人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析 一、实验背景 1、Carnoy固定液： 固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。 2、低渗液（hypotonic solution） 低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。②用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。 2、肝素 N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。 2、PHA 植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。由于其较难提纯，且成本极高，所以一直以来仅在实验室中作为刺激淋巴细胞增殖的试剂。 3、青霉素和链霉素 青霉素：青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。 链霉素对许多革兰阴性杆菌有抗菌作用。链霉素对葡萄球菌属及其他革兰阳性球菌的作用差。链霉素的作用在PH值为7.8时最强，PH值降至6或6以下时则大大减弱。四环素作用机制为药物能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。 4、秋水仙素 秋水仙能素破坏纺锤体,阻断细胞有丝分裂,使分裂的细胞全部阻止在中期。实验中要严格控制培养物中秋水仙素的浓度,不仅保证有效的终止细胞第一次分裂,而且使秋水仙素的细胞毒
https://www.doczj.com/doc/fa5015659.html,/bbs/topic/791076?keywords=淋巴细胞 分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。现在大多数用的密度梯度离心法。一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。 我的经验 1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释 2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！） 3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。 4. 离心 .转速：1500/分 温度20c －28c 时间：20分钟 no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大) 5。取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞 6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！ 7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。还有办法的。 8 离心。转速：2000－2300/分（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！) 时间：10分钟 温度：4c 9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你） 10.细胞计数＋洗涤细胞。刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。这样是不是很节省时间？？ 11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形. a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数） b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞 c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。总共数4大正方形 d.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x 104 x 4 得到的就是细胞的浓度 e 细胞总数是：细胞浓度x1ml（现在知道为什么重悬到1ml了吧？） 12.培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。加入rIL-2 25－50u/孔后，放入培养箱. 看了pbmc 的经验很受启发，我不是做pbmc分离的，但曾经用过淋巴细胞分离液，谈几点体会，希望能共同提高！ 1、因为吸取上层血浆的时候很容易打乱层次结构，离心后我一般直接用吸管伸入中间层吸出所需细胞，然后再吸血浆，如果与淋巴细胞分离液交界处变混浊，少吸一点就是了，反正血浆多得是 2、吸取细胞的时候尽量不要吸到下层的淋巴细胞分离液，因为淋巴细胞分离液的比重比淋巴细胞大，用离心的方法是不可能去除的 3、重悬细胞的时候不要用含血清的培养基，因会使细胞粘附成团 建议; 不同厂家生产的淋巴细胞分离液，密度不同。所以第一步离心的转速也会有所不同。最好是按照说明书摸出最合适的转速，这是分离成败的关键！！！！！！。
实验报告 课程名称：分子医学实验 指导老师： 成绩： 实验名称： 人类外周血染色体标本制备G 带观察及核型分析 同组学生姓名： 一、实验目的及原理 三、实验结果 二、操作步骤 四、讨论分析 一、 实验目的及原理 熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法。 初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。 通过实验掌握Ｇ带标本制备的基本方法，学会在显微镜下直接观察G 带分裂相。 在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。 在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。在细胞培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA) ，可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 有许多显示Ｇ带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa 染色。胰酶可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。通过胰酶处理使Ｇ带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态。由此可见在Ｇ带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。 关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。 二、操作步骤 人类外周血染色体标本制备
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 The final edition was revised on December 14th, 2020.
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
人体外周血淋巴细胞培 养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
实验原理 人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。 细胞遗传学、组织培养技术为 人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于： （1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。 （2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。 （3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。 实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。 磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克 溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中 实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。实验材料 人的外周血淋巴细胞
实验五人的外周血淋巴细胞培养 一、实验原理 外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 二、实验目的 掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。 三、实验材料 人的外周血。 四、实验器具和药品 1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 2．器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。 将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。 隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。 3．药品 (1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO， 1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。 (4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。
RDW 均增大,属不均一性大细胞贫血,红细胞巨幼样变。红细胞指标M CV 、M CH 、H CHC 的测定是进行形态学分类的依据,过去把贫血分为大细胞、正细胞正色素、小细胞低色素、单纯小细胞4个类型,此法忽视了红细胞体积的异质性对指标准确性的影响,不能全面反映红细胞的病理变化。 笔者认为,M CV 及R DW 测定结合了红细胞形态学分类,可得到较可靠的初步诊断意见,进而做特殊检查可明确诊断。 M CV 、RDW 对缺铁性贫血与巨幼红细胞性贫血有较好的诊断价值,可作为一种快速、简单、方便、准确的筛选方法。参考文献 [1] 丛玉隆.今日临床检验学[M].北京:中国科学技术出版社,1997:9. (收稿日期:2010-12-16) v 通讯作者,E -mail:zh anggu oyuan9826@sin https://www.doczj.com/doc/fa5015659.html, 。 #经验交流# 外周血淋巴细胞培养及染色体制备的几点体会 马 强,刘青松,蔡 燕,邢 艳,张国元 v (川北医学院附属医院检验科,四川南充637000) 摘 要:目的 总结该室外周血淋巴细胞培养及染色体制备的成功经验,供同行参考与借鉴。方法 采用外周血淋巴细胞培养基接种外周全血,按照常规方法制作染色体标本,进行镜检。结果 该室培养的淋巴细胞数量稳定,染色体核型质量佳。结论 该室制作的染色体标本质量能满足临床染色体核型分析需要。 关键词:染色体; 外周血; 淋巴细胞DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2011.14.061文献标识码:B 文章编号:1673-4130(2011)14-1641-02 染色体检查作为干预出生缺陷、提高人口素质的一个重要内容和措施,对优生优育工作有着重大意义[1]。然而,染色体制备过程缺乏有效的质量控制,经验在染色体标本制备过程中占有重要的地位。为了获得良好的制片,在笔者及同事的摸索下,本室制作的染色体标本质量稳定,基本满足临床分析需要。笔者就这一过程中的要点与大家分享,以供同行参考。1 淋巴细胞培养 1.1 外周血采集 一般情况下,在采集外周血时,采用5mL 空针吸取0.5mL 左右无菌肝素作为抗凝剂,再采集患者外周静脉血。然而,在当今复杂的医疗环境下,这样的操作可能会给患者带来不符合操作规范的感觉。为了避免不必要的医疗纠纷,本室采用动脉血气针(BD 公司生产)抽取2~3mL 外周静脉血,备用。在操作过程中要始终保持无菌观念,用碘酒和乙醇消毒皮肤,自肘静脉采血,然后要把注射器内的血液充分轻轻混匀,以防止血液凝固,影响细胞培养质量[2]。 1.2 接种 培养基的质量在影响染色体质量方面最为关键,从营养不良的培养基中获得的细胞所制备的染色体质量差,不利于染色体核型分析。本室采用湖南湘雅基因技术有限公司生产的成品外周血淋巴细胞培养基(5mL ),只需将采集的外周血接种适量在培养基中,摇匀后置入CO 2孵箱中培养即可。接种时,若血液过少,获得的淋巴细胞少;而接种过多,淋巴细胞增殖不良,染色体稀少。经过摸索,发现成年人接种血气针采集的血液20~25滴为宜,4岁以下儿童接种15~20滴为宜,新生儿则只需8~10滴。 1.3 细胞培养 细胞培养阶段也是极为关键的一步,细胞的旺盛生长与培养时间、温度、CO 2浓度等条件。1.3.1 培养时间 经过试验,分别取培养24、(48?2)、(72?2)、(96?2)h 的培养物分离淋巴细胞,制片,核型分析后发现:培养24h 者几乎见不到分裂象;培养(48?2)h 者,每张制片上可见中期分裂象小于10个,且染色体质量差;培养(72?2)h 者,每张制片上分裂象大于200个,染色体质量佳;而培养96h 者,其质量与培养(48?2)h 者相差无几。因此,本室培养细胞的时间控制在72h 左右,制作出的染色体核型佳,有利于 分析。 1.3.2 培养温度与气体 淋巴细胞培养的适宜温度为(36.5?0.5)e ,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡。如果温度高于37e ,细胞的生长速度减慢;如果温度高于40e ,细胞受损,超过43e ,则导致细胞死亡。气体是人体细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有O 2、CO 2。CO 2既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH 值。大多数细胞的适宜pH 为7.2~7.4,培养基的pH 值也应调整到7.2~7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。偏酸性时细胞发育不良,偏碱性时细胞会出现轻度固缩[3]。培养箱的温度和CO 2浓度应严格控制在(37?0.5)e 、5%以获得良好的中期分裂象。2 细胞收获 2.1 秋水仙素与作用时间 秋水仙素作为细胞培养中的纺锤体阻断剂,可使分裂象细胞停留在分裂中期而获得大量分裂中期染色体以便于核型分析。加入秋水仙素的剂量、作用时间与处于分裂中期细胞数量、染色体长短密切相关。加入的秋水仙素过量、作用时间过长,染色体浓缩,不利于分析;若加入的秋水仙素量不足、作用时间过短,则染色体细长或无染色体,同样不利于核型分析。只有适量的秋水仙素与适量的作用时间,才能获得较好的分裂象。本室加入秋水仙素使最终浓度为0.025%,作用1~1.5h 可获得数量多、浓缩程度适中的染色体。 2.2 离心力 将培养物收集到15mL 的离心管中,通过离心获得需要的细胞。整个过程中,离心力的大小很关键。离心力过大会导致细胞之间粘连过紧,低渗时细胞不能被充分混匀,影响低渗效果。这一步本室选择1900r /min 离心10min 。而低渗过后预固定与固定过程中,去除固定液时由于细胞少,过小的离心力不能将细胞充分沉淀。为了尽可能的获得多的细胞,本室采用2500~3000r/min 离心10min 。此外,在去除上清液的时候不要将上清液吸尽,以免造成细胞丢失。 2.3 低渗 低渗的目的是让水分进入细胞,使细胞肿胀、破裂,是染色体制备过程中的关键环节之一。低渗液渗透压过
实验方案 实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、实验目的 1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。 3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其 识别。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。 染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。 在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。 正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。 染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。 表1 人染色体组型及其特征
第四大组实验方案 外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、实验目的 1.了解动物细胞培养的方法。 2.掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 3.学会对人类染色体的组型分析。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。经过短期的培养后，用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理细胞，使细胞胀大而不破裂使最后的子染色体充分散开，滴片后再以空气干燥法制片，可获得质量较好的染色体标本。人类外周血细胞几乎都处于G0期和G1期，一般情况不分裂，但在离体培养中，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，可转变成可分裂的转化细胞。 核型是指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。正常的核型能代表个体的核型。组型是以模式图的方式表示，它是通过多许多细胞染色体的测量取其平均值制成的，是理想的、模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。 染色体的特征以中期最为显著，所以一般都都分析中期分裂相，根据染色体着丝粒位置的不同，可将染色体分为中部着丝粒染色体（m），亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝粒染色体（st），端部着丝粒染色体（t）。 对任何一个染色体的基本形态，重要参数有3个： 1.相对长度，指单个染色体长度与包括X与Y染色体在内的单倍染色体总长之比，用百分率表示。 2.臂指数，指长臂同短臂的比率。按Levan（1964）的划分标准，臂指数在1.0~1.7之间的称中部着丝粒染色体；臂指数在1.7~ 3.0之间称亚中部着丝粒染色体；臂指数在3.0~7.0之间称亚端部着丝粒染色体；臂指数在大于7.0者称端部着丝粒染色体 3.着丝粒指数，指短臂占该染色体长度的比，用百分率表示。他决定着丝粒饿相对位置。按Levan（1964）的划分标准，着丝粒指数在50%~37.5%之间称中部着丝粒染色体；指数在 37.5%~25.0%之间称亚中部着丝粒染色体；指数在25.0%~12.5%之间称亚端部着丝粒染色体；指数在12.5%~0.0%之间者称端部着丝粒染色体。 正常人类染色体的数目为46条(23对，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22
人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead 等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。 细胞遗传学、组织培养技术为 人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于： （1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。 （2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。 （3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan提出染色体显带技术。 实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。 磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克 溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中 实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。
外周血染色体核型分析项目简介 临床应用：用于染色体遗传病的诊断、不孕不育、先天畸形、智障诊断、胚胎植前筛选等。 检测结果的临床意义 我国，人口中有20-25%的人患有各种遗传病，其中由染色体病导致的有近1400多万人。染色体病主要表现为不孕、不育、反复性或自发流产、死胎、生育异常儿、闭经、智力发育不全或智力低下、多发畸形等。然而，染色体病至今没有特殊、有效的疗法，主要在于预防和早期干预，所以做染色体检查，对于遗传咨询、降低出生缺陷、正确的生育指导及提高人口素质均具有重要意义。 适检人群 1.不明原因的生长、发育迟缓，异常面容，多发畸形，身材矮小，两性畸形和智力发育迟缓的病人。 2.不明原因死产和新生儿死亡。10%是由于染色体异常导致。 3.具有原发性闭经或不明原因的继发性闭经的女性。 4.原发性不育或习惯性流产的夫妇。约3%～6%的原发性不育或习惯性流产的夫妇，其中一方存在染色体异常。 5.一级亲属中携带已知的或者可疑的染色体异常。 6.肿瘤。几乎所有的肿瘤都与一条或多条染色体异常相关，肿瘤组织的染色体检查有助于临床诊断和预后评估。 7.高龄妊娠。孕妇年龄大于30～35岁时，其胎儿染色体异常的风险明显增加，因此应对高龄孕妇的胎儿常规进行染色体分析。 标本采集要求 1.采集要求：无菌采静脉血3ml，使抗凝剂与静脉血充分混匀,防止凝固，等待本中心配送人员收取，应在室温4～25℃保存。采样和送检过程要严格无菌操作，严防溶血、凝血。 2.化疗期间病人和大剂量或长期使用抗生素病人需停药半个月后采血。 3所有样本应在保质期内及时送检（保存24小时）。过了保质期样本不能保证培养效果。或通知临床重新抽血送检。 4.如有大量饮酒或有酗酒习惯，采血期间尽量避免。 临床项目收费标准
人外周血染色体标本制备 一、培养基的选择与接种 培养基主要的作用是为培养的细胞提供营养，以让其更好的生长。其基本成分有双抗（青霉素和链霉素）、水、PHA、小牛血清、酚红等。小牛血清和植物血凝素偏高或偏低，以及PH值均会影响染色体的分裂。反复冻融的培养基对培养的效果也不好，一因PHA随着不断的解冻其效价也不断降低，二是因为含有细胞DNA生长必须的氨基酸，而此氨基酸会随不断的解冻而消失。培养基颜色改变及浑浊均不能再用。 接种血液时，视不同年龄群的人而异。小孩或者新生儿接种量比成人少，因为小孩和新生儿的白细胞比成人的高很多。血液太少，细胞稀薄并且生长速度减慢；血液太多，会造成培养细胞生长时营养成分不够，影响细胞的生长状态。 二、秋水仙素 其作用是阻断纺锤体拉向两级，使正在分裂的细胞停留在分裂中期，以便获得大量中期的分裂相以分析染色体之用。使用秋水仙素时应注意使用时间、作用时间、浓度、量等。一般而言，在收获细胞前1.5-2h加入。加入过多，染色体太短；反之，染色体瘦长或无中期分裂相。 三、低渗 这是染色体制备中关键的环节，目的是使淋巴细胞吸收水分而膨胀和中期染色体分散铺展。低渗效果与处理的时间、低渗的温度，低渗时吹打混匀细胞的力度有关。一般用 0.075mol/L的KCL。低渗时间不够，染色体分散不好，细胞粘连，呈团状；低渗时间过长，可是细胞破碎，染色体丢失，甚至会因染色体胀大得过分和使其形态结构模糊不清，变得难以消化及染色。一般加入8毫升，于37度水浴箱中低渗20-30min为好。 四、固定 为了维持染色体的固有形态。固定液可使细胞脱水，蛋白变性而使染色体粗大适中。注意：固定液需要现配现用，因为固定液所含的水分与固定效果有关。吹打细胞时，要注意用力，以免细胞丢失过多，因为低渗后的细胞很脆弱。 五、滴片 先制成细胞悬液，浓度适中，随个人喜好。但不因太浓，因其会使染色体分散程度受限。也不宜太淡，以免滴片时细胞分裂相稀少。一定要注意好温度、湿度的关系，这是要点。一般制片两张，然后置于75摄氏度烤箱中烘烤3h。
外周血染色体制备与分析技术规范 原理： 在正常情况下，人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。植物血球凝集素（PHA）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有HPA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞，例可得到所需的人体染色体图形。具有用血量少、操作简单等优点。 1、实验材料 2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签或棉球、镊子、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、载玻片等。 2、培养液配制 无菌条件下配制培养液，每瓶所含下列试剂： RPMI 1640或199 90% 小牛血清 10% PHA（自制） 0.1ml 3% 肝素 10u/ml 2% 双抗 100u/ml（选择） 分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，封口置冷藏柜备用。
3、植物油凝素的制备 植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。自制的方法常用生理盐水提取法。 （A）干品制备法 （1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。恒温箱内24-48小时； （2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。每8-12小时摇荡一次。（也可一次性加100ml生理盐水）； （3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30分钟。在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用； （4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。（B）鲜品制备法： （1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟； （2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口； （3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30 分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。（4）效价：正式使用前先用一定量作效价测定，按效价使用。 检查人染色体的数目、结构是否正常。
外周血染色体培养基 用途：染色体培养是染色体病诊断的必要手段。用外周血作短期培养是常规染色体分析的基本方法。迄今已发现的各种遗传病不下数千种，其中属于染色体异常所致者已达数百种，，已发现的先天性畸形、智力和功能发育不全、流产、死胎、不育以及某些恶性肿瘤的生成与发展都与染色体有关。因此研究染色体的情况显得非常重要。本公司生产的外周血染色体培养基用于细胞培养，是细胞遗传、免疫、放射效应、药物致畸等研究必备的培养基。 检测原理：将肝素抗凝全血或富含白细胞的血浆，接种到含有致有丝分裂原（常用者为植物血凝素，PHA）的细胞培养基中，PHA可刺激细胞DNA的复制，促进有丝分裂。经一段时间的培养后，加入秋水素碱或秋水仙胺（或长春花碱），以抑制纺锤体的形成和着丝粒分离，使细胞停止于分裂中期。作用一定时间后，收集细胞；低渗处理，以溶去红细胞并使细胞膨胀，使染色体分散；再经固定、制片、染色，显微镜下分析；必要时再显微摄影、放大、作细致的染色体计数、配对和结构观察。 自身优势：1分裂指数高（每个涂片能找到可供观察的分裂相不少于40个）2染色体形态清晰3质量稳定4配套有染色体核型分析及样本处理所必需的产品（1秋水仙素2低渗液3胰蛋白酶4吉姆萨染液5肝素），经国内众多细胞遗传室的应用，反馈信息良好。 使用中注意事项 1加入秋水仙素之前的操作必须保证严格无菌，如污染了杂菌，细胞培养即失败。但加入了秋水仙素以后的步骤，对无菌不作严格要求。因为加了秋水仙素以后再培养4-6小时即可，在这么短的时间内细菌不会大量生长以致于影响到染色体的观察。 2.加秋水仙素后继续处理2-4小时比较合适，如时间太短，标本中可分析的分裂象太少；如时间太长，分裂象虽多，但染色体多半缩得很短，着丝粒开始分离，不利于各染色体的鉴别。 3.收集细胞和低渗处理时，离心速度不宜过高，以免膨胀的细胞受压、破裂，染色体变形和不易打散。 4染色体分散好坏，加固定液固定是关键。一般应换固定液固定三次，中间可吸取少量在显微镜下检查以确定是否满意。 5.如要远距离运送标本，可将全血用无菌手续加到培养基中，保温37℃或常温下运送。如暂时不送亦可置冰箱中保存，但不宜超过12小时，收到标本后应立即置37℃孵育。
人的外周血淋巴细胞培养 摘要：正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大多处于G0期。但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析。[1] 关键词：外周血淋巴细胞低渗处理空气干燥法染色体组型分析 前言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。此方法取材方便，用血量少，操作简便。 1960年Nowell和Morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞[2]，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。 淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片在室温中自然干燥的方法。[3] 淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。各种因素的作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体内无法进行的研究。本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。[2]染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。 1.材料方法 1.1 材料 人的外周血淋巴细胞。 1.2 器具 采血针、20mL培养瓶、毛细管、离心管、载玻片和盖玻片、显微镜、恒温箱、离心机、电子天平、分析天平、精密PH试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪
实验报告 课程名称：分子医学实验指导老师：_ _ ________成绩：__________________ 实验名称：人类外周血染色体标本制备以及G带标本制备组别：___同组学生姓名： 一、实验原理 1.人类外周血染色体标本制备 在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。 在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。在细胞培养过程中加入植物血凝素（phytohaemagglutinin, PHA），可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。 本方法在遗传病的诊断等方面广泛应用。 2.G带标本标本制备 将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行预处理，胰酶可以从染色体上抽取特定的疏水蛋白 然后用Giemsa染色。A-T相对丰富的区域染为深带，G-C相对丰富的区域染为浅带 Giemsa染料是由天青和伊红分子，染色首先取决于二个天青分子同DNA结合，在此基础上它们结合一个伊红分子，其次取决于一个有助于染料沉淀物积累的疏水环境。 二、实验步骤 1. 采血、接种 2. 细胞培养（lymphocytes culture） RPMI1640培养液(含PHA)，37℃±0.5℃恒温中培养72小时。 3. 秋水仙素(colchicine)处理 在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。 4. 离心（centrifugation） 以1000rpm离心10分钟，弃上清，留沉淀，并用吸管打匀。 5. 低渗处理（hypotonic treatment） 加８毫升预温(37℃)的0.075M KCl低渗液（hypotonic solution），用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，37℃水浴箱静止25－30分钟。 6. 预固定（pre-fixation） 低渗后，加新配的固定剂（甲醇︰冰醋酸=3︰1）１毫升，用滴管打匀。 7. 再离心 1000rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀。 8. 固定(fixation) 加入固定液（甲醇︰冰醋酸= 3︰1）至5ml，将沉淀打匀，固定15分钟。 9. 再离心 1000rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀。