第四大组实验方案
外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析
一、实验目的
1.了解动物细胞培养的方法。
2.掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。
3.学会对人类染色体的组型分析。
二、实验原理
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。经过短期的培养后，用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理细胞，使细胞胀大而不破裂使最后的子染色体充分散开，滴片后再以空气干燥法制片，可获得质量较好的染色体标本。人类外周血细胞几乎都处于G0期和G1期，一般情况不分裂，但在离体培养中，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，可转变成可分裂的转化细胞。
核型是指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。正常的核型能代表个体的核型。组型是以模式图的方式表示，它是通过多许多细胞染色体的测量取其平均值制成的，是理想的、模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
染色体的特征以中期最为显著，所以一般都都分析中期分裂相，根据染色体着丝粒位置的不同，可将染色体分为中部着丝粒染色体（m），亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝粒染色体（st），端部着丝粒染色体（t）。
对任何一个染色体的基本形态，重要参数有3个：
1.相对长度，指单个染色体长度与包括X与Y染色体在内的单倍染色体总长之比，用百分率表示。
2.臂指数，指长臂同短臂的比率。按Levan（1964）的划分标准，臂指数在1.0~1.7之间的称中部着丝粒染色体；臂指数在1.7~
3.0之间称亚中部着丝粒染色体；臂指数在3.0~7.0之间称亚端部着丝粒染色体；臂指数在大于7.0者称端部着丝粒染色体
3.着丝粒指数，指短臂占该染色体长度的比，用百分率表示。他决定着丝粒饿相对位置。按Levan（1964）的划分标准，着丝粒指数在50%~37.5%之间称中部着丝粒染色体；指数在
37.5%~25.0%之间称亚中部着丝粒染色体；指数在25.0%~12.5%之间称亚端部着丝粒染色体；指数在12.5%~0.0%之间者称端部着丝粒染色体。
正常人类染色体的数目为46条(23对，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22
号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。
表1 人染色体组型
组别
染色体
序号
形态
大小
着丝点位置随体次缢痕鉴别
难度
A 1~3 最大m 无常见1
号
可鉴定
B 4~5 次大sm无不
易
C 6~12X 中等sm无常
见9号
难鉴定
D 13~15 中等st有偶见13
号
难鉴定
E 16~18 较小16m，17m和
18sm 无常见16
号
可鉴
定
F 19~20 小m 无不
易
G21~22+Y最小st有
,Y无有难鉴
定
三、实验试剂与器材
（一）．试剂：
1.完全培养基RPMI-1640, 含小牛血清和双抗（抗菌素：青霉素：50000U/ml，链霉素：50000ug/ml，均用无菌生理盐水配制中的终浓度均为100 U/m）
2.肝素：抗凝剂（40ml生理盐水溶解粉末160mg（每mg含126单位U），配制成500U/ml）；
3.植物血球凝集素（PHA）：每毫升培养液加入100~200ugPHA粉剂。
4.50ug/ml秋水仙素:称取秋水仙素2mg，用40ml生理盐水溶解，过滤除菌分装，4℃保存。
5.低渗液：0.075mol/L KCL
6.Giemsa（姬姆萨）染液
7.1/15mol/LpH6.8的磷酸缓冲液。
8.Carnoy氏固定液。
（二）．器材：光学显微镜 1台，离心机 1台，恒温水浴箱 1台，恒温箱 1台，离心管3支，量筒2个，烧杯 2只，培养瓶3个，冷湿载玻片3张，碘酒和酒精棉球，酒精灯1台，天平 1台，普通冰箱 1台，染缸 1个、染色架 1个、镊子3个，直头小吸管 3支、橡皮吸头 3个、吸水纸若干，剪子 1个，胶水，6号针头注射器若干，标签纸，玻璃棒1个，PH试纸，比色卡。
四、实验方法
（一）培养液配制（在超静工作台内无菌操作）；
每个培养瓶（容积30ml）中加入5ml培养液，其中含：
RPMI1640 4ml
灭活小牛血清 1ml
PHA 2.5mg
青霉素 500ug
链霉素 500ug
依次将上述试剂加入培养瓶中，反复吹打使其混合均匀，用磷酸缓冲液调节培养基的pH值至7.0左右。
（二）采血、接种与培养：先以碘酒和75%乙醇消毒皮肤。用2ml灭菌注射器吸取约0.2ml （500u/ml）肝素,作静脉穿刺，抽取外周静脉血1~2ml。转动针筒以混匀肝素。
常规消毒后，立即将针头插入灭菌小瓶内，送入超净工作台，在火焰旁将血液滴入2～3个盛有5ml培养液的培养瓶内，每瓶0.2～0.3ml（6号针头45度倾斜，约20滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培养瓶放在37℃恒温箱内静置培养72h。（每天摇动培养瓶一次）
（三）秋水仙素处理:
向经恒温培养68小时的外周血淋巴细胞培养液中加入秋水仙素，使其终浓度为
0.2~0.5ug/ml,即每瓶（内装5ml培养基）中用6号针头倾斜45度角滴4滴，轻轻将液体摇匀，继续恒温培养2-3小时。
（四）标本的制备:
1、收集细胞：终止培养后，将培养物混匀，倒人离心管内，离心沉淀7分钟
(1000rpm/min，弃去上清液。
2、低渗处理：先加入1mL mol/L KCL溶液，轻轻吹打，使细胞重悬，然后补加
6mlKCL溶液，37℃水浴中低渗20min。
3、预固定：沿管壁慢慢加入1 m1新配的carnoy固定液进行预固定，轻轻吹打混匀，离心7分钟(1000rpm/min，去上清液。
4、固定：沿离心管壁缓慢加入固定液6m1，用吸管轻轻吹打，使细胞分散，固定
15min，离心去上清液。
5、重复第4步。
6、滴片：沉淀物中加入0.2~0.5ml固定液，用吸管吹打使其成为细胞悬液；用镊子取预先冰冻的干净载玻片上，迅速滴上2~3滴细胞悬液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热（或空气干燥）。
（四）染色：
滴有细胞悬液的载玻片放于染缸中（内有Giemsa染液）染色20min，自来水冲洗，吹干。
（五）镜检及染色体的组型分析：
1.在低倍镜下找到中期分裂相的细胞，转用高倍镜，选择染色体分散良好、长度适中、姐妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微拍摄。
2.将显微拍摄放大的照片上的一个细胞的全部染色体分别一条一条剪下。
3.根据染色体的长短和形态特征进行同源染色体的目测配对。
4.测量出每条染色体短臂和长臂长度，计算出各条染色体的相对长度、着丝粒指数、臂指数、记录原始数据。
5.根据测量数据校正目测配对排列结果，进行调整排列。
6.把染色体按一定顺序一对一对地排列，排列时注意短臂向上，长臂向下，性染色体单独排列，之后把染色体贴成一完整的染色体核型图。
7.翻拍。
五、实验结果
1、观察并记录自己制作的标本片中染色体的形态特征，计数10个细胞的染色体数。
2、剪贴男性、女性核型个一套。
3、实验报告
六、注意事项
1、由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。
2、接种的血样越新鲜越好，避免保存时间长影响细胞的活力。培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻震荡，使凝块散开，继续放回37℃恒温箱内培养，最好每天轻轻震荡混匀一次。
3、Giemsa染液PH值对着色效果有影响。
4、在采血接种培养是，不要加入太多的肝素。肝素太多可能引起溶血、抑制淋巴细胞的转化和分裂。
5、培养箱的温度应控制在37℃+0.5℃，温度过高或过低都会影响细胞的生长。
6、秋水仙素处理的浓度、时间离心的转速、低渗处理是影响染色体标本制备质量的关键因素。
7、PHA的质量是人体淋巴细胞培养的成败。
8、carnoy固定要要现用现配，固定要充分。
9、载玻片清洗要彻底和冷冻要充分。
10、滴片的高度要在60cm左右。