哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用
杨彩荣
魏延昌张
岩郑可佳
李
宁严云勤*
(东北农业大学动物细胞与发育生物学教研室，哈尔滨150030)
摘要哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin ，mTOR)是一种Ser/Thr 激酶，属于PIKK 超家族，对调节细
胞周期、蛋白质合成等具有重要作用，是细胞生长、增殖、分化、凋亡的中心调控器，但在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以小鼠卵母细胞为研究对象，采用免疫荧光为主要研究方法，对mTOR 在小鼠卵母细胞中的表达进行研究，并通过mTOR 的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin ，RAPA )对卵母细胞进行处理，对mTOR 在卵母细胞成熟过程中的作用进行研究．结果显示：小鼠卵母细胞成熟过程中，生发泡(germinal vesicle ，GV )期mTOR 主要集中在核膜处表达，生发泡破裂(germinal vesicle breakdown ，GVBD )后mTOR 伴随染色体分布，第二次减数分裂中期(second metaphase ，M Ⅱ期)mTOR 伴随纺锤体分布；雷帕霉素处理后，小鼠卵母细胞的成熟受到抑制，且这种抑制作用具有浓度依赖性，同时其mTOR 的表达部位和形态也发生变化．研究表明，在小鼠卵母细胞成熟过程中，mTOR 在各个时期的表达及分布具有阶段特异性，并对小鼠卵母细胞GVBD 的发生和第一极体的排放都具有重要作用．
关键词雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，小鼠卵母细胞，雷帕霉素，免疫荧光学科分类号
Q2
DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00446
生物化学与生物物理进展
Progress in Biochemistry and Biophysics 2009,36(10):1334~1339
https://www.doczj.com/doc/0514585154.html,
研究报告
Research Papers *通讯联系人.
Tel:0451-********,E-mail:yanyunqin@https://www.doczj.com/doc/0514585154.html, 收稿日期：2009-07-23，接受日期：2009-09-04
雷帕霉素靶蛋白(mTOR)结构与功能上高度保守，是一种存在于哺乳动物细胞中的Ser/Thr 激酶，属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinase ，PIKK)家族成员．mTOR 信号通路可以汇聚和整合来自于营养、生长因子、能量和环境胁迫对细胞的刺激信号[1～3]，通过其下游的靶蛋白核糖体蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6kinase 1，S6K1)和蛋白质翻译起始因子eIF4E 结合蛋白1(eIF4E binding protein 1,4EBP1)调控蛋白质的翻译，加快细胞G1期/S 期的转换，促进细胞生长和增殖，抑制细胞凋亡[4～6]．mTOR 信号通路紊乱与肿瘤的形成及细胞的恶性转化密切相关[7]．
雷帕霉素(rapamycin ，RAPA ，RPM)是一种大环内酯类抗生素和免疫抑制剂，它进入体内后与胞浆受体FKBP12结合形成复合物，此复合物能够结合在mTOR 蛋白羧基端的FRB 结构域内，形成三元复合物，使得mTOR 的激酶催化域失去接近并磷酸化下游靶蛋白的能力，从而抑制mTOR 的生物学功能[8～10]．
mTOR 在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的研究较少，且大多集中在海星、海胆等动物中[11,12]，
而在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以往的研究表明，mTOR 与一些蛋白质的合成有关[12]，而特定蛋白质的合成对卵母细胞成熟具有重要的作用，因此我们推测，mTOR 可能在哺乳动物卵母细胞成熟过程中有重要作用．所以本研究以小鼠卵母细胞为研究对象，观察了mTOR 在卵母细胞成熟各个阶段的表达及分布情况，同时通过雷帕霉素的处理观察mTOR 对卵母细胞成熟的重要作用，为进一步探索mTOR 在小鼠卵母细胞成熟过程中的分子机制提供实验依据．
1材料与方法
1．1
实验材料
本实验选用昆明白品系6～8周龄性成熟雌鼠，购自哈尔滨肿瘤医院实验动物中心．
1．2
主要试剂
α-MEM 购自Gibco 公司；雷帕霉素购自江苏碧云天生物技术研究所；孕马血清(pregnant mare
杨彩荣等：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用
2009;36(10)serum gonadotropin,PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)购自天津市华孚高新生物技术公司；FRAP 抗体购自Santa Cruz 公司；异硫氰酸荧光素(FITC)由Santa Cruz ．Biotechnologe,Inc.生产；荧光染料DAPI 购自Sigma 公司；培养用试剂均为Sigma 公司产品．1．3实验方法
1．3．1卵母细胞的获取和体外培养．
20～25g 的雌性昆明小鼠，每只注射10U PMSG ，48h 后颈椎脱臼法处死小鼠，摘取双侧卵巢置于M2操作液中，在实体镜下用4号半灭菌针头穿刺有腔卵泡，释放卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex ，COC)，选择卵丘细胞完整的COCs ，再用直径稍大于卵母细胞的玻璃吸管反复吹打，得到无卵丘的生发泡(GV)期卵母细胞进行培养，在培养过程中选取所需成熟水平的卵母细胞进行数据统计及免疫荧光检测．
培养分为5组：0.5g/L 雷帕霉素处理组、2.5g/L 雷帕霉素处理组、3.3g/L 雷帕霉素处理组、5g/L 雷帕霉素处理组、10g/L 雷帕霉素处理组．上述各组均设对照组，分别加入相同浓度的二甲基亚砜(DMSO)．
卵母细胞成熟培养液为添加4g/L BSA 的
α-MEM 培养液(Gibco 公司)．操作液配方依照
《小鼠胚胎操作实验手册》[13]
进行配制．培养条件为：
饱和湿度、恒温37℃、5%CO 2．
1．3．2激光共聚焦显微镜检测．将经过一定时间培养的卵母细胞取出后，在M2操作液中清洗3遍．以4%多聚甲醛(溶解于PBS 中)室温固定30min ，或PBST(PBS 加0.01%Tween 20)洗涤3遍，0.1%TriotnX-100(溶解于PBS)透膜30min ，封闭液(含1%BSA 的PBS)避光封闭1h ，将卵细胞转入一抗(FRAP 兔多克隆抗体用封闭液按1∶50稀释)中4℃过夜，PBS 洗涤3次，每次5min ，将卵细胞转入二抗(FITC 标记羊抗兔IgG ，用封闭液按1∶50稀释)中，室温下避光孵育1h ，PBS 洗涤3次，每次5min ，用DAPI 染色5min ，使DNA 染色．激光共聚焦显微镜观察、照相．1．4数据分析与统计
每组实验至少重复5次，获得的数据最后使用SPSS 13.0的t 检验进行统计分析，P <0.05认为差异显著．
2结果
2．1mTOR 在小鼠卵母细胞中的表达
激光共聚焦检测表明，在GV 期，mTOR 主要集中在核膜处表达，在核内也呈现一些点状分布，但在核仁区没有表达，生发泡破裂(GVBD)后，mTOR 主要伴随染色体表达，第二次减数分裂中期(M Ⅱ)期主要伴随纺锤体表达(图1)
．
1335··
生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2009;36(10)
Treatment factor
The quantity of oocytes
with PB1The quantity of oocytes
without PB1
The rate of PB1/%
t -test
Control 1012381.5Rapamycin (0.5g/L)
862676.5P >0.05Control 952579.2Rapamycin (2.5g/L)
793370.3P >0.05Control 932578.8Rapamycin (3.3g/L)
684262.1P <0.05Control 992480.7Rapamycin (5g/L)
545648.7P <0.01Control 962678.6Rapamycin (10g/L)
31
80
28.0
P <0.01Treatment factor
The quantity of oocytes
with GVBD
The quantity of oocytes
without GVBD
The rate of GVBD/%
t -test
Control 1101488.9Rapamycin (0.5g/L)
961685.3P >0.05Control 1051587.6Rapamycin (2.5g/L)
902280.5P >0.05Control 1051388.6Rapamycin (3.3g/L)
743667.2P <0.05Control 1101389.4Rapamycin (5g/L)
595154.0P <0.05Control 1061687.5Rapamycin (10g/L)
42
69
38.0
P <0.012．2．2雷帕霉素处理对小鼠卵母细胞第一极体(PB1)发生率的影响．注射PMSG 48h 后将卵母细胞置于α-MEM 培养液中培养，实验组加入不同终浓度的雷帕霉素，对照组加相应体积的二甲基亚砜，到排出第一极体时观察结果．结果发现，雷帕
霉素能抑制PB1发生率，该作用具有浓度依赖性，浓度越高，抑制作用越明显．当雷帕霉素浓度达到3.3g/L 时，卵母细胞PB1的发生率与对照组相比明显降低，差异具有显著性(P <0.05)．见表2．
2．2雷帕霉素处理对小鼠卵母细胞成熟的影响2．2．1雷帕霉素处理对小鼠卵母细胞GVBD 的影响．注射PMSG 48h 后将卵母细胞置于α-MEM 培养液中培养，实验组加入不同终浓度的雷帕霉素，对照组加相应体积的二甲基亚砜．结果发现，雷帕
霉素能抑制GVBD 率，该作用具有浓度依赖性，浓度越高，抑制作用越明显．当雷帕霉素浓度达到3.3g/L 时，卵母细胞GVBD 的发生率与对照组相比明显降低，差异具有显著性(P <0.05)．见表1．
Table 1The effect of rapamycin on the rate of GVBD
Table 2Effect of rapamycin on the rate of PB1
2．3雷帕霉素处理对小鼠卵母细胞mTOR 表达的影响
激光共聚焦结果显示：GV 期，对照组和雷帕霉素处理组卵母细胞虽然都能检测到mTOR 的表达，但表达部位和形态有明显差异，对照组mTOR 在核膜处表达，处理后的GV 期卵母细胞在核膜处表达明显减弱，更多地在核内区域表达；GVBD
期，对照组和雷帕霉素处理组也有明显差异，对照组mTOR 伴随染色体表达，处理后mTOR 没有伴随染色体表达，且染色体形态异常；M Ⅱ期卵母细胞中，对照组mTOR 主要伴随纺锤体分布，染色体规律地排列在赤道板上，而雷帕霉素处理组没有检测到mTOR 阳性信号，且染色体排列不规则(图2)．
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杨彩荣等：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用
2009;36(10)3讨论
本研究表明，在小鼠卵母细胞GV 期，mTOR 主要集中在核膜处表达，在核内也呈现一些点状分布，但在核仁区没有表达，发生GVBD 后，mTOR 主要伴随染色体表达，M Ⅱ期主要伴随纺锤体表达．一旦其表达发生异常，则卵母细胞GVBD 的发生、第一极体的排放都会受到影响．这是首次对mTOR 在小鼠卵母细胞中的表达进行定位，同时证明了mTOR 对小鼠卵母细胞第一次减数分裂具有重要的作用．
mTOR 在细胞中的定位及分布一直是研究人员关注的问题，但至今仍没有一致的结论．Zhang 等[14]对mTOR 在成纤维细胞、人胚肾细胞(HEK293)、分化及生长过程中的鼠生肌细胞等10个细胞系的表达研究表明，只有HEK293细胞大部分mTOR 分布在细胞质，其余的细胞系中mTOR 主要在核内分布．Drenan 等[15]在HeLa 细胞的研究发现，mTOR 主要分布于核周区域，它是内质网膜和高尔基体膜的外周蛋白，另有少量的mTOR 位于线粒体上，此外，对其他哺乳动物细胞，鼠生肌细胞C2C12、人二倍体成纤维细胞MRC5、鼠的胚胎成纤维细胞、Rh30横纹肌肉瘤细胞的亚细胞定位研究也表明，mTOR 主要分布在高尔基体和内质网上，其分布没有细胞特异性．Kim 等[16]在人胚肾293(HEK293)细胞系及猴的肾上皮CV-1细胞系的研究中发现，mTOR 是个核穿梭蛋白，mTOR 能与
其他的核转运蛋白集合，从而转移分布的位置，它的穿梭与雷帕霉素敏感的mTOR 信号途径及蛋白质翻译起始有关．
我们的结果表明，在小鼠卵母细胞中，mTOR 的分布主要在细胞核内，且具有明显的阶段性．GV 期，mTOR 主要集中在核膜处表达，在核内也呈现一些点状分布，但在核仁区没有表达，发生GVBD 后，mTOR 主要伴随染色体表达，M Ⅱ期mTOR 伴随纺锤体表达．这可能是与mTOR 在不同阶段的作用有关．
在GV 期的卵母细胞中，mTOR 主要集中在核膜处表达，可能是与mTOR 的核-胞质穿梭有关[16]，当大量的mTOR 与核转运蛋白结合，通过核膜在核-胞质之间转移时，在核膜处会出现mTOR 聚集的现象．雷帕霉素处理后的GV 期卵母细胞在核膜处表达明显减弱，更多地集中在核内区域，这是因为雷帕霉素抑制了mTOR 的活性[8～10]，从而使其表达减弱，同时没有进行核穿梭的mTOR 集中在核内区域．这表明在小鼠卵母细胞中，mTOR 的穿梭也与雷帕霉素敏感的mTOR 信号途径有关[16]．
GVBD 期mTOR 伴随染色体分布，染色体的正确凝集状态需要特定蛋白质的参与，mTOR 可能与此时这些特定蛋白质的合成有关，以维持染色体的正确形态，由于核膜破裂，染色体分布于不含任何细胞器的原核区，其周围有丰富的线粒体包围[17]，可能此时也有部分mTOR 分布在线粒
体
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生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2009;36(10)
上[15,18]．另外，mTOR伴随染色体表达，可能也与纺锤体的重新组建有关[11,19]，雷帕霉素处理后GVBD期卵母细胞，mTOR没有伴随染色体表达，且染色体形态异常，表明此时的mTOR可能与染色体形态的正确形成有关．同时经过雷帕霉素处理后，小鼠卵母细胞GVBD的发生率受到抑制，这说明mTOR与核膜破裂有关，而影响核膜破裂的关键因素是成熟促进因子(maturation prompting factor，MPF)的活化状态，只有当细胞周期蛋白B (cyclinB)的合成达到阈值时和p34cdc2结合，才能活化MPF，从而启动减数分裂[20]．这说明mTOR 可能与卵母细胞中cyclinB的积累有关．Laure等[11]在海星、海胆的卵母细胞研究中发现，cyclinB的合成依赖于储存的卵内mRNA，它的翻译受雷帕霉素敏感的途径调节．这与我们的结果一致．MⅡ期，mTOR伴随纺锤体表达，染色体规律地排列在赤道板上，雷帕霉素处理后的卵母细胞没有检测到mTOR阳性信号，而且染色体的排列不规则，表明mTOR可能与纺锤体的正常形成有关．Laure等[11]在研究海星卵母细胞中发现，抑制mTOR的表达后，形成的纺锤体产生缺陷．这与我们的结果类似．Jacintol等[19]在HEK293细胞的研究中发现，mTOR能够调节微丝的形成，而mTOR 对微管的形成可能也有一定的关系．雷帕霉素处理后，小鼠卵母细胞第一极体的排放受到抑制，这是因为mTOR受到抑制后，影响正常的纺锤体形成[11]，从而抑制第一极体的排放．此外，雷帕霉素的这种抑制作用具有浓度依赖性，浓度越高抑制作用越明显．有研究表明，雷帕霉素对肿瘤细胞的生长活性及细胞增殖的抑制均具有浓度依赖性[21～23]．以上结果说明，mTOR在小鼠卵母细胞成熟过程的各时期都有表达，如果其表达发生异常，则会对卵母细胞GVBD的发生及第一极体的排放产生影响．目前哺乳动物卵母细胞发生及成熟过程中mTOR的调控机制尚未见报道，mTOR可能作为重要的调控分子参与卵母细胞成熟过程，对其进一步研究将对揭示小鼠卵母细胞的成熟机制具有重要意义．
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杨彩荣等：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用
2009;36(10)The Expression and Effect of mTOR During Mouse Oocyte Maturation
YANG Cai-Rong,WEI Yan-Chang,ZHANG Yan,ZHENG Ke-Jia,LI Ning,YAN Yun-Qin *
(Department of Animal Cell and Developmental Biology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)
Abstract The mammalian target of rapamycin (mTOR)is a serine-threonine kinase downstream in the PI3K-Akt pathway,which belongs to the phosphatidylinositol kinase-related kinase (PIKK)family.The mTOR palys an important role in cell cycle regulation and protein synthesis.mTOR signaling pathway is evolutionarily conserved,which can integrate and converge a wide range of signals,including intracellular and extracellular nutrients,growth factors,energy and stress conditions,and has a crucial role in vertebrate growth control.The upstream regulation and downstream effects mediated by mTOR form a network of critical growth signaling pathways.Hence,dysregulation of components within mTOR signaling network result in impaired internal environment conditions,and first meiotic division can also be influenced if occurring during starfish and sea urchin oocyte maturation.However,its functions in mammalian meiosis are unclear.The localization and function of mTOR during mouse oocyte meiotic maturation were investigated with the oocytes of Kunming mouse.Location of mTOR was examined in Germinal vesicle (GV)stage,Germinal vesicle breakdown (GVBD)stage and second metaphase (M Ⅱ)stage during mouse oocyte maturation by immunofluorescence technology.The rate of GVBD and polar body extrusion (PB1)during mouse oocytes maturation was also detected by treatment with different concentration rapamycin (0.5g/L,2.5g/L,3.3g/L,5.0g/L,10g/L ).Immunofluorescent staining showed that mTOR mainly is located on nuclear membrane during GV stage,distributed with the chromosome after GVBD,and distributed with the spindle apparatus during M Ⅱstage.The oocyte maturation was inhibited by treatment with rapamycin,and the inhibitory action was concentration dependent,when the drug concentration reached to 3.3g/L,the disparity was significant (P <0.05).Meanwhile,the location and morphous of mTOR were changed:under treatment with 3.3g/L rapamycin,mTOR protein expression became obviously weaker and distributed more in intranuclear in the stage of GV;and didn't distribute with the chromosome after GVBD,the morphous of chromosome was changed.The mTOR can not be detected in M Ⅱstage,and the chromosome arrangment was irregular.The results suggest that the expression and distribution of mTOR shows stage specificity during mouse oocyte maturation,rapamycin had an effect on mouse first meiotic division,including chromosome arrangment and spindle formation,demonstrating that a rapamycin-sensitive pathways is involved in this mechinism.mTOR plays an important role during procedure of GVBD and first polar body extrusion,which could regulate maturation process of mouse oocyte through the changes of its expression and localization.Key words mTOR,mouse oocytes,rapamycin,immunofluorescence DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00446
*Corresponding author.
Tel:86-451-55190846,E-mail:yanyunqin@https://www.doczj.com/doc/0514585154.html, Received:July 23,2009
Accepted:September 4,2009
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甲氧滴滴涕对小鼠卵母细胞体外成熟的影响【摘要】目的：观察甲氧滴滴涕(MXC)对小鼠卵母细胞体外成熟的影响. 方法：实验组小鼠未成熟卵用7.25, 14.5，29 mg/L MXC 不同浓度培养液培养；对照组小鼠未成熟卵直接用合成人输卵管培养液培养，两组培养时间均为24 h. 观察各组生发卵泡破裂(GVBD)和第一极体(PB1) 的形成, 出现PB1的卵母细胞视为核成熟. 结果：培养24 h时，卵母细胞GVBD发生率7.25 mg/L MXC组为80.4%，14.5 mg/L MXC组为78.8%，29 mg/L MXC组为78.4%，与对照组的86%相比较并没有明显改变. 培养过程中不同浓度MXC试验组GVBD发生较同期对照组相比较也没有明显延迟. 但在培养液培养24 h时PB1的排出率7.25 mg/L MXC组为52.8%，14.5 mg/L MXC组为44.4%，29 mg/L MXC组为22%，明显低于对照组的71.2%，差异具有统计学意义(P<0.05). 结论： MXC对体外培养的小鼠卵母细胞GVBD发生没有影响，但能抑制其卵母细胞的核成熟. 【关键词】甲氧氯；卵母细胞；体外研究; 细胞培养技术 【Abstract】AIM: To investigate the effect of Methoxychlor (MXC) on in vitro maturation of mouse oocytes. METHODS： The oocytes in experimental groups were cultured in hunan tubal fluid(HTF) medium supplemented with 7.25，14.5，29 mg/L MXC and the oocytes in the unexposed control group were
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白：神经系统治疗的新靶点 美国神经科学细胞及分子信号研究实验室Kenneth Maiese博士，在《中国神经再生研究》（英文版）杂志2015年10卷第4期探讨了如何通过生长因子、Wnt信号及WISP1和干细胞组织防止糖尿病神经系统并发症的问题。营养因子，如胰岛素样生长因子-1、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和促红细胞生成素，可以通过控制氧化应激和糖尿病中葡萄糖稳态防止神经元死亡。有趣的是最近的研究也表明，细胞因子和生长因子促红细胞生成素通过Wnt信号保护间充质干细胞防止血管损伤死亡有关的途径，促进神经系统免疫细胞起到保护作用。通过独立的途径，Wnt信号和WISP1通过促进干细胞的生长和迁移，增加胰细胞增殖，从而导致新的血管生长，修复糖尿病伤口，并控制关键的程序性细胞死亡途径促进糖尿病期间保护神经系统中的细胞凋亡和自噬。在下游区，Wnt信号和WISP1通过雷帕霉素和AMP途径维持葡萄糖稳态和正常代谢活化的蛋白激酶。 Maiese博士还强调了通过注意“这些生物系统的活化程度是通过设计是营养因子、Wnt 信号、WISP1治疗糖尿病保护神经系统时所必须考虑的。例如，Wnt信号、WISP1和生长因子可导致如血管渗漏的视网膜和视力损害甚至癌症。总之，神经系统生长因子、Wnt信号和WISP1具有治疗糖尿病的并发症的广阔前景，然而，如何精确应用这些途径的靶点成功的保护 修复神经系统及神经元的功能仍值得探讨。 Article: "Novel applications of trophic factors, Wnt and WISP for neuronal repair and regeneration in metabolic disease" by Kenneth Maiese (Cellular and Molecular Signaling, Newark, New Jersey 07101, USA) Maiese K (2015) Novel applications of trophic factors, Wnt and WISP for neuronal repair and regeneration in metabolic disease. Neural Regen Res 10(4):518-528. 欲获更多资讯：文章全文请见：Neural Regen Res New Prospects for Targeting Diabetes Mellitus with Trophic Factors, Wnt, and WISP SUMMARY Diabetes mellitus (DM) affects almost 350 million individuals throughout the world and leads to significant disability in the nervous system involving dementia, stroke, neuropathy, and retinal disease. To combat these detrimental effects of DM, new avenues of discovery are being pursued that target novel growth factors and specific cellular pathways of Wnt signaling, Wnt1 inducible signaling pathway protein 1 (WISP1), and stem cells to block neuronal death and potentially lead to reparative processes in the nervous system. NEWS RELEASE Dr. Kenneth Maiese, an expert in cellular signaling and a physician scientist, explores in the journal Neural Regeneration Research(Vol. 10, No. 4, 2015) how novel targeting with growth factors, Wnt, WISP1, and stem cell tissue regeneration may offer new strategies to prevent the complications of DM in the nervous system. Trophic factors that include insulin-like growth factor-1 (IGF-1), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), and
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用 杨彩荣 魏延昌张 岩郑可佳 李 宁严云勤* (东北农业大学动物细胞与发育生物学教研室，哈尔滨150030) 摘要哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin ，mTOR)是一种Ser/Thr 激酶，属于PIKK 超家族，对调节细 胞周期、蛋白质合成等具有重要作用，是细胞生长、增殖、分化、凋亡的中心调控器，但在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以小鼠卵母细胞为研究对象，采用免疫荧光为主要研究方法，对mTOR 在小鼠卵母细胞中的表达进行研究，并通过mTOR 的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin ，RAPA )对卵母细胞进行处理，对mTOR 在卵母细胞成熟过程中的作用进行研究．结果显示：小鼠卵母细胞成熟过程中，生发泡(germinal vesicle ，GV )期mTOR 主要集中在核膜处表达，生发泡破裂(germinal vesicle breakdown ，GVBD )后mTOR 伴随染色体分布，第二次减数分裂中期(second metaphase ，M Ⅱ期)mTOR 伴随纺锤体分布；雷帕霉素处理后，小鼠卵母细胞的成熟受到抑制，且这种抑制作用具有浓度依赖性，同时其mTOR 的表达部位和形态也发生变化．研究表明，在小鼠卵母细胞成熟过程中，mTOR 在各个时期的表达及分布具有阶段特异性，并对小鼠卵母细胞GVBD 的发生和第一极体的排放都具有重要作用． 关键词雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，小鼠卵母细胞，雷帕霉素，免疫荧光学科分类号 Q2 DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00446 生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biophysics 2009,36(10):1334~1339 https://www.doczj.com/doc/0514585154.html, 研究报告 Research Papers *通讯联系人. Tel:0451-********,E-mail:yanyunqin@https://www.doczj.com/doc/0514585154.html, 收稿日期：2009-07-23，接受日期：2009-09-04 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)结构与功能上高度保守，是一种存在于哺乳动物细胞中的Ser/Thr 激酶，属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinase ，PIKK)家族成员．mTOR 信号通路可以汇聚和整合来自于营养、生长因子、能量和环境胁迫对细胞的刺激信号[1～3]，通过其下游的靶蛋白核糖体蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6kinase 1，S6K1)和蛋白质翻译起始因子eIF4E 结合蛋白1(eIF4E binding protein 1,4EBP1)调控蛋白质的翻译，加快细胞G1期/S 期的转换，促进细胞生长和增殖，抑制细胞凋亡[4～6]．mTOR 信号通路紊乱与肿瘤的形成及细胞的恶性转化密切相关[7]． 雷帕霉素(rapamycin ，RAPA ，RPM)是一种大环内酯类抗生素和免疫抑制剂，它进入体内后与胞浆受体FKBP12结合形成复合物，此复合物能够结合在mTOR 蛋白羧基端的FRB 结构域内，形成三元复合物，使得mTOR 的激酶催化域失去接近并磷酸化下游靶蛋白的能力，从而抑制mTOR 的生物学功能[8～10]． mTOR 在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的研究较少，且大多集中在海星、海胆等动物中[11,12]， 而在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以往的研究表明，mTOR 与一些蛋白质的合成有关[12]，而特定蛋白质的合成对卵母细胞成熟具有重要的作用，因此我们推测，mTOR 可能在哺乳动物卵母细胞成熟过程中有重要作用．所以本研究以小鼠卵母细胞为研究对象，观察了mTOR 在卵母细胞成熟各个阶段的表达及分布情况，同时通过雷帕霉素的处理观察mTOR 对卵母细胞成熟的重要作用，为进一步探索mTOR 在小鼠卵母细胞成熟过程中的分子机制提供实验依据． 1材料与方法 1．1 实验材料 本实验选用昆明白品系6～8周龄性成熟雌鼠，购自哈尔滨肿瘤医院实验动物中心． 1．2 主要试剂 α-MEM 购自Gibco 公司；雷帕霉素购自江苏碧云天生物技术研究所；孕马血清(pregnant mare
猪卵母细胞体外成熟培养时间及去核方法的研究* 朱秀萍1，蒋伟娟2，艾晓杰1，徐动1，朱淑文1 1上海交通大学农业与生物学院，上海 (200240) 2上海市兽医卫生监督所，上海 (200335) E-mail：xpzhu@https://www.doczj.com/doc/0514585154.html, 摘要：本研究对不同体外成熟培养时间的猪卵母细胞进行盲吸法去核及利用脱羧秋水仙碱(DC)和放线菌酮(CHX)的化学诱导法去核效率进行了比较研究。结果显示，用盲吸法去核，体外成熟培养（IVM）39-41h组卵母细胞去核率与IVM 36-38h组差异显著（P<0.05），与42-44h 组差异不明显（P>0.05），但三组显著高于IVM45-48h组（P<0.05）。化学诱导法去核结果表明，IVM 42-44h组去核率最高，但与IVM 39-41h组差异不显著（P>0.05），其他各组间均差异显著（P<0.05）。在相同的体外成熟培养时间内，盲吸法的去核率比化学诱导法的去核率要高。本实验证明：猪卵母细胞IVM在39-44h内去核率较高，且盲吸法去核效率高于化学诱导去核。 关键词：猪卵母细胞，盲吸法去核，化学诱导去核，去核率 中图分类号：Q 968.1 1 前言 近年来，体细胞核移植在多种哺乳动物获得成功，相继产生克隆羊、牛、小鼠、山羊、猪、猫、兔、骡子和大鼠，为生命科学、医学制药等诸多领域提供了一个崭新的研究手段。卵母细胞核物质的去除是克隆技术成败的关键环节之一，卵母细胞的体外成熟是决定克隆胚胎能否最终发育成正常个体的关键。去核效率的高低与卵母细胞所处的成熟时期及采用的去核方法有密切关系。因此掌握卵母细胞体外成熟时间，快速而准确的去核，对提高去核成功率有重要意义。 目前动物克隆中普遍使用是机械去核法（盲吸法），该方法对细胞的机械损伤较大、耗时、技术要求高。如何既能完全去掉卵母细胞的核，又不致对细胞造成更大的损伤是研究者们一直在探索的问题。“化学诱导去核法”去核首次建立于小鼠卵母细胞，用脱羰秋水仙碱（DC）处理激活的卵母细胞，使染色体和极体牢固结合，然后用诱导第二极体排出的放线菌酮(CHX)处理卵母细胞，成功得到克隆小鼠[1~3]。Yin等把该法也应用于猪卵母细胞的去核[4]。在我国，杜卫华等首次利用化学诱导去核法用于小鼠卵母细胞的去核研究[5]，但对体外成熟培养的猪卵母细胞化学诱导去核研究目前国内尚未见报道。 本研究使用盲吸法和化学诱导去核对不同成熟培养时间的猪卵母细胞进行去核，旨在确定最佳的去核时间；建立猪卵母细胞化学诱导去核方法；同时，通过两种方法的去核效率的比较，为克隆技术研究中卵母细胞去核这一关键环节提供理论依据。 2 材料和方法 2.1 猪卵母细胞的采集 实验所用卵巢均来自于上海市闵行区纪王镇屠宰场屠宰的初情期前小母猪。将获取宰场屠废弃的猪卵巢，置于37℃灭菌生理盐水中，2h内送回实验室。以生理盐水清将卵巢洗两次 *本课题得到上海市科委国际交流项目（015407005）的资助。
中科院研究发现细胞“返老还童”关键机制 2015年05月21日08:16来源：《中国科学报》 原标题：研究发现细胞“返老还童”关键机制 （记者朱汉斌、丁佳通讯员黄博纯）记者从中科院广州生物医药与健康研究院获悉，该院裴端卿和秦宝明实验组发现了细胞在结构上“返老还童”的关键机制，有望为寻找新的治疗手段提供有力依据。5月18日，相关成果在线发表于《自然·细胞生物学》杂志。 据裴端卿介绍，细胞在饥饿等胁迫条件下会主动降解自身细胞质组分，这一过程被称为“自噬”。此前有研究认为，自噬在重编程早期发挥关键作用。但最新研究发现，自噬对重编程非但不是必须，反而起阻碍作用。重编程在自噬缺失的细胞中不仅效率更高，而且获得的诱导多能干细胞（iPS细胞）具有正常的多能性。 据了解，2006年，日本科学家建立的iPS细胞技术，实现了成体细胞逆转为具有多种分化潜能的类似胚胎干细胞状态的iPS细胞，从而叩开了再生医学的大门。不过，该技术在获得大规模应用前仍存在很多问题。 什么是细胞重塑？科研人员介绍说，成体细胞犹如一个具有特定功用的房间，房间里的器具构造决定了它是居家、办公还是商铺；而胚胎干细胞更像是一个空房间，根据需要可把它改造做任何用途。成体细胞重编程为胚胎干细胞的过程，如同把原有房间里的器具构造清空，只留下一些水电等最基本的设施。这就是细胞在结构上“返老还童”的关键过程。 最新发现将拓展对糖尿病、癌症以及神经退行性疾病等代谢疾病中细胞重塑如何影响细胞命运的认识，从而为寻找新的治疗手段提供有力依据。研究人员进一步发现，细胞重塑的发生实际上来自雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）的关闭，其持续开启则阻断细胞重塑、线粒体代谢转变以及重编程的发生。
中国肾移植受者哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂临床应用专家共识 （最全版） 一、前言 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂(mammalian target of rapamycin inhibitors，mTORi)作为免疫抑制剂在临床应用已经有10多年的历史，目前用于移植后免疫抑制治疗的mTORi主要包括西罗莫司(sirolimus，SRL)和依维莫司(everolimus，EVL)，其他mTORi，如坦西莫司等仅用于抗肿瘤治疗。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是参与细胞内多个信号通路的重要物质，影响细胞生长、增殖、代谢、自噬、血管生成等诸多重要过程。mTORi进入细胞后，在胞浆内与FK结合蛋白12(FK binding protein-12，FKBP-12)结合形成复合物，进而与mTOR结合，抑制mTOR活性，使p70S6激酶脱磷酸化而失活，从而抑制蛋白质的合成及细胞周期循环。因此，mTORi可抑制T淋巴细胞、B 淋巴细胞的增殖、分化及抗体的形成，同时也可抑制非免疫细胞(成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞和平滑肌细胞)的增殖[1]。 mTORi可以作为肾移植受者的初始治疗药物，也可以作为其他治疗方案的转换药物。按照转换时间可将转换治疗分为早期转换(术后2～6个月)和晚期转换(术后6个月以后)；按照转换原因分为主动转换(pre-emptive/proactive)和被动转换(reactive)，主动转换用于避免可预期的钙调磷酸酶抑制剂(calcineur ininhibitors，CNI)的不良反应或用于肿
瘤、病毒感染等高危人群，被动转换是指在CNI的不良反应出现后进行转换。 二、mTORi作为初始治疗药物 初始给药时，可以采用CNI(慢撤除或低剂量长期合用)＋SRL＋糖皮质激素(glucocorticoid，GC)方案，其中慢撤除指CNI在4～6周内逐渐停药。研究证明，当SRL浓度达到8～12 μg/L，撤除或联合应用低剂量CNI 将减轻CNI肾毒性，并改善移植受者的肾功能，同时不增加排斥反应风险，有助于提高移植肾长期存活率。 建议1：免疫低、中危受者和高危受者采用mTORi作为初始治疗药物时，应联合CNI类药物。 建议2：慎用于切口不易愈合的受者，包括体重指数(body mass index，BMI)>30 kg/m2、2型糖尿病、既往有广泛盆腔手术史或放疗史、既往由于前次移植或自身免疫性疾病服用GC的肾移植受者。 建议3：避免用于因局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomurular sclerosis，FSGS)、膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MPGN)等易于复发的肾脏疾病而行肾移植治疗的受者[2]。 建议4：初始治疗采用CNI(慢撤除或低剂量长期合用)＋SRL＋GC方案具有较好的临床疗效，且相对安全。 早期研究证明，相对于环孢素A(CsA)＋霉酚酸类(mycophenolic acid，MPA)＋GC方案，SRL＋MPA[或硫唑嘌呤(azathioprine，Aza)]＋GC(CNI-free)方案能显著提高肾移植受者的肾小球滤过率(glomerular
mTOR抑制剂的筛选方法 【摘要】雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是是丝氨酸/苏氨酸激酶分子靶位。mTOR是细胞生长增生的中心调控者，直接或间接参与细胞生长增生有关环节的调控。人体多种肿瘤细胞中可见mTOR通路的失调。近年来，有关mTOR抑制剂的专利申请不断增加，设计、合成、筛选结构新颖的mTOR抑制剂已经成为抗肿瘤药物研发的重大课题。本文就mTOR的结构功能、信号转导通路及mTOR抑制剂的筛选方法进行简单的介绍。 【关键词】雷帕霉素靶蛋白雷帕霉素靶蛋白抑制剂药物筛选 TOR(target of rapamycin，雷帕霉素靶蛋白)是一类进化上非常保守的蛋白激酶家族，广泛存在于各种生物细胞中。 1994年，Brown等证实并克隆了哺乳动物TOR基因，其产物只有一种蛋白，即mTOR(mammalian target of rapamycin，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)。mTOR属P13K蛋白激酶类家族，是P13K／PKB信号通路下游的一个效应蛋白，其底物主要控制与细胞生长和增殖密切相关的蛋白质的合成。mTOR控制细胞内mRNA的翻译，参与膜蛋白转运，蛋白质降解，蛋白激酶C信号转导和核糖体合成等一系列生理病理过程。 1.mTOR的分子结构 mTOR分子结构复杂，由2 549个氨基酸残基组成，分子中有数个各自独立而保守的结构域，类似于酵母中TOR的结构。mToR分子的氨基端存在20个串联重复序列，每一个重复序列包含2个分别由40个氨基酸残基组成的α螺旋，每个螺旋都有一个亲水基团和一个疏水基团。这种重复结构介导蛋白质之间的相互作用，并有利于mTOR定位于浆膜。 mTOR分子羧基端的中部是蛋白激酶域，结构和P13K激酶的催
卵母细胞的孤雌激活 将体外成熟卵母细胞（COCs要提前脱卵丘）分别用M2液及含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液洗3遍，然后将卵母细胞置于含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液中培养2.5小时，之后转入不含SrCl2的无糖CZB液中继续培养3.5小时，即在激活处理6小时后观察原核统计激活率。为了维持孤雌激活胚胎的二倍性，激活液和6小时检查原核前短期培养的培养液中均添加5μg/ml的CB。 激活的判定：2原核或2-细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活；卵质膜破裂者判断为死亡；胞质分裂一次或多次但不出现原核者判断为碎裂（fragmentation）。本实验将碎裂卵均归为未激活卵。对照组为未经激活处理，但与激活组培养相同时间的卵母细胞。每次实验，只有当对照组卵母细胞无一激活时，实验组数据才有效。 实验原理：利用氯化锶抑制第二极体的排出 实验用品：培养12小时并老化12小时，即24小时后的卵【要提前脱卵丘】，透明质酸酶，M2操作液，10摩尔每毫升的氯化锶，含钙CZB, 孤雌激活实验步骤 1,，第一天上午杀鼠取卵，培养卵。假设只有一个培养孔的卵，一个孔里最好有20至30个卵，留置第二天孤雌激活。 2,，第二天上午，算好时间，用紫外线照射两个培养孔，15分钟后加液，一个孔里放激活液，【激活液的组成是CB加氯化锶加无钙CZB】，
配置激活液的方法问师兄。另一个孔里放培养液【含钙的CZB】。3，注意激活液不能预热太长时间，CB热时间长会影响效果，【君佐师兄的加法是无钙CZB450微升加上氯化锶50微升平衡20分钟，然后加上氯化锶做滴平衡20分钟就可以放卵了】，在配置激活液时最后应该用枪打一打，好充分混匀。至于放培养液的孔可以以后考虑，激活需要6个小时。把握好时间，脱卵丘后就马上激活。同时预热上需要的药品，包括M2，含钙的CZB，再照上两个中平皿。 4，开始做时先用透明质酸酶处理培养的卵1至3分钟，脱卵丘。再用M2洗3至4遍，再用激活液洗3至4遍，再移入含有激活液的培养孔中。移入培养箱中激活6个小时。 5，假设上午9点做完，下午3点就可以观察。激活的判断方法是2原核或2细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活。卵质膜破裂者判断为死亡。胞质分裂一次或多次，但不出现原核者判断为碎裂，本实验将碎裂卵均归为未激活卵。 6，将激活成功的卵母细胞用含钙的CZB培养液洗5至6遍，再转移如含钙CZB的培养孔中培养，理论上48小时后就可以看到4细胞期，此时再转入含糖含钙CZB胚胎培养液中培养，即可以到达囊胚期。
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 卵子发生 原始卵泡 初级生长卵泡 次级生长卵泡 成熟中的卵泡 成熟卵泡（滤泡）和成熟卵 卵母细胞和卵泡细胞的关系 卵的结构 细胞核 染色体 核仁 细胞质 色素 皮层颗粒 环层板 卵黄 卵的类型 卵膜 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 动物成熟的雌性生殖细胞，亦称卵子。一般呈球形或椭球形，较大，多不能活动。它除具有一般细胞所共有的细胞核、细胞质、细胞器和质膜外，还有一些专供受精后发育所需的营养物质。以哺乳类为例，性成熟后，在神经和激素调控下自卵巢中排出的成熟卵，其外有透明带和放射冠包围，在透明带和质膜之间为充满液体的卵周隙（图1）。 卵（动物） 卵子发生
在性成熟之前卵巢皮层中有相当数量的卵原细胞。卵原细胞是在胚胎时期原始生殖细胞迁移到生殖嵴内分裂繁殖而产生的。卵原细胞之间存在着细胞间桥，所以发育的同步化程度较高。但同步化只限于这一时期，卵原细胞转变为初级卵母细胞时，细胞间桥消失，彼此分开，这点与精子发生不同。哺乳类在胎儿出生前或出生后不久，卵原细胞全部发育为初级卵母细胞。在个体性成熟之前初级卵母细胞不生长。性成熟后卵巢皮层中的、被卵泡细胞包围着的初级卵母细胞在激素刺激下生长，细胞核进行DNA复制,然后进入成熟分裂的前期变化。生长到一定的体积后，初级卵母细胞进行第一次成熟分裂，产生一个次级卵母细胞和第一极体；次级卵母细胞再进行第二次成熟分裂，产生卵子和第二极体。这些变化都是在卵泡中进行的(图2)。卵子和卵泡的发育大致可以划分为： 卵（动物） 原始卵泡尚未开始发育的卵泡，位于卵巢的皮层，由一个卵原细胞和外围一层扁平的卵泡细胞组成，数量很多，但在各类动物中差别很大。 初级生长卵泡卵泡细胞由扁平变为立方形，从一层增殖为几层，卵母细胞也开始增大，细胞核发生一系列成熟分裂前期的变化，产生大量核液，形似球状；在卵母细胞周围开始出现透明带。在透明带中有从卵母细胞和卵泡细胞的表面伸出的微绒毛，它们相互接触，构成卵泡细胞给卵母细胞输送物质的通道。 次级生长卵泡卵泡不断增大，外围的卵泡细胞有几层到十几层，在卵泡细胞之间出现充满透明液体的不规则腔隙，其中的液体即卵泡液。这时卵母细胞也长到最大的体积，并为一层较厚的透明带所包裹。 成熟中的卵泡卵原细胞过渡到卵母细胞，已长到最大体积，并准备成熟分裂；它周围的腔隙逐渐合并越来越大，卵泡仍可继续生长。 成熟卵泡（滤泡）和成熟卵此时体积到达最大限度。初级卵母细胞渐位于卵泡一侧，向腔内突出，仍为卵泡细胞包围，此即卵丘。人的卵泡直径可达1厘米,并从卵巢表面突出。卵泡中的卵母细胞已完成第一次成熟分裂并停止于第2次成熟分裂的中期，等待排卵（图3）。
1 mtor概述 mtor（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)是蛋白激酶家族中新的一员，这类蛋白激酶又属于磷酯酰肌醇激酶相关激酶(pikk)［1-3］。mtor是在研究免疫抑制剂雷帕霉素的过程中发现的，科学家在研究中发现结构相似的免疫抑制剂fk506和雷帕霉素能够与相同的靶蛋白fkbp12 (fk506结合蛋白)结合发挥其免疫抑制作用，但是它却与fk506的免疫抑制机制不同，雷帕霉素与fkbp12结合形成的复合物不能与钙调素结合，并且雷帕霉素也不能抑制t细胞的早期激活或直接减少细胞因子的合成，它是通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断t淋巴细胞及其它细胞由g1期至s期的进程，而fk506则是抑制t淋巴细胞由g0期至g1期的增殖［4］。 由于mtor在细胞增殖、分化、转移和存活中的重要地位，mtor已经成为癌症治疗中的一个新靶点。mtor抑制剂的抗癌机制都是通过首先与fkbp-12蛋白生成复合物，此复合物再与mtor的frb区域结合由此抑制mtor的功能，从而抑制了下游的相关因子的功能，将肿瘤细胞阻滞于g1期(前dna合成期)从而使肿瘤细胞的生长受抑制并最终阻滞细胞的增殖甚至使细胞凋亡。 2 mtor抑制剂 2.1 雷帕霉素及其衍生物雷帕霉素(rapamycin,sirolimus,rapa,1)属大环内酯类抗生素，与fk506结构相似。早在1975年，从们已从吸水链霉菌(steoptomyces hyproscopicus)的代谢产物中分离出雷帕霉素，但由于其过低的抗菌活性而遭冷遇，直至1977年由于其结构与免疫抑制剂fk506相似而被发现同样具有免疫抑制活性，但令人惊奇的是雷帕霉素与fk506却有着非常不同的免疫抑制机制，这也加深了人们对t细胞活化的理解。1989年雷帕霉素作为抗移植的排斥反应的新药进入临床，现已上市。在上世纪90年代中期，由于雷帕霉素对t 淋巴细胞增殖的抑制又引导人们将其用于抗肿瘤细胞治疗，并发现其同样具有较好的抗肿瘤活性，此药作为抗癌药已由美国惠氏公司开发即将进入临床［5］。 雷帕霉素的抗肿瘤活性虽强，但它有两个严重的缺点：稳定性差及溶解性差。雷帕霉素对酸或碱都不稳定，即使在生理ph条件下雷帕霉素也会发生β-消除形成α,β-不饱和酮和发生内酯环的水解形成β-羟基酮而活性下降。所以曾有研究者尝试将内酯环附近引入较大位阻的基团以及将32位的羰基还原以阻止雷帕霉素的降解。其修饰的结果表明在1位引入烷基可以延长雷帕霉素衍生物的半衰期，并且烷基的体积增大使得雷帕霉素衍生物的稳定性增加但其fkbp结合活性也随之剧降从而使得mtor抑制活性降低；而将32位的羰基还原成羟基对稳定性和抑制活性的影响都较小［6-7］。 雷帕霉素溶解性差的问题则导致了很难得到其盖仑制剂或口服剂型，一直以来雷帕霉素的使用都是通过非肠道给药系统。为了解决口服给药生物利用度过低的问题，研究者试图在雷帕霉素的结构上引人亲水性的基团。将16位的甲氧基的甲基脱去或者将甲氧基替换成炔氧基可以增加雷帕霉素衍生物的稳定性和生物利用度。而在40位的羟基上的修饰显然对改善雷帕霉素的理化性质更为有利。 everolimus［certican,rad001,sdz rad,43-o-(2-hydroxethyl)-rapamycin］everolimus（其结构如图1所示）是novartis公司研发的水溶性比雷帕霉素好的半合成衍生物，可以口服给药。体外免疫抑制活性比雷帕霉素低3倍，但在体内与雷帕霉素相当。作为免疫抑制剂与环孢素有协同作用，目前处于肾移植的ⅲ期临床试验中；evero-limus有抑制血管内皮细胞增殖的作用，已批准作为药物支架的涂层药物；everolimus也是mtor抑制剂，
1.mtor概述 mtor（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)是蛋白激酶家族中新的一员，这类蛋白激酶又属于磷酯酰肌醇激酶相关激酶(pikk)［1-3］。mtor是在研究免疫抑制剂雷帕霉素的过程中发现的，科学家在研究中发现结构相似的免疫抑制剂fk506和雷帕霉素能够与相同的靶蛋白fkbp12 (fk506结合蛋白)结合发挥其免疫抑制作用，但是它却与fk506的免疫抑制机制不同，雷帕霉素与fkbp12结合形成的复合物不能与钙调素结合，并且雷帕霉素也不能抑制t细胞的早期激活或直接减少细胞因子的合成，它是通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断t淋巴细胞及其它细胞由g1期至s期的进程，而fk506则是抑制t淋巴细胞由g0期至g1期的增殖［4］。 由于mtor在细胞增殖、分化、转移和存活中的重要地位，mtor已经成为癌症治疗中的一个新靶点。mtor抑制剂的抗癌机制都是通过首先与fkbp-12蛋白生成复合物，此复合物再与mtor的frb区域结合由此抑制mtor的功能，从而抑制了下游的相关因子的功能，将肿瘤细胞阻滞于g1期(前dna合成期)从而使肿瘤细胞的生长受抑制并最终阻滞细胞的增殖甚至使细胞凋亡。 2 mtor抑制剂 2.1 雷帕霉素及其衍生物雷帕霉素(rapamycin,sirolimus,rapa,1)属大环内酯类抗生素，与fk506结构相似。早在1975年，从们已从吸水链霉菌(steoptomyces hyproscopicus)的代谢产物中分离出雷帕霉素，但由于其过低的抗菌活性而遭冷遇，直至1977年由于其结构与免疫抑制剂fk506相似而被发现同样具有免疫抑制活性，但令人惊奇的是雷帕霉素与fk506却有着非常不同的免疫抑制机制，这也加深了人们对t细胞活化的理解。1989年雷帕霉素作为抗移植的排斥反应的新药进入临床，现已上市。在上世纪90年代中期，由于雷帕霉素对t 淋巴细胞增殖的抑制又引导人们将其用于抗肿瘤细胞治疗，并发现其同样具有较好的抗肿瘤活性，此药作为抗癌药已由美国惠氏公司开发即将进入临床［5］。 雷帕霉素的抗肿瘤活性虽强，但它有两个严重的缺点：稳定性差及溶解性差。雷帕霉素对酸或碱都不稳定，即使在生理ph条件下雷帕霉素也会发生β-消除形成α,β-不饱和酮和发生内酯环的水解形成β-羟基酮而活性下降。所以曾有研究者尝试将内酯环附近引入较大位阻的基团以及将32位的羰基还原以阻止雷帕霉素的降解。其修饰的结果表明在1位引入烷基可以延长雷帕霉素衍生物的半衰期，并且烷基的体积增大使得雷帕霉素衍生物的稳定性增加但其fkbp结合活性也随之剧降从而使得mtor抑制活性降低；而将32位的羰基还原成羟基对稳定性和抑制活性的影响都较小［6-7］。 雷帕霉素溶解性差的问题则导致了很难得到其盖仑制剂或口服剂型，一直以来雷帕霉素的使用都是通过非肠道给药系统。为了解决口服给药生物利用度过低的问题，研究者试图在雷帕霉素的结构上引人亲水性的基团。将16位的甲氧基的甲基脱去或者将甲氧基替换成炔氧基可以增加雷帕霉素衍生物的稳定性和生物利用度。而在40位的羟基上的修饰显然对改善雷帕霉素的理化性质更为有利。 everolimus［certican,rad001,sdz rad,43-o-(2-hydroxethyl)-rapamycin］everolimus（其结构如图1所示）是novartis公司研发的水溶性比雷帕霉素好的半合成衍生物，可以口服给药。体外免疫抑制活性比雷帕霉素低3倍，但在体内与雷帕霉素相当。作为免疫抑制剂与环孢素有协同作用，目前处于肾移植的ⅲ期临床试验中；evero-limus有抑制血管内皮细胞增殖的作用，已批准作为药物支架的涂层药物；everolimus也是mtor抑制剂，是作用于mtor靶位的抗肿瘤药物，它能与细胞毒抗肿瘤药物联合使用，对非小细胞肺癌有实质性的效果，处在i期临床。对黑色素瘤、直肠癌、胰腺癌有作用，口服剂量2.5 mg/ （kg•d）［8］。