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·实验研究·大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养的实验研究夏家红 谢艾妮 徐磊 张凯伦 基金项目:国家自然科学基金资助项目(03970720);武汉市晨光计划青年基金资助项目(20035002016-17)作者单位:430022武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院心脏外科 【摘要】 目的 改进鼠肌卫星细胞体外培养方法,得到更高纯度的肌卫星细胞。
方法 采用成年Wistar 大鼠,将两步消化法加以改进,采用Ficoll 分离和差速贴壁法两步纯化得到更高纯度的肌卫星细胞。
所得细胞采用免疫组织化学方法加以鉴定。
结果 此方法肌卫星细胞纯化率可达到98%。
细胞增殖快,生长良好。
结论 本实验成功建立了卫星细胞纯化方法,适用于心外科及相关科室开展细胞移植和基因治疗方面的研究。
【关键词】 肌细胞; 细胞培养; 纯化C ulture of rat musclesatellite cell in vitro XI A Jia -hong ,X IE Ai -ni ,XU Lei ,et al .Depart ment ofCardiovascular Surgery ,Uion Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and T echnology ,Wuhan 430022,China【Abstract 】 Objective To improve the culture method of rat muscle setellite cell in vitro and ob -tain more purified muscle setellite cells .Methods T he mo re purified satellite cells w ere obtained from adult Wistar rats isolated by improved two -steps digestion metho d ,and purified by the tw o -step method of F icoll seperation and velocity sedimentation .T he cells w ere identified by immunochemical stain .Results T he purification rate of satellite cells was 98%by using this method and they showed stro ng proliferative ablity and g rew well .Conclusion T he purification technique for satellite cell was developed successfully .It w as useful for cardial surg ery department or other departments to study cell transplantion and gene therapy .【Key words 】 M uscle cell ; Cell culture ; Purificatio n 1961年Mauro [1]发现了骨骼肌卫星细胞,并证实其是骨骼肌干细胞。
犬三层心室肌细胞的分离和鉴别郭凯;黄从新;吴攀;尹小菲;周杰;邓伟【期刊名称】《中国心脏起搏与心电生理杂志》【年(卷),期】2008(22)3【摘要】目的探讨有效分离和鉴别犬三层心室肌细胞的方法.方法用带有左室前降支的犬心肌组织块灌流分离心室肌细胞,得到的心肌细胞先根据解剖部位大致分成三层,再采用膜片钳技术,在电流钳模式下,随机选择各层15个细胞记录动作电位(AP),根据AP的形态、时程、频率依赖性进一步判断是否为相应层的心室肌细胞.结果经左室前降支插管灌流心肌组织块,可以得到数量多、状态好的心肌细胞.在15个心室肌细胞中,能准确判断其层次的有:外层7个、中层5个、内层8个.结论经冠状动脉插管灌流分离犬心室肌细胞是可行的,结合解剖部位和动作电位特点,能有效鉴别不同层的心室肌细胞.【总页数】3页(P252-254)【作者】郭凯;黄从新;吴攀;尹小菲;周杰;邓伟【作者单位】武汉大学人民医院心内科,湖北武汉,430060;武汉大学人民医院心内科,湖北武汉,430060;武汉大学人民医院心内科,湖北武汉,430060;武汉大学人民医院心内科,湖北武汉,430060;武汉大学人民医院心内科,湖北武汉,430060;武汉大学人民医院心内科,湖北武汉,430060【正文语种】中文【中图分类】R331.3+8【相关文献】1.骨骼肌成肌细胞移植对慢性心力衰竭犬左心室功能的影响 [J], 李冬云;范利;何昆仑;刘宏斌;张波;王亮;张今尧;刘涛2.Azimilide对犬三层心肌细胞动作电位时程及跨壁复极离散度的影响 [J], 王军奎;于忠祥;崔长琮3.乙酰胆碱对犬右室三层心肌细胞L型钙电流不均一性的影响 [J], 高颖;周鹏;刘秀兰;杨新春4.模拟缺血对兔三层心室肌细胞快钠通道的影响 [J], 胡丽叶;何振山;崔俊玉;齐书英;杨丽5.模拟缺血对三层心室肌细胞快钠通道I-V曲线的影响及临床意义 [J], 胡丽叶;何振山;崔俊玉;齐书英;杨丽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
犬淋巴细胞的体外活化及增殖研究呼万红;訾振国;马小京;魏芳【摘要】为探讨犬淋巴细胞的分离、激活和增殖以进一步研究犬肿瘤的过继免疫疗法,用Ficoll密度梯度离心液对犬的全血进行分离,得到淋巴细胞.克隆犬CD86基因并构建了人工抗原递呈细胞K562.CD32.GFP-cCD86稳定细胞系.分别通过刀豆蛋白(ConA),抗CD28抗体,或者结合CD3抗体的K562.CD32.GFP-cCD86细胞激活犬淋巴细胞,通过Coulter Counter对T细胞进行计数和体积分析,并在显微镜下观察细胞激活后的形态变化.结果显示,在体外成功分离到犬外周血淋巴细胞.在不同扩增条件下,K562.CD32.GFP-cCD86结合抗CD28和CD3抗体对淋巴细胞有最好的激活效果和增殖效率,在激活第8天细胞可以达到44倍的增殖.研究结果为犬淋巴细胞的体外分离和增殖提供了有效方法,并为犬的肿瘤免疫治疗研究奠定了基础.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2019(040)003【总页数】5页(P54-58)【关键词】犬;淋巴细胞;激活;增殖【作者】呼万红;訾振国;马小京;魏芳【作者单位】上海交通大学生命科学技术学院,上海 200240;上海交通大学生命科学技术学院,上海 200240;上海交通大学生命科学技术学院,上海 200240;上海交通大学生命科学技术学院,上海 200240【正文语种】中文【中图分类】S852.4;S858.292每年大约有600万只犬被诊断出肿瘤，并且大约50%的犬在10岁左右被诊断出肿瘤，肿瘤类型包括淋巴瘤和黑色素瘤等。
犬的各种肿瘤统计发病率(5 300/100 000只)甚至高于人类(500/100 000人)[1-3]。
目前犬肿瘤的临床治疗以手术治疗为主，化疗和激光治疗为辅。
肿瘤治疗中新兴的免疫疗法在犬肿瘤治疗的探索还很少有文献报道。
因此，对犬肿瘤的免疫治疗研究具有很大的发展空间和前景，可为犬的肿瘤治疗提供更全面更理想的方案。
一种新的成年大鼠成肌细胞体外批量扩增培养方法刘淑红;吴海涛;陈晓萍;范明【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2009(020)001【摘要】目的:建立快速高效的成年大鼠成肌细胞分离、体外批量扩增培养的实验方法.方法:通过混合酶一步消化法从少量成年骨骼肌样品中分离成肌细胞;采用差速贴壁筛选法纯化分离并批量扩增成肌细胞.结果:混合酶一步消化法需要的时间为2.1±0.52 h,较之于传统方法所需要的6.8±0.67 h,分离细胞所需时阃显著缩短(P＜0.01);采用差速贴壁筛选法纯化分离的成肌细胞myf5/desmin阳性率＞97%,同传统分离扩增方法相比,体外批量扩增培养的这些成肌细胞具有典型的成肌细胞生长特性,在生长液中具有更好的增殖潜能,而在分化液中分化为肌营的特性无显著性差异(P＞0.05).结论:通过采用新建立的成年成肌细胞分离培养和批量扩增的方法,能够快速高效地获取高纯度的成肌细胞.【总页数】3页(P75-77)【作者】刘淑红;吴海涛;陈晓萍;范明【作者单位】军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850;中国航天员科研训练中心,北京,100193;军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850【正文语种】中文【中图分类】Q813.11【相关文献】1.一种有效分离及在体外扩增成年小鼠精原干细胞的方法 [J], 冉竞超;曹文广;孙红艳;王令;辛颖;张智英2.成年犬骨骼肌成肌细胞培养方法改良及生长特性研究 [J], 窦克非;杨跃进;阮英茆;王清峙;陈曦;陈纪林;高润霖;陈在嘉3.一种适合膜片钳记录的成年大鼠背根神经节细胞培养方法 [J], 刘晓红;曾俊伟;赵延东;阮怀珍4.成年大鼠骨骼肌成肌细胞的培养和鉴定 [J], 杨奕5.一种新的等温体外DNA扩增方法——链替代扩增 [J], 林峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
犬骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定吴胜东;葛建军;鲍峰;宫为一;吴宗阳【期刊名称】《武警医学院学报》【年(卷),期】2009(18)1【摘要】【目的】探讨分离、培养、纯化和鉴定犬骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征。
【方法】自犬髂后上棘抽取骨髓约10ml,1.073g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过及时、反复传代对MSCs进行纯化和扩增培养,测定生长曲线,并进行形态学观察。
流式细胞仪检测扩增后MSCs细胞周期及表面抗原特性。
【结果】MSCs在含10%小牛血清的IMEM中生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致,增殖速度快。
流式细胞仪检测表明MSCs强表达干细胞标记CD44,而不表达造血干细胞特异抗原CD34、CD11a、CD14和HLA-DR。
第2代(P2)末MSCs周期显示有82.4%的细胞处于G0/G1期。
【结论】密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离、纯化和培养犬骨髓MSCs。
【总页数】6页(P15-19)【关键词】骨髓间充质干细胞;分离培养;鉴定;犬【作者】吴胜东;葛建军;鲍峰;宫为一;吴宗阳【作者单位】武警安徽总队医院胸心外科;安徽医科大学第一附属医院心血管外科【正文语种】中文【中图分类】R329.24【相关文献】1.猫骨髓间充质干细胞的体外分离培养、纯化、鉴定 [J], 李俊义;徐华林;万京明;姜彦;李娜2.大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化及生物学特性的鉴定 [J], 卓文利;付云烽;徐廷昭;吴卫真;杨顺良;谭建明3.小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定 [J], 赵继学;王广义;张海玉;伏鑫4.犬骨髓间充质干细胞的分离纯化与体外培养方法的探讨 [J], 曹浩;葛建军;吴胜东;徐盛松5.采用1.068g/ml分离液对犬骨髓间充质干细胞的分离纯化与体外培养方法的探讨 [J], 牛国栋;任晓庆;王方正;浦介麟;杨国胜;孟亮;张澍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
骨骼肌实验报告一、引言骨骼肌是人体最重要的组织之一，负责身体的运动和姿势维持。
为了更深入地了解骨骼肌的结构和功能，本次实验旨在观察骨骼肌在不同条件下的运动表现，并分析其中的变化和原因。
二、实验材料和方法实验所需材料包括细胞培养基、骨骼肌组织样本、显微镜、培养皿等。
首先，从动物实验对象中取得骨骼肌样本，并通过适当的处理方法将其分离成细胞。
然后，将这些细胞放入培养皿中添加细胞培养基，放置于恒温培养箱中进行培养。
在培养过程中，可以通过显微镜观察骨骼肌细胞的变化，并记录下相应的数据。
三、实验观察与结果在实验过程中，观察到骨骼肌细胞呈现出不同的形态和运动表现。
当放置在培养皿中时，细胞会自发地进行收缩和伸展，呈现出规律的运动节奏。
在培养基中添加不同的药物后，观察到骨骼肌细胞的运动方式发生了变化。
例如，在添加镇静剂后，细胞的运动变得缓慢而有序。
而在添加兴奋剂后，细胞则呈现出异常兴奋的状态。
通过对实验观察结果的分析，我们可以得出以下结论：1. 骨骼肌细胞具有自发的收缩和伸展能力，这是维持身体运动和姿势的基础。
2. 药物的添加可以改变骨骼肌细胞的运动表现，进一步证实了药物对身体活动的影响。
3. 不同药物对骨骼肌细胞的作用方式也不同，有些会缓慢细胞的运动，而有些会提高细胞的兴奋性。
四、讨论与分析骨骼肌的运动受到神经系统的控制和调节。
在本次实验中观察到的不同运动方式，可以反映出神经冲动在骨骼肌收缩和伸展过程中的传导和调节。
不同药物的添加会对神经冲动的传导产生影响，进而改变骨骼肌细胞的运动方式。
此外，实验结果还可以为骨骼肌疾病的研究和治疗提供一定的指导。
通过观察药物对骨骼肌细胞的作用方式，可以研发出更有效的治疗手段，进一步改善骨骼肌疾病患者的生活质量。
然而，本次实验还存在一些局限性。
首先，由于实验条件的限制，我们只能通过细胞培养的方式观察骨骼肌细胞的运动变化，无法模拟完全真实的人体运动情况。
其次，实验中使用的药物数量和种类有限，可能无法涵盖所有可能的影响因素。
狗骨髓基质细胞的分离培养及成骨潜能的研究李晖;刘丹平;袁红霞;张男;赵卫华【期刊名称】《山西医药杂志》【年(卷),期】2006(35)2【摘要】目的观察狗骨髓基质细胞(MSCs)的生长特点及诱导条件下的成骨能力,为利用狗的MSCs进行成骨研究提供实验基础.方法从成年狗胫骨取骨髓进行MSCs 培养,检测细胞周期;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察细胞增殖;测定碱性磷酸酶活性;用Von Kossa染色法观察钙化结节.观察在条件培养液中MSCs生长及成骨分化情况.结果 MSCs增殖能力强,细胞周期显示有20%的细胞处于G0/G1期.诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性明显增高,10～12 d达到高峰,并出现钙化结节.结论体外培养狗的MSCs具有分化成骨的潜能,增殖能力强,可作为骨组织工程的种子细胞.【总页数】3页(P103-105)【作者】李晖;刘丹平;袁红霞;张男;赵卫华【作者单位】锦州医学院附属第一医院,121000;锦州医学院附属第一医院,121000;锦州医学院附属第一医院,121000;锦州医学院附属第一医院,121000;河南省周口市武警医院【正文语种】中文【中图分类】R74【相关文献】1.骨髓基质细胞的体外分离与培养及成骨分化的研究近况 [J], 潘华;王大伟2.狗骨髓基质细胞的体外诱导成骨潜能研究 [J], 尚显文;刘日光;尹培荣;杨述华;易诚青;刘建湘3.大鼠脂肪间充质干细胞分离培养及成骨潜能的试验研究 [J], 邓展生;张胜利;李宝军;郭晓柠;高嵩涛;鞠洪斌4.兔骨髓基质细胞的体外分离培养及诱导成骨的实验研究 [J], 李树春;陈钢;李文革;江智茂5.兔脂肪干细胞分离培养及成脂成骨分化潜能的研究 [J], 唐少锋;刘承杏;吴迪;姬林松;马涛;李世和因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠骨骼肌卫星细胞分离与纯化的改良作者：李小雷葛新玲来源：《中国保健营养·中旬刊》2013年第03期【摘要】目的：建立一种快速高效的小鼠骨骼肌卫星细胞的提取、纯化的实验方法，为进一步研究肌损伤与修复再生机制建立离体损伤模型奠定基础。
方法：两步酶消化法结合差速贴壁技术并对其改良，分离出骨骼肌卫星细胞，并进行免疫组化鉴定。
结果：改良后提取、纯化所得到的肌卫星细胞纯度可达到90%，明显高于普通方法。
结论：本实验通过改良骨骼肌卫星细胞培养方法，使肌卫星细胞纯度明显增高。
【关键词】肌卫星细胞；分离；纯化Mauro等[1]1961年首次在蛙骨骼肌中发现，肌卫星细胞是一种源于胚胎中胚层的干细胞。
在发育成熟的个体，呈小单核梭形分布于肌纤维浆膜和基底膜之间，在正常情况下处于静息状态。
当肌肉受到损伤等刺激时，则可进入有丝分裂循环，形成肌肉修复所需的细胞[2～4]。
新生细胞可以相互融合形成新肌束，或融入已有肌束，以修复肌组织损伤。
正是由于卫星细胞的这些特性，使其成为肌肉组织工程、基因工程和胚胎发育研究的新热点[5～6]。
但肌卫星细胞的分离与纯化也成了亟待解决的问题，普通方法分离时含有大量的杂质细胞，本实验旨在提高肌卫星细胞的纯度。
1 材料与方法1.1 材料4～6周龄清洁级C57 BL/6小鼠（15～17 bg），雄性，由中国科学院上海实验动物中心提供。
DF培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（Trypsin）均购自美国Gibico BRL公司。
小牛血清（FCS）购自Hyclone公司。
1.2 方法1.2.1 准备取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒30 min。
开始操作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
5～7日龄C57BL/10小鼠2只，DMEM/F12培养基，10% FCS+5% FBS，PBS缓冲液，0.25%胰蛋白酶，0.1%Ⅰ型胶原酶。
1.2.2 处理组织将小鼠断颈处理，碘伏浸泡后，75%酒精浸泡消毒5 min，用消毒剪刀剪开下肢皮肤，剪断后肢，分离出股四头肌，将其置于培养皿中，PBS缓冲液漂洗2～3次，去除血污（如怀疑组织有污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30～60 min）去除筋膜、神经、脂肪和肌腱等，将股四头肌置于青霉素小瓶中用剪刀反复剪碎约1 mm组织3块。
DOC格式论文，方便您的复制修改删减 犬骨骼肌成肌细胞体外分离、纯化及培 养方法改良探索
（作者： _________ 单位： __________ 邮编： ____________ ）
作者：苏冠华,刘启云，卢永昕，米少华，孙雨霏，刘晓明， 帅欣欣 【摘要】 目的：探讨犬骨骼肌成肌细胞（SkMS体外分离、纯 化及培养方法的改良并研究其生物学特性。 方法：采用机械分离结合 H型胶原酶、中性蛋白酶双酶一步消化法分离犬骨骼肌成肌细胞 ， 经差速贴壁法纯化后，在骨骼肌细胞生长培养基（SKGM中进行原代 和传代培养，免疫细胞化学染色鉴定。结果：改良后的培养方法适于 获取犬骨骼肌成肌细胞，SKGM培养基适于犬骨骼肌成肌细胞的体外 培养。SkMs在细胞密集或低血清分化培养基作用下可融合成肌管。 结蛋白（desmin）单克隆抗体（mAb细胞化学染色鉴定SkMs呈阳性， 纯度在90%以上。结论：通过改良后的双酶一步消化法获得的 SkMs 在合适的培养条件下能够增殖、 分化并保持其生物学特性，为其在 基因治疗和组织工程中的应用奠定了基础。 【关键词】犬；骨骼肌成肌细胞；细胞培养；生物学特性 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 1961年，Mauro等首次在蛙骨骼肌中发现了具有自我更新和分化 形成肌纤维能力的肌卫星细胞(muscle satellite cells )。从骨骼
肌中分离获得的肌卫星细胞在体外分离培养时被统称为骨骼肌成肌 细胞(skeletal myoblasts, SkMs)。来源于骨骼肌的成肌细胞具有取 材方便、免疫源性低、植入后容易与宿主的肌纤维融合、 体外培 养条件下较易被携带外源基因的病毒转染、 转染外源基因的成肌细 胞可释放重组蛋白到局部或体循环中等优点 [1]。因此，成肌细胞被 广泛应用于基因治疗和组织工程方面的实验研究。 本研究以获取基因 治疗载体SkMs为目的，探讨建立简便、 经济的成肌细胞分离、 纯 化及培养方法。 1材料和方法 1.1材料
实验犬由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。 中性蛋白 酶购自美国Roche公司，H型胶原酶、 结蛋白(desmin)单克隆抗 体(mAb购自美国Sigma公司；SKBM培养基和SKGM Bullet Kit 购 自美国Lonza公司；亲和素拟生物素拟过氧化物复合物法 (avid in拟biotin complex, ABC )免疫组化试剂盒购自美国 Vector 公司,DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司 ；胰蛋白酶、DMEM M199培养基购自美国 Hyclone公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS ,小牛血清购自美国Gibco公司。 1.2方法 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 1.2.1 SkMs的原代培养 完全生长培养基70SKGM各成分按以下比例SKGM DMEM FBS= 70 : 25 : 5配制。无菌全麻下自5〜8 kg左右杂种犬股四头肌取3〜5 g肌肉，将其移入盛有PBS勺90 mm培养皿中剔除筋膜、 脂肪、肌 腱和血管组织后剪为碎糜状，将组织块移入盛有约30 mL的4 g/L中 性蛋白酶和1 g/L H型胶原酶混合消化酶溶液的 100 mL玻璃瓶中， 37C恒温摇床60 r/min, 1 h 。然后吸取9 mL上清液经孔径75卩m 的不锈钢网筛（200 目）过滤到10 mL玻璃离心管中，再加入1 mLFBS 中和，1 000 r/min, 离心5 min,弃上清。力口 70SKGM培养基重悬细 胞沉淀，种入明胶预包被的培养瓶。再加入双酶溶液重复消化上述剩 余的组织块，反复3〜4次。计数、台盼蓝染色确认细胞成活率。2 d 后换液，以后每2〜3 d换液1次，在倒置显微镜下观察细胞形态和 生长情况。 1.2.2 SkMs的传代培养及纯化 倒置显微镜下观察细胞生长情况，当细胞生长到培养瓶面积的 70%〜80%寸,以2.5 g/L胰蛋白酶+ 0.2 g/L EDTA混合溶液消化，中 止消化后离心，重悬细胞后将细胞悬液接种另一培养瓶，静置于培 养箱内约8〜10 min后取出，轻轻晃动培养瓶，动员未贴壁的细胞， 吸出培养液接种另一培养瓶，反复差速3次。最后按1 : 2或1 : 3比 例进行传代，每2〜3 d换液1次。4 g/L台盼蓝染色确认细胞成活 率。 1.2.3 SkMs细胞生长曲线测定 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 取处于对数生长期的细胞，用上述EDTA胰酶溶液消化后制 成单细胞悬液，细胞计数后以5X 103细胞/孔接种于24孔板，共接 种8组，每组3孔，每天取一组细胞进行计数，计算平均值，连续8 d,绘成细胞生长曲线。未计数孔细胞每 2〜3 d换液1次。
124 SkMs的诱导分化 取培养至第2〜3代的细胞，消化后以1X105细胞/孔接种于放 有盖玻片的6孔培养板中，加入生长培养基进行培养，待细胞分裂、 增殖至70%〜80%匚合后，加入分化培养基（含 200 mL/L FBS的M199 培养基）继续培养，倒置显微镜下观察细胞生长及分化情况。 1.2.5 SkMs的免疫细胞化学染色
将细胞接种于有盖玻片的6孔板，待长至培养面积的80%取 盖玻片。40 g/L多聚甲醛固定后，以ABC法行免疫化学染色，以鼠 抗desmin mAb为一抗，DAB显色。 1.2.6差速贴壁组与非差速贴壁组纯化所得细胞 desmin阳性数 比较 取等量的第2代细胞悬液种于25 cm2培养瓶，差速贴壁纯化组 与非差速贴壁组各2瓶，制作细胞爬片行desmin免疫化学染色。每 组取4片，每片随机取5个视野进行采样，以Olympus BX50显微摄 像系统进行阳性细胞计数，所得数据以x 2检验进行统计学处理。 2结果
2.1 SkMs体外培养的生物学特点 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 经酶消化分离出的成肌细胞为圆形小亮点，悬浮于培养液中。有 活力的细胞能够在48 h内完全贴壁，变扁并向四周伸展而成为一梭 形或纺锤形细胞，有折光性（图1A）。约3~4 d后进入对数生长期 （图1B） , 6〜7 d后因接触抑制生长速度减慢。细胞增多后逐渐按 一定方向呈有序排列。 2.2骨骼肌成肌细胞体外培养的鉴定 221多核肌管形成 在体外培养的成肌细胞当细胞密集或改变培养基中的血清浓度 时，可清楚地观察到长轴方向胞质融合后形成多核肌管（图 2）。 2.2.2 desmi n细胞免疫化学染色 差速纯化后培养的成肌细胞经 desmin进行免疫化学染色（DAB 显色），成肌细胞胞质呈阳性反应，细胞核外周及胞质呈棕黄色，表 明培养的细胞为成肌细胞（图3）。多核肌管呈强阳性。 2.3成肌细胞生长活性测定和生长曲线的绘制 原代细胞进行台盼兰染色，结果发现97%以上的细胞均不着色， 表明本实验方法培养的细胞存活率高。细胞连续计数所绘制的成肌细 胞生长曲线显示：细胞在培养的3〜5 d增殖达高峰，5〜7 d后基本 达生长平台期。 2.4成肌细胞的差速纯化 将差速贴壁组与非差速贴壁组纯化所得细胞进行 desmin免疫化 学染色，发现两组阳性细胞数有显著差异，经计算得x 2值为5.47, P0.05为具有统计学意义。 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 3讨论 SkMs是位于骨骼肌纤维膜与基底膜之间的组织干细胞。当骨骼肌受 损伤时，可被启动形成新的骨骼肌纤维［2］。一般来讲，肌肉来源的 动物越老，分离肌肉细胞所需要的时间越长，而且单个核前体细胞 的产量也越低。国内大多数研究取成年犬的骨骼肌组织坚韧，同时由 于成肌细胞量少，提取困难。本实验综合国内外研究经验，采用了约 5〜8 kg的未成年犬进行原代培养，产量较高。目前提取犬成肌细胞 大多采用机械分解法结合三步消化法［3］（1型胶原酶，透明质酸酶, 链霉蛋白酶）或二步消化法［4］ （I型或IV型胶原酶+胰蛋白酶） 获得单细胞悬液，步骤繁琐，成本均较高。蛋白水解酶如胰蛋白酶， 链霉蛋白酶等往往还存在可能损伤细胞、 在孵育的过程中不稳定、可 能成为支原体污染的来源等缺点。而中性蛋白酶则能够克服以上缺 点。故本研究创新性地采用中性蛋白酶/ H型胶原酶混合酶溶液一步 消化法，大大简化了流程并以较少的代价获得足量的原代成肌细胞。 研究认为，原代细胞中混有大量的成纤维细胞，既往为提高纯度往 往采用不连续密度梯度离心法］5］、免疫磁珠分离法］6］、不完全消 化法等方法，但均以操作复杂、产量低或价格昂贵为代价。差速贴壁 操作方法简单有效，具有很大的适用性。原理是利用成纤维细胞的贴 壁能力强于成肌细胞，10 min 左右即可贴壁，而成肌细胞多数仍处 于悬浮状态，此时移出培养液，即为纯化的成肌细胞。本实验中采用 3次预贴壁，每次10 min进行差速纯化获得的成肌细胞经鉴定阳性 率均在90%以上,符合组织工程拟基因治疗的纯度要求。
据已有文献报道，不同种属动物SkMs的最佳培养条件不 同。目前犬 SkMs常用的生长培养基有 M199, MEM, DMEM, F12以及 RPMI1640等。SkMs体外增殖、分化除受血清浓度改变的影响之外，还 要受到多种因子的调节，如胰岛素、肝细胞生长因子（HGF、胰岛素 样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EDF、碱性成纤维生长因子（bFGF 等。研究证实]7],在不含任何生长因子的 DMEMM199等生长培养 基进行培养时，原代细胞中混杂的成纤维细胞迅速生长 ，并随着传 代次数的增多呈几何级数增长逐渐占据优势。包含特定生长因子的生 长培养基更适合于SkMS的增殖培养。SKGM培养基中含有胰岛素，EGF, 地
