a t e,w h i c h g r e a t l y s i m p l i f i e st h ec o m p l e x p r o c e s so f c l i n i c a l d e t e c t i o n o f c a r b a p e n e m a s e,a n d i s h e l p f u l t o e n h a n c e h o s p i t a l i n f e c t i o n c o n t r o l a n d t i m e l y g u i d e c l i n i c a l t r e a t m e n t.[K e y w o r d s]c a r b a p e n e m a s e;N G-T e s tC A R B A5;C a r b aN P t e s t全身性血流感染作为一种较为严重的感染性疾病,具有病情发展迅速和预后差等临床特征,其中产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌(c a r b a p e n e m p r o d u c i n g e n t e r o b a c t e r a l e s,C P E)数量不断增加[1]㊂碳青霉烯酶编码基因主要位于细菌的质粒㊁转座子等基因元件上,这种基因水平转移的传播方式大大增加了C P E的致病率和病死率[2]㊂因此,快速对C P E菌株进行确认与鉴定具有重要临床意义㊂目前临床上确认和鉴定C P E菌株的主要方法包括C a r b aN P试验和碳青霉烯灭活试验(M o d i f i e d C a r b a p e n e m I n a c t i v a t i o n M e t h o d,m C I M)等,较传统的H o d g e 试验操作时间已明显缩短[3-4];N G-T e s tC A R B A5是一种已经商品化的胶体金试剂,可以快速有效检测C P E[5]㊂本研究以聚合酶链式反应(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n,P C R)扩增碳青霉烯酶耐药基因结果作为金标准,通过采用三种检测方法对C P E菌株的五种主要碳青霉烯酶基因(K P C㊁N D M㊁V I M㊁I M P㊁O X A)进行检测,并对比检出能力和临床应用价值,以期为临床诊断㊁治疗C P E提供有效参考依据㊂1资料与方法1.1菌株来源收集我院自2021年1月 2022年10月临床标本中分离培养的已知基因型别的62株肠杆菌目细菌,包含耐碳青霉烯肠杆菌科细菌38株和对碳青霉烯敏感的肠杆菌科细菌24株,38株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的亚胺培南和美罗培南最小抑菌浓度均ȡ4n g/L㊂经鉴定,共包含肺炎克雷伯杆菌13株,阴沟肠杆菌11株,大肠杆菌8株,产酸克雷伯杆菌6株㊂38株不敏感菌株标本来源共包括痰液标本22株,血液标本4株,脓液标本3株,穿刺液1株,引流液2株,尿液标本6株㊂24株敏感菌株标本来源共包括痰液标本14株,血液标本2株,脓液标本2株,引流液1株,尿液标本5株㊂本研究中患者知情同意,且已获得医院伦理委员会批准㊂1.2菌株鉴定与药敏试验方法采用质谱仪(生产厂家:布鲁克公司,型号:MA L D T-T O F)鉴定所有菌株;采用V I T E K2c o m p a c t药敏卡进行药敏实验检查,药敏试验过程和药敏结果均参照美国临床实验室标准委员会进行㊂1.3碳青霉烯酶基因检测细菌D N A抽提试剂盒提取D N A,并根据特异性引物进行P C R扩增㊂所有操作均按照说明书进行,然后对细菌碳青霉烯酶主要基因(K P C㊁N D M㊁V I M㊁I M P㊁O X A)进行筛查㊂P C R的反应体系的总体积是25.0μL,包括D N A模板1.0μL(100m g/L)㊁去离子水9.5μL㊁M i x12.5μL以及引物各1.0μL(10μm o l/L)㊂P C R反应条件为:94ħ5m i n完成预变性;94ħ45s完成循环,55ħ45s完成退火,共36个循环, 72ħ延伸10m i n㊂采用2%琼脂糖凝胶电泳进行P C R产物凝胶成像及观察㊂见表1㊂㊃5331㊃河北医科大学学报第44卷第11期表1P C R引物序列T a b l e1P C R p r i m e r s e q u e n c e基因正向引物序列(5'~3')反向引物序列(5'~3')目标片段长度(b p) b l aK P C G T A T C G C C G T C T A G T T C T G C G G T C G T G T T T C C C T T T A G C C638b l a I M P T G A G C A A G T T A T C T G T A T T C T T A G T T G C T T G G T T T T G A T G740b l aV I M T T A T G G A G C A G C A A C C G A T G T C A A A A G T C C C G C T C C A A C G A920b l aO X A-48G C G T G G T A A G G A T G A A C A C C A T C A A G T T C A A C C C A A C C G438b l aN D M-1G G T T T G G C G A T C T G G T T T T C C G G A A T G G C T C A T C A C G A T C6211.4模拟血培养实验取健康成年人血10m L,加入细菌接种物103C F U/m L,混匀后注入树脂需氧血培养瓶中,于全自动血培养仪中孵育24h㊂从血培养阳瓶中抽出试样300μL,接种于20m LL B肉汤中,继续在37ħ振荡培养箱中孵育2h,然后采用离心机于4000r/m i n转速下离心15m i n后将细菌颗粒收集㊂将细菌颗粒沉淀重新悬浮于1.5m L去离子水中,接种在体积为100μL/孔的12个孔板中㊂配置N G-T e s tC A R B A5㊁C a r b aN P和m C I M 的a液和b液,不稀释加入孔内,37ħ孵育2h,由两位工作人员读取结果㊂1.5 N G-T e s tC A R B A5试验将约150μL提取滴入无菌离心管中,然后加入一环细菌样本,混合振荡10s后吸取100μL加入到检测卡盒中标记 S 的样本孔,室温放置15m i n后读取结果㊂1.6 C a r b aN P试验准备E P管A(对照管)㊁E P 管B(试验管),加入100μL细菌蛋白抽提液;将血平皿上35ħ培养的待测菌株分别接种于A㊁B管,涡旋震荡5s,分别加入100μL检测液A(p H7.8酚红硫酸锌溶液)㊁100μL检测液B(6g/L亚胺培南+p H7.8酚红硫酸锌溶液),37ħ孵育,每30m i n 观察颜色变化,直至孵育2h,其中颜色由红色变成黄色或者橙色则判为阳性,表示待测菌为产碳青霉烯酶㊂见图1㊂1.7 m C I M试验皿上待测菌株接种于T S B肉汤中,涡旋震荡10s,每管放入一张无菌纸片(含10μg 美罗培南),35ħ孵育4h㊂生理盐水制备0.5麦氏浊度的大肠埃希菌A T C C25922菌悬液,将菌液均匀涂布在MH A平板上;取出无菌纸片,贴于试管内壁,挤去纸片多余水分,取出无菌纸片后贴于MH A 平板上,倒置平板,35ħ孵育18~24h,量取抑菌圈直径㊂结果判断:抑菌圈直径为6~15mm或16~ 18mm但抑菌圈内散步菌落,表示碳青霉烯酶阳性;抑菌圈直径ȡ19mm则表示阴性㊂见图2㊂1.8统计学方法应用S P S S22.0统计软件分析数据㊂以P C R和基因测序结果为 金标准 ,分别计算N G-T e s tC A R B A5㊁C a r b aN P以及m C I M实验检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的准确度㊁敏感度㊁特异度㊂分别对以上3种实验与基因测序结果进行K a p p a一致性检验㊂P<0.05为差异有统计学意义㊂图1C a r b aN P试验检测结果F i g u r e1C a r b aN P t e s t r e s u l t s图2m C I M筛选产碳青霉烯酶菌株结果(阳性对照为A T C C1705;阴性对照为A T C C1706;1㊁2分别表示待测菌株结果为阳性)F i g u r e2S c r e e n i n g r e s u l t s o f c a r b a p e n e m a s e-p r o d u c i n g s t r a i n s b y m C I M(p o s i t i v e c o n t r o l w a sA T C C1705;A T C C1706 w a s t h en e g a t i v ec o n t r o l.1a n d2i n d i c a t e p o s i v i t i t y o ft h e s t r a i n t ob e t e s t e d r e s p e c t i v e l y)2结果2.1 N G-T e s tC A R B A5㊁C a r b aN P法和m C I M实㊃6331㊃河北医科大学学报第44卷第11期验结果38株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌菌株的耐药药物为美罗培南和(或)亚胺培南,纸片法药敏测试结果和最小抑菌浓度值检测结果见表2㊂分别有33株菌株携带有耐药基因,5株菌株未携带常见耐药基因㊂N G-T e s t C A R B A515m i n内检测到K P C㊁N D M㊁I M P㊁K P C+N D M以及N D M+I M P 的敏感度和特异度均为100%㊂C a r b a N P法和m C I M法的敏感度分别为93.94%㊁96.97%,特异度分别为80.00%㊁100.00%,与基因测序结果一致性K a p p a值分别为0.857㊁0.902(P<0.05)㊂见表3㊂P C R扩增电泳图见图3㊂表238株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌N G-T e s t C A R B A5㊁C a r b aN P法和m C I M实验结果T a b l e2E x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f38s t r a i n s o f c a r b a p e n e mr e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a eb y N G-T e s t C A R B A5,C a r b aN Pm e t h o da n dm C I M组别细菌种类最小抑菌浓度(m g/L)亚胺培南美罗培南纸片法药敏(mm)亚胺培南美罗培南阳性菌株(33株)K P C(9株)肺炎克雷伯杆菌(9株)ȡ168~ȡ166~86~8N D M(20株)大肠杆菌(6株)4~ȡ164~ȡ167~186~17阴沟肠杆菌(10株)8~ȡ162~ȡ166~186~19肺炎克雷伯杆菌(2株)ȡ164~814~1810~16产酸克雷伯杆菌(2株)8~ȡ164~81512~16I M P(2株)产酸克雷伯杆菌(2株)ȡ162~516~1914~16K P C+N D M(2株)肺炎克雷伯杆菌(1株)ȡ162~416~1814~15产酸克雷伯杆菌(1株)851514阴性菌株(5株)大肠杆菌(2株)ɤ0.25~0.50ɤ0.25~8.0015~2510~25阴沟克雷伯杆菌(1株)ɤ0.25ɤ0.2568肺炎克雷伯杆菌(1株)851617产酸克雷伯杆菌(1株)ɤ0.25ɤ0.252015表3不同试验方法敏感度㊁特异度等比较T a b l e3C o m p a r i s o no f s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y o f d i f f e r e n t t e s tm e t h o d s(%)试验方法敏感度特异度阳性预测值阴性预测值N G-T e s tC A R B A5100.00100.00100.00100.00C a r b aN P93.94480.0096.8866.67m C I M96.97100.00100.00583.332.220株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌模拟血培养N G-T e s tC A R B A5㊁C a r b aN P法和m C I M实验结果测序结果表明,15株阳性,5株阴性㊂其中1株P C R扩增阴性的大肠杆菌C a r b a N P法和m C I M 法结果为阳性,其余菌株的表型检测结果均与基因测序结果一致㊂N G-T e s tC A R B A5敏感度和特异度均为100.0%,与基因测序结果一致性K a p p a值为1.000;C a r b aN P法和m C I M法的敏感度分别为87.50%㊁93.75%,特异度均为100%,与基因测序结果一致性K a p p a值分别为0.812㊁0.898(P<0.05)㊂见表4~5㊁图3㊂表420株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌N G-T e s t C A R B A5㊁C a r b aN P法和m C I M实验结果T a b l e4E x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f20s t r a i n s o f c a r b a p e n e mr e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a eb y N G-T e s t C A R B A5,C a r b aN Pm e t h o da n dm C I M分组细菌种类模拟血培养:阳性菌株数/测试菌株数(例数,%) N G-T e s tC A R B A5C a r b aN P m C I M阳性菌株(15株)K P C(2株)肺炎克雷伯杆菌(2株)2(100)2(100)2(100) N D M(9株)大肠杆菌(4株)4(100)4(100)4(100)阴沟肠杆菌(4株)4(100)4(100)4(100)产酸克雷伯杆菌(1株)1(100)1(100)1(100) I M P(2株)产酸克雷伯杆菌(2株)2(100)2(100)2(100) K P C+N D M(2株)肺炎克雷伯杆菌(1株)1(100)1(100)1(100)产酸克雷伯杆菌(1株)1(100)1(100)1(100)阴性菌株(5株)大肠杆菌(2株)0(0)0(0)0(0)阴沟克雷伯杆菌(1株)0(0)0(0)0(0)肺炎克雷伯杆菌(1株)0(0)0(0)0(0)产酸克雷伯杆菌(1株)0(0)0(0)0(0)㊃7331㊃河北医科大学学报第44卷第11期表5不同试验方法敏感度㊁特异度等比较T a b l e5C o m p a r i s o no f s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y o f d i f f e r e n t t e s tm e t h o d s(%)试验方法敏感度特异度阳性预测值阴性预测值N G-T e s tC A R B A5100.00100.00100.00100.00C a r b aN P87.50100.00100.0066.67m C I M93.75100.00100.0080.00图3P C R扩增电泳图(1㊁2㊁3㊁4㊁5㊁6㊁7㊁8泳道分别代表D N A标志物㊁K P C基因阳性肺炎克雷伯菌A T C C B A A-1705㊁K P C基因扩增阴性肺炎克雷伯菌A T C C B A A-1706㊁K P C和N D M基因扩增阳性肺炎克雷伯菌㊁K P C基因阳性产酸克雷伯菌㊁N D M扩增阳性阴沟肠杆菌㊁K P C基因阴性大肠杆菌㊁I M P基因扩增阳性产酸克雷伯菌)F i g u r e3P C R a m p l i f i c a t i o ne l e c t r o p h o r e s i sd i a g r a m(L a n e 1,2,3,4,5,6,7a n d8r e p r e s e n t D N Am a r k e r s,K P C g e n e p o s i t i v e K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e A T C C B A A-1705,K P C g e n e n e g a t i v e K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e A T C C B A A-1706,K P C a n d N D M g e n e p o s i t i v e K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e a n d K P C g e n e p o s i t i v e a c i d p r o d u c t i o n,K l e b s i e l l a,N D M a m p l i f i c a t i o n p o s i t i v eE n t e r o b a c t e rc l o a c a e,K P C g e n en e g a t i v eE s c h e r i c h i a c o l i,I M P g e n e a m p l i f i c a t i o n i n p o s i t i v eK l e b s i e l l a a c i d o g e n e s) 3讨论临床上对碳青霉烯酶进行迅速检测和鉴定对于预防和控制C P E所引起的多种感染具有重要临床意义,有利于有效切断院内传播和进一步感染[6-7]㊂我国耐药监测网监测数据显示,C P E比例高达97.4%,且其对碳青霉烯类抗生素药物美罗培南的耐药率已高达26.4%[8-9]㊂因此对C P E菌株以及碳青霉烯酶类型进行准确和快速检测,更有助于抗菌药物的合理选择和治疗㊂目前临床实验室开展了改良碳青霉烯灭活试验㊁C a r b aN P和m C I M等多种表型检测方法用于碳青霉烯酶检测[10]㊂C a r b a N P试验操作过程简单,一般在4~6h内可以得到阳性结果,但其检测O X A-48/-23等碳青霉烯酶的敏感度不是非常高,一般在73%~100%[11]㊂近年来,一些基于C a r b a N P试验的商品化试剂大大增加了便捷性,但对于O X A-48/-23型碳青霉烯酶的检测敏感度仍有待提高㊂研究报道m C I M检测碳青霉烯酶敏感度㊁特异度均超过90%[12],但m C I M的严重不足之处是临床试验周期长,且当产生金属β-内酰胺酶和丝氨酸酶菌株同时存在时,m C I M很容易得到假阴性结果[13]㊂有研究表明[14-15],N G-T e s tC A R B A5作为一种胶体金免疫层析法,其检测血培养阳性标本的敏感度可达95.8%~97.7%,特异度可达93.3%~ 96.1%,且一个N G-T e s tC A R B A5试剂盒即可快速检测K P C㊁O X A-48-l i k e㊁I M P㊁N D M和V I M等五种碳青霉烯酶,因此成为快速检测不同酶型碳青霉烯酶基因的关键手段㊂五种酶型作为肠杆菌目细菌中最为常见的碳青霉烯酶型,可有效区分金属β-内酰胺酶和丝氨酸β-内酰胺酶,非常有助于优化抗生素的管理过程,预防耐药现象蔓延,以及改善感染患者预后[16-17]㊂在本研究中,P C R测序检出有33株菌株携带有耐药基因,4株菌株未携带常见耐药基因㊂N G-T e s tC A R B A515m i n内检测到细菌碳青霉烯酶主要基因的敏感度和特异度均为100%㊂同时,测序结果表明,16株阳性,4株阴性㊂其中1株P C R扩增阴性的大肠杆菌C a r b aN P法和m C I M法结果为阳性,而N G-T e s tC A R B A5敏感度和特异度均为100.0%,与基因测序结果一致性K a p p a值为1.000;C a r b aN P法和m C I M法的敏感度分别为87.50%㊁93.75%,特异度均为100%,与前面文献报道结果类似[18]㊂因此N G-T e s tC A R B A5胶体金方法准确性高,操作简单,能快速进行酶型分型,非常有助于简化临床上的碳青霉烯酶检测常规工作流程,从而指导治疗方案优化和完善㊂本文检测菌株中仅涵盖了较为常见的几种青霉烯酶型,存在一定漏检其他碳青霉烯酶类型(如I M I㊁G I M等)可能㊂后续我们将继续收集产V I M型和O X A-48酶型的菌株,以㊃8331㊃河北医科大学学报第44卷第11期期进一步完善N G-T e s tC A R B A5胶体金方法检测碳青霉烯酶性能的全面评估㊂综上所述,N G-T e s tC A R B A5检测过程简单㊁高效,检测结果准确度高,大大简化了临床上检测碳青霉烯酶的复杂流程,适合于大范围初筛产碳青霉烯酶,有助于增强院内感染控制和及时指导临床治疗㊂[参考文献][1]周梦兰,杨启文,于淑颖,等.血流感染流行病学研究进展[J].中国感染与化疗杂志,2019,19(2):212-217.[2] T a mm aP D,A i t k e nS L,B o n o m oR A,e t a l.I n f e c t i o u s d i s e a s e ss o c i e t y o f A m e r i c a g u i d a n c eo nt h et r e a t m e n to fe x t e n d e d-s p e c t r u mβ-l a c t a m a s e p r o d u c i n g e n t e r o b a c t e r a l e s(E S B L-E),c a r b a p e n e m-R e s i s t a n t e n t e r o b a c t e r a l e s(C R E),a n dp s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a w i t h d i f f i c u l t-t o-t r e a t r e s i s t a n c e(D T R-P.a e r u g i n o s a)[J].C l i n I n f e c t D i s,2021,72(7):e169-e183.[3] L a s k o M J,G i l l C M,A s e m p a T E,e t a l.E D T A-m o d i f i e dc a r b a p e n e mi n a c t i v a t i o n m e t h o d(e C I M)f o rde t e c t i n g I M PM e t a l l o-β-l a c t a m a s e-p r o d u c i n g P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a:a na s s e s s m e n to fi n c r e a s i n g E D T A c o n c e n t r a t i o n s[J].B M CM i c r o b i o l,2020,20(1):220.[4] L i uJ,L i n X,B a iC,e ta l.V e r i f i c a t i o na n da p p l i c a t i o no fam o d i f i e d c a r b a p e n e m i n a c t i v a t i o n m e t h o d(m C I M)o nP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a:a p o t e n t i a ls c r e e n i n g m e t h o d o l o g yo n c a r b a p e n e m a s e s p h e n o t y p e i n B a c i l l u s c e r e u s[J].B i o e n g i n e e r e d,2022,13(5):12088-12098.[5] Z h uY,J i aP,L iX,e ta l.C a r b a p e n e m a s ed e t e c t i o nb y N G-T e s t C A R B A5-a r a p i di mm u n o c h r o m a t o g r a p h i c a s s a y i nc a r b a p e n e m-r e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r a l e sd i a g n o s i s[J].A n nT r a n s lM e d,2021,9(9):769.[6] L iG,Y eZ,Z h a n g W,e ta l.R a p i dL C-M S/M Sd e t e c t i o no fd i f fe r e n tc a r b a p e n e m a s et y p e si n c a r b a p e n e m a s e-p r o d u c i n ge n t e r o b a c t e r a l e s[J].E u r JC l i n M i c r o b i o l I nf e c tD i s,2022,41(5):815-825.[7]宋羽希,王琴,胡健,等.碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌分子流行病学分析[J].中国感染与化疗杂志,2020,20(1):60-66.[8] F e n g W,N i u S,C h a n g Y,e ta l.D e s i g n o fr a p i d d e t e c t i o ns y s t e mf o r f i v em a j o rc a r b a p e n e m a s e f a m i l i e s(b l aK P C,b l aN D M,b l a V I M,b l a I M P a n d b l a O X A-48-L i k e)b yc o l o r i m e t r i c l o o p-m ed i a te d i s o t h e r m a l a m p l if i c a t i o n[J].I n f e c tD r u g R e s i s t,2021,14(1):1865-1874.[9]刘景武,王超,张蕊,等.免疫胶体金法用于碳青霉烯耐药肠杆菌耐药分型的临床应用研究[J].医学动物防制,2021,37(11):1119-1122.[10]杨巧玲,王梦鹤,林玉玲,等.五种方法检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的卫生经济学评价[J].中国循证医学杂志,2020,20(2):227-233.[11]包海林,花鸿燕,孙恒亮,等.改良C a r b aN p试验和m C I M/e C I M快速鉴定产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌表型的临床应用[J].检验医学,2022,37(10):963-968.[12]唐克文,李娟,冯丽娜,等.m C I M试验与e C I M试验在产碳青霉烯酶肠杆菌耐药表型检测中的联合应用效能[J].山东医药,2019,59(24):35-39.[13] T s a iYM,W a n g S,C h i u H C,e ta l.C o m b i n a t i o no fm o d i f i e dc a r b a p e n e mi n a c t i v a t i o n m e t h o d(m C I M)a nd E D T A-C I M(e C I M)f o r p h e n o t y p i c d e t e c t i o no f c a r b a p e n e m a s e-p r o d u c i n gE n t e r o b a c t e r i a c e a e[J].B M C M i c r o b i o l,2020,20(1):315.[14] B e n-H a i m O,A z r a d M,S a l e hN,e t a l.E v a l u a t i o no f t h eN G-t e s t C A R B A5k i tf o r r a p i d d e t e c t i o n o f c a r b a p e n e m a s er e s i s t a n t e n t e r o b a c t e r i a c e a e[J].L a b M e d,2021,52(4):375-380.[15] R a t n a y a k e L,A n g H Z,O n g C H,e t a l.A n o p t i m i z e da l g o r i t h m w i t hi m p r o v e dt u r n a r o u n dt i m ef o rd e t e c t i o n o fc a r b a p e n e m a s e-p r od u c i n g E n te r o b a c t e r a l e s u s i n g t h e N GT e s tC A R B A5i na r o u t i n e l a b o r a t o r y[J].JM e d M i c r o b i o l, 2020,69(2):228-232.[16] T a mm aP D,A i t k e nS L,B o n o m oR A,e t a l.I n f e c t i o u s d i s e a s e ss o c i e t y o fa m e r i c a g u i d a n c eo nt h et r e a t m e n to f A m p Cβ-l a c t a m a s e-p r o d u c i n g e n t e r o b a c t e r a l e s,c a r b a p e n e m-r e s i s t a n ta c i n e t ob ac t e rb a u m a n n i i,a n ds t e n o t r o p h o m o n a s m a l t o p h i l i ai n f e c t i o n s[J].C l i n I n f e c tD i s,2022,74(12):2089-2114.[17]任艳丽,王云英,蒋敏,等.不同碳青霉烯酶酶型肠杆菌科细菌感染的治疗策略研究[J].中国抗生素杂志,2021,46(4): 339-345.[18]d eO l i v e i r aS a n t o s I C,d aC o n c e içāoN e t oO C,d aC o s t aB S,e ta l.E v a l u a t i o n o f p h e n o t y p i c d e t e c t i o n o f c a rb a p e n e m a s e-p r o d u c i n g P s e u d o m o n a s s p p.f r o mc l i n i c a l i s o l a t e s[J].B r a z JM i c r o b i o l,2023,54(1):135-141.(本文编辑:刘斯静)㊃9331㊃薛云等 N G-T e s tC A R B A5在血培养肠杆菌科细菌碳青霉烯酶检测中的优势及其检测效能。
第42 卷 第 9 期2023 年9 月Vol.42 No.91194~1203分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO （Journal of Instrumental Analysis ）环境及生物样品中黑碳的质谱分析技术研究进展林悦1，2，闵可2，舒钊2，刘琳2，傅建捷1，2*，刘倩2*，江桂斌1，2（1．国科大杭州高等研究院 环境学院，浙江 杭州 310024；2．中国科学院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京 100085）摘要：黑碳是由生物质及化石燃料燃烧产生的含碳颗粒，是除CO 2外对全球气候变暖贡献最大的辐射强迫因子。
因此，黑碳对全球气候和环境系统具有重大影响。
其次，黑碳超小（<100 nm ）的粒径使其能够通过呼吸系统进入到人体内，其本身以及表面负载的有毒物质也会对人体健康产生严重危害。
为了厘清黑碳对环境和人类健康的影响，研究人员已发展了多种针对黑碳颗粒的分析技术，其中质谱技术凭借出色的抗干扰能力和强大的定性定量分析性能成为研究黑碳环境效应和健康风险最有潜力的技术之一。
该文综述了复杂介质中黑碳颗粒质谱分析技术的原理、技术特征和应用实例，并对未来黑碳的分析技术发展进行了展望。
关键词：黑碳；质谱技术；环境样品；生物样品；成像中图分类号：O657.6；O613.71 文献标识码：A 文章编号：1004-4957（2023）09-1194-10Research Progress in Mass Spectrometric Techniques for Analysis of Black Carbon Particles in Environmental and Biological Samples LIN Yue 1，2，MIN Ke 2，SHU Zhao 2，LIU Lin 2，FU Jian -jie 1，2*，LIU Qian 2*，JIANG Gui -bin 1，2（1．School of Environment ，Hangzhou Institute for Advanced Study ，UCAS ，Hangzhou 310024，China ；2．State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology ，Research Center for Eco -Environmental Sciences ，Chinese Academy of Sciences ，Beijing 100085，China ）Abstract ：Black carbon ，which comprises carbon-containing particle produced by the combustion of biomass and fossil fuels ，has been recognized as a significant contributor to radiative forcing and global warming ，second only to CO 2.Consequently ，black carbon exerts a substantial influence on global climate and environmental systems.Moreover ，the ultra -small particle size of black carbon fa⁃cilitates its entry into the human body via the respiratory system ，posing significant risks to human health due to both the particles themselves and the toxic substances adsorbed on their surface.To in⁃vestigate the impacts of black carbon on the environment and human health ，researchers have de⁃vised a range of analytical techniques.Notably ，mass spectrometry techniques exhibit exceptional an⁃ti -interference capabilities and offer robust qualitative and quantitative analysis performance ，render⁃ing it one of the most promising technologies to investigating the environmental effects and health risks associated with black carbon.This article provides a comprehensive review of the principles ，techni⁃cal advantages ，and representative applications of mass spectrometry techniques in the analysis of black carbon in complex media.Additionally ，the future prospects for the advancement of black car⁃bon analysis technologies was explored.Key words ：black carbon ；mass spectrometry ；environmental samples ；biological samples ；imag⁃ing 黑碳是生物质及化石燃料不完全燃烧产生的非纯净碳［1］。
