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小鼠卵母细胞的孤雌激活

小鼠卵母细胞的孤雌激活
小鼠卵母细胞的孤雌激活

卵母细胞的孤雌激活

将体外成熟卵母细胞(COCs要提前脱卵丘)分别用M2液及含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液洗3遍,然后将卵母细胞置于含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液中培养2.5小时,之后转入不含SrCl2的无糖CZB液中继续培养3.5小时,即在激活处理6小时后观察原核统计激活率。为了维持孤雌激活胚胎的二倍性,激活液和6小时检查原核前短期培养的培养液中均添加5μg/ml的CB。

激活的判定:2原核或2-细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活;卵质膜破裂者判断为死亡;胞质分裂一次或多次但不出现原核者判断为碎裂(fragmentation)。本实验将碎裂卵均归为未激活卵。对照组为未经激活处理,但与激活组培养相同时间的卵母细胞。每次实验,只有当对照组卵母细胞无一激活时,实验组数据才有效。

实验原理:利用氯化锶抑制第二极体的排出

实验用品:培养12小时并老化12小时,即24小时后的卵【要提前脱卵丘】,透明质酸酶,M2操作液,10摩尔每毫升的氯化锶,含钙CZB,

孤雌激活实验步骤

1,,第一天上午杀鼠取卵,培养卵。假设只有一个培养孔的卵,一个孔里最好有20至30个卵,留置第二天孤雌激活。

2,,第二天上午,算好时间,用紫外线照射两个培养孔,15分钟后加液,一个孔里放激活液,【激活液的组成是CB加氯化锶加无钙CZB】,

配置激活液的方法问师兄。另一个孔里放培养液【含钙的CZB】。3,注意激活液不能预热太长时间,CB热时间长会影响效果,【君佐师兄的加法是无钙CZB450微升加上氯化锶50微升平衡20分钟,然后加上氯化锶做滴平衡20分钟就可以放卵了】,在配置激活液时最后应该用枪打一打,好充分混匀。至于放培养液的孔可以以后考虑,激活需要6个小时。把握好时间,脱卵丘后就马上激活。同时预热上需要的药品,包括M2,含钙的CZB,再照上两个中平皿。

4,开始做时先用透明质酸酶处理培养的卵1至3分钟,脱卵丘。再用M2洗3至4遍,再用激活液洗3至4遍,再移入含有激活液的培养孔中。移入培养箱中激活6个小时。

5,假设上午9点做完,下午3点就可以观察。激活的判断方法是2原核或2细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活。卵质膜破裂者判断为死亡。胞质分裂一次或多次,但不出现原核者判断为碎裂,本实验将碎裂卵均归为未激活卵。

6,将激活成功的卵母细胞用含钙的CZB培养液洗5至6遍,再转移如含钙CZB的培养孔中培养,理论上48小时后就可以看到4细胞期,此时再转入含糖含钙CZB胚胎培养液中培养,即可以到达囊胚期。

甲氧滴滴涕对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

甲氧滴滴涕对小鼠卵母细胞体外成熟的影响【摘要】目的:观察甲氧滴滴涕(MXC)对小鼠卵母细胞体外成熟的影响. 方法:实验组小鼠未成熟卵用7.25, 14.5,29 mg/L MXC 不同浓度培养液培养;对照组小鼠未成熟卵直接用合成人输卵管培养液培养,两组培养时间均为24 h. 观察各组生发卵泡破裂(GVBD)和第一极体(PB1) 的形成, 出现PB1的卵母细胞视为核成熟. 结果:培养24 h时,卵母细胞GVBD发生率7.25 mg/L MXC组为80.4%,14.5 mg/L MXC组为78.8%,29 mg/L MXC组为78.4%,与对照组的86%相比较并没有明显改变. 培养过程中不同浓度MXC试验组GVBD发生较同期对照组相比较也没有明显延迟. 但在培养液培养24 h时PB1的排出率7.25 mg/L MXC组为52.8%,14.5 mg/L MXC组为44.4%,29 mg/L MXC组为22%,明显低于对照组的71.2%,差异具有统计学意义(P<0.05). 结论: MXC对体外培养的小鼠卵母细胞GVBD发生没有影响,但能抑制其卵母细胞的核成熟. 【关键词】甲氧氯;卵母细胞;体外研究; 细胞培养技术 【Abstract】AIM: To investigate the effect of Methoxychlor (MXC) on in vitro maturation of mouse oocytes. METHODS: The oocytes in experimental groups were cultured in hunan tubal fluid(HTF) medium supplemented with 7.25,14.5,29 mg/L MXC and the oocytes in the unexposed control group were

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用 杨彩荣 魏延昌张 岩郑可佳 李 宁严云勤* (东北农业大学动物细胞与发育生物学教研室,哈尔滨150030) 摘要哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin ,mTOR)是一种Ser/Thr 激酶,属于PIKK 超家族,对调节细 胞周期、蛋白质合成等具有重要作用,是细胞生长、增殖、分化、凋亡的中心调控器,但在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道.以小鼠卵母细胞为研究对象,采用免疫荧光为主要研究方法,对mTOR 在小鼠卵母细胞中的表达进行研究,并通过mTOR 的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin ,RAPA )对卵母细胞进行处理,对mTOR 在卵母细胞成熟过程中的作用进行研究.结果显示:小鼠卵母细胞成熟过程中,生发泡(germinal vesicle ,GV )期mTOR 主要集中在核膜处表达,生发泡破裂(germinal vesicle breakdown ,GVBD )后mTOR 伴随染色体分布,第二次减数分裂中期(second metaphase ,M Ⅱ期)mTOR 伴随纺锤体分布;雷帕霉素处理后,小鼠卵母细胞的成熟受到抑制,且这种抑制作用具有浓度依赖性,同时其mTOR 的表达部位和形态也发生变化.研究表明,在小鼠卵母细胞成熟过程中,mTOR 在各个时期的表达及分布具有阶段特异性,并对小鼠卵母细胞GVBD 的发生和第一极体的排放都具有重要作用. 关键词雷帕霉素靶蛋白(mTOR),小鼠卵母细胞,雷帕霉素,免疫荧光学科分类号 Q2 DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00446 生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biophysics 2009,36(10):1334~1339 https://www.doczj.com/doc/ed14387580.html, 研究报告 Research Papers *通讯联系人. Tel:0451-********,E-mail:yanyunqin@https://www.doczj.com/doc/ed14387580.html, 收稿日期:2009-07-23,接受日期:2009-09-04 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)结构与功能上高度保守,是一种存在于哺乳动物细胞中的Ser/Thr 激酶,属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinase ,PIKK)家族成员.mTOR 信号通路可以汇聚和整合来自于营养、生长因子、能量和环境胁迫对细胞的刺激信号[1~3],通过其下游的靶蛋白核糖体蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6kinase 1,S6K1)和蛋白质翻译起始因子eIF4E 结合蛋白1(eIF4E binding protein 1,4EBP1)调控蛋白质的翻译,加快细胞G1期/S 期的转换,促进细胞生长和增殖,抑制细胞凋亡[4~6].mTOR 信号通路紊乱与肿瘤的形成及细胞的恶性转化密切相关[7]. 雷帕霉素(rapamycin ,RAPA ,RPM)是一种大环内酯类抗生素和免疫抑制剂,它进入体内后与胞浆受体FKBP12结合形成复合物,此复合物能够结合在mTOR 蛋白羧基端的FRB 结构域内,形成三元复合物,使得mTOR 的激酶催化域失去接近并磷酸化下游靶蛋白的能力,从而抑制mTOR 的生物学功能[8~10]. mTOR 在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的研究较少,且大多集中在海星、海胆等动物中[11,12], 而在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道.以往的研究表明,mTOR 与一些蛋白质的合成有关[12],而特定蛋白质的合成对卵母细胞成熟具有重要的作用,因此我们推测,mTOR 可能在哺乳动物卵母细胞成熟过程中有重要作用.所以本研究以小鼠卵母细胞为研究对象,观察了mTOR 在卵母细胞成熟各个阶段的表达及分布情况,同时通过雷帕霉素的处理观察mTOR 对卵母细胞成熟的重要作用,为进一步探索mTOR 在小鼠卵母细胞成熟过程中的分子机制提供实验依据. 1材料与方法 1.1 实验材料 本实验选用昆明白品系6~8周龄性成熟雌鼠,购自哈尔滨肿瘤医院实验动物中心. 1.2 主要试剂 α-MEM 购自Gibco 公司;雷帕霉素购自江苏碧云天生物技术研究所;孕马血清(pregnant mare

猪卵母细胞体外成熟培养时间及去核方法的研究

猪卵母细胞体外成熟培养时间及去核方法的研究* 朱秀萍1,蒋伟娟2,艾晓杰1,徐动1,朱淑文1 1上海交通大学农业与生物学院,上海 (200240) 2上海市兽医卫生监督所,上海 (200335) E-mail:xpzhu@https://www.doczj.com/doc/ed14387580.html, 摘要:本研究对不同体外成熟培养时间的猪卵母细胞进行盲吸法去核及利用脱羧秋水仙碱(DC)和放线菌酮(CHX)的化学诱导法去核效率进行了比较研究。结果显示,用盲吸法去核,体外成熟培养(IVM)39-41h组卵母细胞去核率与IVM 36-38h组差异显著(P<0.05),与42-44h 组差异不明显(P>0.05),但三组显著高于IVM45-48h组(P<0.05)。化学诱导法去核结果表明,IVM 42-44h组去核率最高,但与IVM 39-41h组差异不显著(P>0.05),其他各组间均差异显著(P<0.05)。在相同的体外成熟培养时间内,盲吸法的去核率比化学诱导法的去核率要高。本实验证明:猪卵母细胞IVM在39-44h内去核率较高,且盲吸法去核效率高于化学诱导去核。 关键词:猪卵母细胞,盲吸法去核,化学诱导去核,去核率 中图分类号:Q 968.1 1 前言 近年来,体细胞核移植在多种哺乳动物获得成功,相继产生克隆羊、牛、小鼠、山羊、猪、猫、兔、骡子和大鼠,为生命科学、医学制药等诸多领域提供了一个崭新的研究手段。卵母细胞核物质的去除是克隆技术成败的关键环节之一,卵母细胞的体外成熟是决定克隆胚胎能否最终发育成正常个体的关键。去核效率的高低与卵母细胞所处的成熟时期及采用的去核方法有密切关系。因此掌握卵母细胞体外成熟时间,快速而准确的去核,对提高去核成功率有重要意义。 目前动物克隆中普遍使用是机械去核法(盲吸法),该方法对细胞的机械损伤较大、耗时、技术要求高。如何既能完全去掉卵母细胞的核,又不致对细胞造成更大的损伤是研究者们一直在探索的问题。“化学诱导去核法”去核首次建立于小鼠卵母细胞,用脱羰秋水仙碱(DC)处理激活的卵母细胞,使染色体和极体牢固结合,然后用诱导第二极体排出的放线菌酮(CHX)处理卵母细胞,成功得到克隆小鼠[1~3]。Yin等把该法也应用于猪卵母细胞的去核[4]。在我国,杜卫华等首次利用化学诱导去核法用于小鼠卵母细胞的去核研究[5],但对体外成熟培养的猪卵母细胞化学诱导去核研究目前国内尚未见报道。 本研究使用盲吸法和化学诱导去核对不同成熟培养时间的猪卵母细胞进行去核,旨在确定最佳的去核时间;建立猪卵母细胞化学诱导去核方法;同时,通过两种方法的去核效率的比较,为克隆技术研究中卵母细胞去核这一关键环节提供理论依据。 2 材料和方法 2.1 猪卵母细胞的采集 实验所用卵巢均来自于上海市闵行区纪王镇屠宰场屠宰的初情期前小母猪。将获取宰场屠废弃的猪卵巢,置于37℃灭菌生理盐水中,2h内送回实验室。以生理盐水清将卵巢洗两次 *本课题得到上海市科委国际交流项目(015407005)的资助。

孤雌激活

5.卵母细胞的孤雌激活 孤雌激活(parthenogenetic activation)是指处于第二次减数分裂中期的成熟卵母细胞不经过精子受精作用,而在某些理化因素的刺激下继续生长发育的过程,包括恢复并完成第二次减数分裂,发生卵裂形成早期胚胎。由雌性配子经孤雌激活产生后代的生殖过程称为孤雌生殖形成的胚胎称为孤雌胚胎。 5.1.卵母细胞激活机制 在受精时,一系列的细胞内Ca2+ 多次持续波动引起MPF的失活和卵母细胞的激活(Cuthbertson and Cobbold 1995; Collas et al. 1993; Swann and Ozil 1994)。在小鼠(Miyazaki et al. 1986, 1993; Whitaker and Swann 1993; Kline 1994; Igarashi er al. 1997) 、仓鼠(Igusa and Miyazaki 1983; Miyazaki et al. 1986, 1991)和兔(Collas et al. 1995)上都证实了卵母细胞在受精时伴随有Ca2+的波动,说明Ca2+波动是启动卵母细胞周期和继续发育的前提。卵母细胞激活是以Ca2+为第二信使,成熟促进因子(MPF)、细胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)、细胞静止因子(CSF)等细胞因子综合作用的结果。进行孤雌激活的卵母细胞是处于MII期的卵母细胞,其含有高活性的CSF,能维持MPF处于高活性状态,使卵母细胞处于减数分裂的中期(Rall J M 1992)。孤雌激活是通过各种物理、化学方法刺激MII期卵母细胞完成第二次减数分裂,阻止第二极体排出,形成常染色体二倍体胚胎(李裕强2001)。卵母细胞内Ca2+节律性脉冲的升高是卵母细胞完成孤雌发育不可缺少的过程(Hochi S 2000)。MII期的卵母细胞受精或人工激活后卵母细胞胞质Ca2+升高可使MPF和CSF失活或消失,从而启动成熟分裂器,促使M期卵母细胞继续第二次成熟分裂(Kline D 1988),并形成孤雌胚胎(Swann M 1999)。MPF是一种蛋白激酶,在卵母细胞的减数分裂过程中起关键的调控作用,可促进细胞进入M期,并在M期维持高活性状态,在M期的中后期活性迅速下降直到消失,使卵母细胞活化,完成第二次成熟分裂(李裕强等1999)。不同物理或化学方法对卵母细胞激活效果不同,但其激活机理基本是一致的,同激活方法的最终目的均是要将静止在MII期的卵母细胞恢复减数分裂周期,这就要求卵母细胞内MPF和CSF的活性降低或消失。而MPF的活性是由对Ca2+非常敏感的CSF来维持,CSF的作用是抑制停滞于MII期卵母细胞内的cyclinB的降解。卵母细胞受精或人工激活后,细胞内Ca2+浓度迅速升高,使CSF的活性消失,cyclinB被降解,从而引起MPF的活性降低或消失,卵母细胞离开MII期,完成减数分裂并进行卵裂。有研究表明,抑制卵母细胞内游离Ca2+浓度的升高就会抑制卵母细胞激活的一系列反应,Ca2+浓度的升高是卵母细胞激活的重要诱导信号,但并不是诱导卵母细胞激活一定需要Ca2+浓度的脉冲升高(邓满齐等1994)。放线菌酮(CHX)是一种蛋白质合成抑制剂,通过作用于80S的核糖体来抑制肽链的转移,从而抑制蛋白质合成,己经有实验证实,CHX可使小鼠和牛的卵母细胞发生孤雌激活(Presicce G A 1994a; Bos Mikich A et al. 1995; Sun Q Y et al. 1999a; Sun Q Y et al. 1999b) 。而不能使猪(Nussbaujm DJ 1995)和中国仓鼠(Tateno H 1997)卵母细胞激活。一般认为,乙醇、电脉冲和氯化锶的刺激可以导致卵母细胞的活化,而随后CHX协同作用进一步抑制卵内新的相关蛋白质,如cyclinB、CSF的合成,使其不能产生新CSF和MPF,使MPF一直处于较低水平,进一步促进卵母细胞的活化。单独的CHX作用不能使猪IVM卵母细胞活化,说明猪卵母细胞对CHX不敏感,只有与其他刺激因素联合使用时,才能起到协同促进的作用。这也说明,CHX不是通过Ca2+波引起的卵母细胞活化,而是通过抑制有关蛋白质合成起作用。此外,6-DMAP是一种蛋白质磷酸化抑制剂。卵母细胞成熟和受精均涉及到多种蛋白质磷酸化状态的改变。6-DMAP对卵母细胞的激活作用主要是维持P34cdc2的磷酸化和抑制cyclinB的磷酸化使MPF活性下降。同时还可以抑制纺锤体形成时微管蛋白的磷酸化抑制极体的排出。但6-DMAP单独使用对卵母细胞的激活作用较弱,一般要与适度的能引起Ca2+波动的其他激活因子协同作用方可使卵母细胞充分激活(刘贞伟2004)。

卵母细胞的核相

卵母细胞的核相分为:待成熟受抑制状态的生发泡(Germinalvesicle,GV)期(根据发育程度进一步细分为GⅥ期-GVⅣ期)、进入成熟状态的生发泡破裂(Germinalvesiclebreakdown,GVBD)和之后的减数分裂(Meiosis,M)期(分为MⅠ期和MⅡ期,MⅠ进一步细分为中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ)。 生发泡破裂是卵细胞发育过程中的一步,它标志着卵细胞的成熟,此时卵细胞由GV 期(germinal vesicle)进入GVBD期(germinal vesicle breakdown)。[1]主要特征是染色质高度凝集,核仁消失,核膜破裂,卵母细胞将从M1期进入M2期,排出第一极体达到成熟状态。 GV期特征:GV期卵母细胞是卵原细胞成为初级卵母细胞之后,经细线期、偶线期、粗线期发育到双线期。在双线期后期,卵母细胞的核很大,染色质高度疏松,外包完整的核膜,此时的细胞核又称GV M1期特征:染色体浓缩成清楚的单体,并整齐的排列在赤道板上。 后期1:染色体向卵子两极移动,有些可隐约看到纺锤体。 末期1:课件两团染色体存在,并未完全分离。 M2期:卵周隙中见到第一极体排出,另一团染色体呈分散状态。 众所周知, 卵泡的发育经历了始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡、排卵前卵泡阶段。初级卵泡阶段, 卵母细胞周围开始围绕一层颗粒细胞, 颗粒细胞供给卵母细胞生长发育所需的85%的营养[6]。随后, 颗粒细胞开始出现突起, 卵母细胞也出现微绒毛, 两者之间以桥粒和缝隙连接相连, 很快卵母细胞产生一层富含糖蛋白的物质形成透明带。发展到窦状卵泡阶段, 颗粒细胞增殖到6~12层, 窦腔形成, 颗粒细胞开始分化为功能及解剖上不尽相同的2 类细胞: 壁层颗粒细胞(granulosa cells,GCs)和卵丘细胞(cumulus cells, CCs)卵泡中的缝隙连接使GCs、CCs 与卵母细胞共同形成一个结构和功能上的合胞体。 卵细胞胞质中游离钙的升高时受精过程中启动卵子激活的一个重要因素 卵受精之前,代谢水平很低,无DNA的合成活动,RNA和蛋白质的合成都极少。因此排出的卵子,如果未受精,很快就夭折。当精子与卵子表面融合时,卵子的代谢速率迅速提高,并开始合成DNA。有关卵子激活的详细机理还不清楚,只知精子仅起到打开程序开关的作用。除了精子,一些其他非专一的化学的或物理的处理,也能使卵激活,例如针刺蛙卵,也能使之激动。激动的起始无需任何新蛋白质的合成。 排卵期成熟的卵细胞由卵巢排出﹐进入输卵管的壶腹部﹐此时宫颈粘液稀薄﹐适宜精子进入。性交时﹐精液射到阴道后穹窿﹐部分精子通过宫颈管﹑宫腔﹑输卵管口﹐到输卵管峡部与壶腹部交界处。穿进卵细胞前必须经过形态﹑生理及生物化学的变化﹐称为精子获能﹐获能后的精子头部入卵细胞﹐尾部留在卵细胞外(精子的头部几乎不含细胞质,所以受精卵的细胞质遗传物质可认为全部来自卵子,称为细胞质遗传)﹐精子与卵细胞融合成为一个新的合体细胞﹐此过程称为受精。已受精的卵细胞称为受精卵或孕卵。人类的孕卵含有46个染色体(来自父母的各23个)。

1动物胚胎工程实验教程小鼠卵的体外成熟与体外受精材料与方法

《动物胚胎工程实验教程》 王子玉自编 南京农业大学动科院 2005年8月

实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验 一、实验目的 熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点;掌握小鼠的超数排卵方案;掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。 二、实验器材和材料 1. 器材及药品 体视显微镜,手术器械(眼科剪,眼科镊),1mL注射器,胶头滴管,口吸管,CO2培养箱,水浴锅,移液器,枪头,塑料培养皿,记号笔。 操作液(M2),成熟培养液(M-199),激素(PMSG和HCG),石蜡油。 2.实验动物: 3-4周龄昆明系雌性小白鼠,自由采食饮水。 三、实验内容 1.小鼠的超数排卵 注射剂量皮下或腹腔注射PMSG 10 IU/只小鼠。 注射方法 皮下注射:用手指捏住小鼠的头及尾部固定(图1-1),以酒精棉球消毒其背部,提起皮肤,将注射针头平插刺入皮下,将针头微向上挑起不露出针尖时,再注入药物。随着药物的推入,在皮下可看到鼓起一个小泡,即证实药物确已注入皮下部位。皮下注射时防止药液从针孔处逸出。 腹腔注射:针头刚进入腹腔后向上挑,防止损伤小鼠腹腔内器官。注射针头宜选用小号细针头。注射药物后的小鼠自由饮水、采饲,自然光照。 2.卵巢的采集方法 在注射PMSG后46h利用颈椎脱臼法处死小鼠(将供体鼠置于饲养笼上,鼠爪自然抓紧笼上铁支架,此时一只手拉紧鼠尾,另一只手食指与拇指压紧鼠颈部,或用镊子压紧颈部即可致死,此为引颈法。用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬)。将小鼠头部固定,用力牵拉鼠尾,可感到颈椎部位脱臼的振动;也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上。

小鼠卵母细胞的孤雌激活

卵母细胞的孤雌激活 将体外成熟卵母细胞(COCs要提前脱卵丘)分别用M2液及含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液洗3遍,然后将卵母细胞置于含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液中培养2.5小时,之后转入不含SrCl2的无糖CZB液中继续培养3.5小时,即在激活处理6小时后观察原核统计激活率。为了维持孤雌激活胚胎的二倍性,激活液和6小时检查原核前短期培养的培养液中均添加5μg/ml的CB。 激活的判定:2原核或2-细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活;卵质膜破裂者判断为死亡;胞质分裂一次或多次但不出现原核者判断为碎裂(fragmentation)。本实验将碎裂卵均归为未激活卵。对照组为未经激活处理,但与激活组培养相同时间的卵母细胞。每次实验,只有当对照组卵母细胞无一激活时,实验组数据才有效。 实验原理:利用氯化锶抑制第二极体的排出 实验用品:培养12小时并老化12小时,即24小时后的卵【要提前脱卵丘】,透明质酸酶,M2操作液,10摩尔每毫升的氯化锶,含钙CZB, 孤雌激活实验步骤 1,,第一天上午杀鼠取卵,培养卵。假设只有一个培养孔的卵,一个孔里最好有20至30个卵,留置第二天孤雌激活。 2,,第二天上午,算好时间,用紫外线照射两个培养孔,15分钟后加液,一个孔里放激活液,【激活液的组成是CB加氯化锶加无钙CZB】,

配置激活液的方法问师兄。另一个孔里放培养液【含钙的CZB】。3,注意激活液不能预热太长时间,CB热时间长会影响效果,【君佐师兄的加法是无钙CZB450微升加上氯化锶50微升平衡20分钟,然后加上氯化锶做滴平衡20分钟就可以放卵了】,在配置激活液时最后应该用枪打一打,好充分混匀。至于放培养液的孔可以以后考虑,激活需要6个小时。把握好时间,脱卵丘后就马上激活。同时预热上需要的药品,包括M2,含钙的CZB,再照上两个中平皿。 4,开始做时先用透明质酸酶处理培养的卵1至3分钟,脱卵丘。再用M2洗3至4遍,再用激活液洗3至4遍,再移入含有激活液的培养孔中。移入培养箱中激活6个小时。 5,假设上午9点做完,下午3点就可以观察。激活的判断方法是2原核或2细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活。卵质膜破裂者判断为死亡。胞质分裂一次或多次,但不出现原核者判断为碎裂,本实验将碎裂卵均归为未激活卵。 6,将激活成功的卵母细胞用含钙的CZB培养液洗5至6遍,再转移如含钙CZB的培养孔中培养,理论上48小时后就可以看到4细胞期,此时再转入含糖含钙CZB胚胎培养液中培养,即可以到达囊胚期。

卵细胞成熟过程

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 卵子发生 原始卵泡 初级生长卵泡 次级生长卵泡 成熟中的卵泡 成熟卵泡(滤泡)和成熟卵 卵母细胞和卵泡细胞的关系 卵的结构 细胞核 染色体 核仁 细胞质 色素 皮层颗粒 环层板 卵黄 卵的类型 卵膜 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 动物成熟的雌性生殖细胞,亦称卵子。一般呈球形或椭球形,较大,多不能活动。它除具有一般细胞所共有的细胞核、细胞质、细胞器和质膜外,还有一些专供受精后发育所需的营养物质。以哺乳类为例,性成熟后,在神经和激素调控下自卵巢中排出的成熟卵,其外有透明带和放射冠包围,在透明带和质膜之间为充满液体的卵周隙(图1)。 卵(动物) 卵子发生

在性成熟之前卵巢皮层中有相当数量的卵原细胞。卵原细胞是在胚胎时期原始生殖细胞迁移到生殖嵴内分裂繁殖而产生的。卵原细胞之间存在着细胞间桥,所以发育的同步化程度较高。但同步化只限于这一时期,卵原细胞转变为初级卵母细胞时,细胞间桥消失,彼此分开,这点与精子发生不同。哺乳类在胎儿出生前或出生后不久,卵原细胞全部发育为初级卵母细胞。在个体性成熟之前初级卵母细胞不生长。性成熟后卵巢皮层中的、被卵泡细胞包围着的初级卵母细胞在激素刺激下生长,细胞核进行DNA复制,然后进入成熟分裂的前期变化。生长到一定的体积后,初级卵母细胞进行第一次成熟分裂,产生一个次级卵母细胞和第一极体;次级卵母细胞再进行第二次成熟分裂,产生卵子和第二极体。这些变化都是在卵泡中进行的(图2)。卵子和卵泡的发育大致可以划分为: 卵(动物) 原始卵泡尚未开始发育的卵泡,位于卵巢的皮层,由一个卵原细胞和外围一层扁平的卵泡细胞组成,数量很多,但在各类动物中差别很大。 初级生长卵泡卵泡细胞由扁平变为立方形,从一层增殖为几层,卵母细胞也开始增大,细胞核发生一系列成熟分裂前期的变化,产生大量核液,形似球状;在卵母细胞周围开始出现透明带。在透明带中有从卵母细胞和卵泡细胞的表面伸出的微绒毛,它们相互接触,构成卵泡细胞给卵母细胞输送物质的通道。 次级生长卵泡卵泡不断增大,外围的卵泡细胞有几层到十几层,在卵泡细胞之间出现充满透明液体的不规则腔隙,其中的液体即卵泡液。这时卵母细胞也长到最大的体积,并为一层较厚的透明带所包裹。 成熟中的卵泡卵原细胞过渡到卵母细胞,已长到最大体积,并准备成熟分裂;它周围的腔隙逐渐合并越来越大,卵泡仍可继续生长。 成熟卵泡(滤泡)和成熟卵此时体积到达最大限度。初级卵母细胞渐位于卵泡一侧,向腔内突出,仍为卵泡细胞包围,此即卵丘。人的卵泡直径可达1厘米,并从卵巢表面突出。卵泡中的卵母细胞已完成第一次成熟分裂并停止于第2次成熟分裂的中期,等待排卵(图3)。

辅助生殖用穿刺取卵针注册技术审查指导原则

附件6 辅助生殖用穿刺取卵针注册技术 审查指导原则 本指导原则旨在为注册申请人进行辅助生殖用穿刺取卵针类医疗器械产品注册申报提供参考,同时也为审评机构对注册申报资料的技术审评提供技术指导。 本指导原则系对辅助生殖用穿刺取卵针类医疗器械产品的一般要求,注册申请人应依据具体产品的特性对注册申报资料的内容进行充实和细化,并依据具体产品的特性确定其中的具体内容是否适用,若不适用,需详细阐述理由及相应的科学依据。 本指导原则是对注册申请人/生产企业和审评人员的技术指导性文件,不包括注册审批所涉及的行政事项,亦不作为法规强制执行。如果有其他科学合理的替代方法,也可以采用,但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规和标准的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的,随着法规和标准的不断完善,以及科学技术的不断发展,本指导原则相关内容也将进行适时的调整。 一、适用范围 本指导原则所涉及的辅助生殖用穿刺取卵针,是指在体外受精-胚胎移植及其衍生技术操作过程中,用于穿刺卵巢中卵泡以获取卵母细胞的专用器械。 本指导原则不适用于卵巢穿刺活检针。

二、注册申报资料要求 (一)综述资料 1.概述 描述申报产品的管理类别、分类编码及名称的确定依据。该产品按第二类医疗器械管理,属于《医疗器械分类目录》(国家食品药品监督管理总局令第19号)中18妇产科、辅助生殖和避孕器械目录下的07辅助生殖器械项下的02穿刺取卵针。 2.产品描述 产品描述应全面、详细,提供产品预期与人体、卵细胞接触的情况,包括接触部位、接触方式、接触时间,提供预期最长接触时间的确定依据及其支持资料。说明与该产品配合使用的产品如负压吸引装置。 产品描述应包括申报产品名称、产品原材料、结构、预期用途、技术性能指标及其制定依据。必要时提供结构图示及说明。穿刺取卵针可分为单腔穿刺取卵针和双腔穿刺取卵针,通常情况下一套完整的穿刺取卵针包括:穿刺针保护套、穿刺针、手柄、内圆锥接头、吸引导管、硅胶塞、真空导管、冲洗导管(双腔穿刺取卵针适用)等。 3.规格型号 对于存在多种型号规格的产品,说明产品的规格型号及划分依据、明确各规格型号的区别。可采用对比表对不同规格型号的结构组成、性能指标加以描述。 4.包装说明 参考GB/T19633系列标准,提供与灭菌方法相适应的最初包装的信息。初包装对穿刺取卵针弯折性能的影响应予以考虑。

高中生物人教版 必修2 第2章 第1节 减数分裂和受精作用 卵细胞的形成过程(I)卷

高中生物人教版必修2 第2章第1节减数分裂和受精作用卵细胞的形成过程(I) 卷 姓名:________ 班级:________ 成绩:________ 一、单选题 (共12题;共24分) 1. (2分) (2019高一下·江门月考) 下列关于同源染色体和四分体“一定”的叙述,正确的是() A . 同源染色体在细胞分裂过程中一定能够配对 B . 含有四条姐妹染色单体的一定是四分体 C . 一个四分体一定是一对同源染色体 D . 一对同源染色体一定是一个四分体 【考点】 2. (2分)(2019·浙江会考) 图①~④表示人类精子产生过程中染色体的部分行为。下列叙述错误的是() A . 图中各行为出现的先后顺序是①③②④ B . 图①中的交叉现象在精子产生过程中常有发生 C . 图③所示行为发生的同时,非同源染色体自由组合 D . 发生图④所示行为的细胞是初级精母细胞 【考点】 3. (2分) (2017高一下·成都期中) 下列说法正确的是()

A . 研究两对相对性状时,每一对相对性状的遗传都遵循分离定律,那么两对之间就一定遵循自由组合定律 B . 某奶牛的一个精原细胞,减数分裂后可能产生4种或2种精子 C . 子代性状的多样性导致的原因只与配子形成时的多样性有关 D . 某生物测交后代只有两种表现型,则该生物一定只含一对等位基因 【考点】 4. (2分) (2015高二上·余杭期末) 图表示细胞分裂和受精作用过程中,核DNA含量和染色体数目的变化,据图分析,正确的是() A . a表示有丝分裂,b表示减数分裂,c表示受精作用和有丝分裂 B . DE、HI和PQ段均发生了着丝粒分裂 C . GH段和OP段的细胞中含有的染色体数目是相等的 D . MN段和AB段的细胞中核DNA含量相同 【考点】 5. (2分)同一生物细胞分裂图解,在动物卵巢中见不到的是() A .

小鼠体外受精标准化程序

小鼠体外受精标准化程序 雌鼠(8-10周龄)体外促排卵: 1.4点左右腹腔注射尿促性素针剂(10U/只),; 2.48hr后腹腔注射绒促性素针剂(10U/只); 培养液预平衡: 雌鼠注射绒促的当天,准备如下液体 1.Quinn’s 1023(HEPES-HTF培养基):使用时添加10%SPS,共 5ml; 2.Quinn’s 1020:使用时添加10%SPS,共5ml; 3.Quinn’s 1026:使用时添加10%SPS,共2ml; 以上液体配置后,HEPES-HTF培养基需要拧紧离心管口,Quinn’s 1020与Quinn’s 1026则半旋口,均放置于CO2培养箱内,孵育过夜。 卵子的获得: 1. 前准备:用昨日预平衡的10%SPS Quinn’s 1020做四个微滴的三个培养皿,盖油,置于CO2培养箱内,孵育备用; 2. 于超净台中,取昨日预平衡的10%SPS Quinn’s 1023液2-3ml与35mm的平皿中; 3. 用颈椎脱臼法处死促排卵雌鼠,取其卵巢及输卵管于上述平皿中; 4. 在解剖显微镜下,用1ml空针剖开小鼠输卵管的壶腹部,即见粘附有大量颗粒细胞的卵子粘液团流出,用拉过的巴斯德吸管吸取置于预先孵育的10%SPS Quinn’s 1020微滴中; 5. 反复冲洗2-3次后,将卵子转入新鲜的10%SPS Quinn’s 1020微

滴中孵育。 精子的获得: 1.于超净台中,取昨日预平衡的10%SPS Quinn’s 1023液2-3ml与 35mm的平皿中; 2.用颈椎脱臼法处死雄鼠,取其附睾上体尾部,除去脂肪与血迹后, 置于上述平皿中; 3.在解剖显微镜下,用1ml空针剖开附睾上体尾部,稍加震荡后即 见成团精子游出; 4.用拉过的巴斯德吸管吸取后轻轻加入到含2ml 10%SPS Quinn’s 1020液的离心管底部,放入CO2培养箱内使精子上游15-25min; 5.吸取上游液于另一离心管中,室温3000rpm离心15min; 6.小心吸取沉淀,加入到另一含1ml 10%SPS Quinn’s 1020液的圆 底管中,混匀,置于CO2培养箱内备用。 体外受精: 1. 用处理过的精液做几个50μl左右的微滴,盖油,吸取各卵子粘液团分别放置于各微滴中,置于CO2培养箱内受精5-6hr; 胚胎培养: 1. 前准备:用昨日预平衡的10%SPS Quinn’s 1026做10-15个微滴,盖油,置于CO2培养箱内,孵育备用; 2. 用拉过的巴斯德吸管分别吸取受精卵,于新鲜的10%SPS Quinn’s 1020微滴中反复吹打数次后,转入预平衡的10%SPS Quinn’s 1026微滴中,培养并观察分裂情况;

大鼠体外受精技术研究进展

大鼠体外受精技术研究进展 张春燕1, 2,刘丽均2,徐平2,芮荣1* 1南京农业大学动物医学院,南京210095; 2中国科学院上海实验动物中心,上海201615 摘要:目前,体外受精技术在多种哺乳动物已取得成功并获得广泛应用。大鼠由于其本身的特殊性,体外受精及随后的胚胎培养一直比较困难,国内关于大鼠体外受精方面的研究更是少有报道。文章主要从卵母细胞体外培养、精子获能、受精、受精卵体外培养及胚胎移植等方面着手,对国外大鼠体外受精的研究现状作一简要综述。 关键词:大鼠;体外受精;胚胎培养;胚胎移植 体外受精(IVF)是指在体外环境完成精卵结合的过程。体外受精研究的深入开展,不仅加深了人们对受精机制的认识,也为动物繁育、治疗人类不孕症提供了有力的手段。目前,该项技术在小鼠、兔、山羊、猪和牛等动物及人类已日趋成熟,并得到广泛应用;但在国内少有大鼠体外受精的报道。现将该领域的研究现状作一综述,以供参考。 1. 大鼠体外受精研究简史 事实上,大鼠是较早用于体外受精研究的实验动物之一。早在1968年,Toyoda 和Chang 就开始了大鼠体外受精技术的研究,但只能使去除透明带的卵子和精子在体外受精[1]。1973年,Miyamoto和Chang利用从交配雌鼠子宫内收集的精子进行体外受精时发现,子宫内收集的精子可以使透明带完整的卵子受精[2]。从而用实验证明,以前的体外受精之所以不成功,关键是精子在体外培养时没有获能,不具备穿过透明带使卵子受精的能力。1974年,Toyoda 等研制出适合于大鼠精子体外获能的培养液,由此逐步建立起大鼠体外受精技术[3]。 近年来,研究者在精子获能液、胚胎培养液及提高体外受精胚胎质量方面做了大量研究,目的是尽量模拟体内受精和胚胎发育环境,探索大鼠体外受精的最适条件,以提高其胚胎体外生产效率。 2. 研究方法及进展 完整的体外受精技术包括:卵母细胞的体外成熟(IVM);精子获能;体外受精;早期胚胎培养和移植。而胚胎移植结果仍是鉴定体外受精胚胎质量的最有效证据。 2.1 卵母细胞的来源与体外成熟 2.1.1收集卵巢未成熟卵母细胞 哺乳动物的卵巢上有大量未成熟、处于不同发育阶段的卵母细胞,这部分卵母细胞需经IVM培养后,方可用于体外受精。获得卵巢卵母细胞的方法主要有两种:(1)机械分离法-利用穿刺针将卵巢表面的卵泡刺破,释放出卵母细胞;或是采用切割法,将整个卵巢切碎后收集卵母细胞。穿刺法采卵数量少,切割法获卵数较多,但切割法会产生更多裸卵或造成卵丘细胞损伤。(2)胶原酶消化法-该方法主要用于腔前卵泡卵母细胞的分离。 大鼠大卵泡(直径>350um)卵母细胞的体外培养,通常使用含15%灭活血清的MEM (Eagle’s Minimum Essential Medium)作为培养液,培养12 h后检查成熟发育情况,以生发泡破裂或第一极体排出作为成熟的判断标准。 *通讯作者,Email:rrui@https://www.doczj.com/doc/ed14387580.html,。

小鼠胚胎培养方法的探究

小鼠胚胎培养方法的研究 摘要 目的:探讨小鼠早期胚胎在不同的体外培养液中生长发育的状况,从而寻找胚胎培养的最佳培养体系,为人类胚胎培养方法的改善提供理论依据,以提高临床体外受精一胚胎移植(IVF.ET)的成功率。 方法:配制不同的培养液,对100例小鼠超排卵共取卵子1678枚,分别在不同的培养液中进行体外授精,并将2一细胞鼠胚放入各组培养液中进行培养,其中,血清组的培养液为Earle培养液加10%人血清:卵泡液组的培养液为Earle培养液加lO%人卵泡液;蜕膜细胞条件培养液组的培养液为Earle培养液加lO%条件培养液:血清加卵泡液组的培养液为Earle培养液加10%人血清和5%人卵泡液:血清加条件培养液组为Earle培养液加10%人血清和5%条件培养液。每日在显微镜下观察小鼠胚胎的发育情况,分析受精率、卵

山西医科大掌 裂率、卵裂速度及桑椹胚与囊胚形成率,采用x2分割检验进行统计分析。 结果: 一、1、小鼠胚胎在蜕膜细胞条件培养液中有72.9%发育到8.细胞期,66.0%发育到桑椹胚,61.6%形成囊胚,32.1%胚胎孵化。而对照组有43.6%发育到8.细胞期,30.9%发育到桑椹胚,19.1%到初级囊胚,55%孵化的胚胎。两组比较有显著性差异。2、卵泡液的胚胎有71.3%到8.细胞期,588%发育到桑椹胚,50.O%形成囊胚,257%孵化。与对照组比较有差显著性异。3、血清组有53,4%发育到8.细胞期,40.5%到桑椹胚,29.3%形成囊胚,仅有7.8%孵化。与对照组无显著性差异。 二、鼠卵在不同培养液中受精率无显著性差别,而对于卵裂率和优质胚胎的形成率,鼠卯在蜕膜细胞条件培养液组和卵泡液组中均与对照组有显著性差异,而血清组与对照组比较无差异。鼠胚在蜕膜细胞条件培养液和卵泡液中培养发育速度快,碎片率明显低于对照者。 三、小鼠早期胚胎在卵泡液组、蜕膜细胞条件培养液组

鼠胚实验在新建体外受精胚胎培养室质量控制中的作用_王辉田

文章编号:1003-6946(2015)02-115-05 鼠胚实验在新建体外受精胚胎培养室质量控制中的作用 王辉田,李涛,黎伟豪,欧建平 (中山大学附属第三医院生殖医学中心,广东广州510630) 【摘要】目的:检测新建体外受精实验室培养体系的可靠与否,是否符合人类胚胎体外培养的要求。方法:对昆明白小鼠进行超促排卵,手术获取昆明白小鼠雌雄配子进行体外受精和体内受精的胚胎;并进行体外培养观察两组鼠胚的受精率、2-细胞率、囊胚率及采用密度梯度离心法和上游法两种精液处理方法对小鼠体外受精胚胎发育情况的影响。结果:进行了30个周期的体内受精体外培养实验,共获卵1136枚;进行了35个周期的体外受精实验,共获卵1486枚。体内受精组获得的受精率(93.13?1.46)%和2-细胞率(94.52?1.67)%高于体外受精组的受精率(84.39?2.87)%和2-细胞率(87.80?3.21)%,两组间差异有统计学意义(P<0.05)。密度梯度离心法处理精液后,其受精率(90.32?3.14)%和2-细胞率(88.54?2.28)%高于上游法的受精率(76.46?2.35)%和2-细胞率(82.67?2.62)%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论:小鼠卵母细胞体内受精和体外受精后均有高的成胚率,体内受精后进行体外培养优于体外受精后培养,采用密度梯度离心处理精液实施体外受精优于上游法,鼠胚实验可对新建胚胎培养室的培养体系进行评估。 【关键词】鼠胚实验;体外受精;质量控制;胚胎培养 中图分类号:R332文献标志码:A 通讯作者:欧建平,Email:oujianping@hotmail.com 于被患者接受。操作简便、设备要求相对较低,具备超声介入条件的基层医院均可以推广。 研究认为,聚桂醇注射液主要是使绒毛附着处肌层血管闭塞,故主要适用于病灶累及肌层,子宫肌层连续性尚存在的CSP患者[9]。CSP处肌层菲薄,行B 超监护下胚囊清除术联合清宫术,可将不可视的清宫术变为相对可视的,减少子宫穿孔及残留。 本技术开展时间尚短,查阅文献联盟(万方数据库),国内外尚未见聚桂醇硬化剂广泛用于CSP治疗的报道。尚有诸多问题值得进一步探讨:瘢痕部位血供恢复情况,聚桂醇使用的最高剂量、最佳浓度,胚囊清除术联合清宫术的最佳时机,再次妊娠时子宫下段的伸展情况等尚需进一步随访观察。但超声介入下注入聚桂醇硬化剂治疗CSP成功率高,未出现明显副反应以及并发症,符合CSP治疗的原则,即最大限度地保留了女性的生育功能,不失为临床治疗CSP的又一适合部分女性患者和疗效满意的治疗方案,可供借鉴。 参考文献 [1]张淑珍,童水娟,寿坚.超声介入下注射硬化剂治疗剖宫产子 宫切口妊娠10例初探[J].现代实用医学,2014,26(3):274- 275. [2]徐栋,李明奎,徐佳英,等.超声造影指导下聚桂醇硬化治疗子宫切口妊娠的临床价值[J].中国超声影像学杂志,2014,23(2): 162-164. [3]蔡薇,杨太珠,罗红,等.剖宫产后瘢痕处妊娠经阴道超声图像分析的临床意义[J].实用妇产科杂志,2009,25(10):622- 624. [4]郑艳,徐春丽.聚桂醇400临床应用进展[J].药学进展,2012,31(2):190-192. [5]邓新粮,何小丽,肖松舒.剖宫产术后子宫切口部位妊娠保守治疗16例疗效分析[J].实用妇产科杂志,2008,24(6):372-373.[6]陈春林主编.妇产科放射介入治疗学[M].北京:人民卫生出版社,2003:393-395. [7]邵华江,马建婷,徐丽萍.剖宫产瘢痕妊娠治疗方法与疗效综合分析[J].中华医学杂志,2012,92(31):2191-2194. [8]汪芳,石珍,朱亚飞,等.高强度聚焦超声治疗子宫切口妊娠临床分析[J].中国超声医学杂志,2013,29(2):177-179. [9]倪雪君,谢阳桂,吴超,等.超声引导下瘤内注射聚桂醇硬化治疗子宫肌瘤的临床研究[J].南通大学学报(医学版),2012,32 (5):414-415,封2. (收稿日期:2014-10-12;修回日期:2014-12-15)

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