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微生物致病菌快速检测技术
作者：张华锋
来源：《现代经济信息》2009年第23期
摘要:从原理、特点及应用等方面对食源性微生物致病菌的免疫及分子检测新技术作一概述,期望为致病菌监测提供参考。
关键词:致病菌免疫学聚合酶链反应基因芯片
食品中的生物性污染无论是在发达国家还是发展中国家都是影响食品安全的最主要原因,
致病性微生物是对消费者健康危害最大的食品安全问题。要确定食源性微生物致病菌在食物链中相关的食品,寻找预防食品污染的关键环节则依赖于对致病菌的监测能力和水平。
传统的检测方法无法对难培养或不可培养的致病菌进行检测,而且耗时费力,获得结果通常需要几天的时间,不能实现有效的监测、预防作用。因此,发展新的快速检测与鉴定食源性致病菌的方法是及时有效地控制和预防致病菌传播的前提。本文从原理、特点及应用等方面对食源性致病菌的免疫学及聚合酶链反应、基因芯片等检测新技术进行综述。
1. 免疫学检测技术
免疫学检测技术将抗原、抗体反应的特异性与酶的高效催化作用相结合,是一种可以定
位、定性和定量的综合技术,具高专一性和高敏感度。
1.1 酶联免疫吸附检测(ELISA)。1971年Engvall建立了ELISA方法,它以酶或者辅酶作为标记物,标记抗原或者抗体,用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应,并且利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原或者抗体,使其固相化,在其中进行免疫反应和酶促反应。ELISA具有
选择性好、结果判断客观准确、实用性强、样品处理量大等优点,弥补了经典化学分析方法和
其他仪器测试手段的不足。但ELISA对试剂的选择性高,很难同时分析多成分;对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应;对分析分子量很小的化合物或很不稳定的化合物有一定的困难。
食品致病菌快速检测技术 时间:2004-05-11 10:24:00 来源:食品商务网 沙门氏菌、李斯特氏菌、大肠杆菌O157、弯曲杆菌等食物致病菌已成为危害食品安全的头号杀手。如何快速而准确地检测这些致病菌，是有效遏制这些杀手、确保食品安全的首要任务。 常规食品微生物检测方法包括反复增菌、菌落分离及多种生化和血清学鉴别实验，不仅步骤复杂，而且耗费时间，难以适应飞速发展的现代食品生产和流通领域。因此为了确保食品的安全性，开发快速检测致病菌的方法非常重要。 随着生物、化学、材料科学以及计算机领域的进步，新的快速检测和识别方法层出不穷，这些方法主要包括微量生化试剂盒、抗原－抗体检测、DNA检测，以及常规检测的改进方法。微量生化试剂盒主要用于食品微生物的纯培养的生化鉴别上，与常规方法原理相同。一般是特别针对肠道菌或非肠道菌（如弯曲杆菌、李斯特氏菌、厌氧菌、非发酵性G－菌和G ＋菌）而设计，采用鉴别某种微生物的多种微量培养基及底物，其结果可人工识读；如结合自动保温、监测并记录设备，再与计算机中储存的数据库比较而自动鉴别的话，则可进行多样品大规模快速检测。 DNA检测方法包括应用探针、PCR技术和噬菌体技术，这些检测方法已商品化。探针检测一般是检测rRNA，因其rRNA在细菌中的高拷贝数，无须扩增，检测灵敏。PCR技术是用小片段的 DNA探针或引物，与特异性模板杂交，并用Taq酶扩增。几次循环后，PCR可以在2h 内扩增单拷贝DNA到1百万倍，所以从理论上说无须增菌培养。但由于食品和培养基中存在的抑制剂，可能阻止引物连接和减低扩增效率，所以在检测食品时，还是需要在检测前先进行增菌培养。应用噬菌体对其宿主的高度专一性的特点，进行食品致病菌的检测的实例就是沙门氏菌的检测，其中所使用的噬菌体经过基因工程改造而携带有可检测标记。如有沙门氏菌存在，此噬菌体将标记带给宿主并表达，从而被检出。 抗体检测方法是利用抗原－抗体的高度专一性结合的特点。由于反应简单和易操作，现已开发了许多方法用于食品检测。最简单的是乳胶凝集（LA），此法采用抗体包埋的有颜色的乳胶珠或胶体金颗粒，用于从食品中分离的纯培养的快速血清学识别或分型，LA的改良方法是反向被动乳胶凝集（RPLA），法常用于检测食品萃取液中的毒素。例如，食品中金黄色葡萄球菌即可采用此法检出：葡萄球菌的表面存在A蛋白，具有种属特异性，该A 蛋白能与人及多种哺乳动物的免疫球蛋白IgG的Fc段结合，因此可采用IgG包埋的乳胶颗粒，结合血浆纤维蛋白原与凝集因子的凝集反应，来检测金葡菌的有无。 酶联免疫分析（ELISA）是食品病原菌检测最常用的抗体分析方法。常设计成“三明治夹心”实验：固体基质上连接抗体，用来捕获增菌培养物中的抗原，与酶相连的第二抗体用于检测。塑料微孔板的侧壁、涂抹棒等检测用具常作为固体基质。在食品微生物检测的国家标准中，金葡菌肠毒素即是采用此法检出的。 免疫沉淀或免疫层析也是采用“夹心法”，但是没有采用酶连接物，而是用耦联在有色乳胶珠或胶体金上的抗体来检测。该方法简便易行，无须洗涤或操作，在获得增菌样品后，短短十来分钟即可完成。现已商品化的李斯特氏菌检测试剂盒即采用此方法。 此外，用含脱水培养基的一次性板卡，以替代传统的琼脂平板；用荧光法检测细菌ATP，以快速在线检测细菌总数；将生色物质和荧光物质加入到培养基内，以快速检测特征酶活力———这些方法，在食品微生物的快速检测中都已成为常用方法。 快速方法的优点是可从大量食品样品中快速筛选某致病菌或毒素。但要注意的是，快速
自来水水池至少有两个，工作台，药品试剂柜，超净工作台（无菌室），灭菌锅，培养箱，冰箱，干燥箱，电子天平，显微镜，平皿，试管，三角瓶等玻璃器皿。这些都是必备基本设备，只要能摆放的下就可以。 一、微生物实验室设计 微生物实验室由准备室、洗涤室、灭菌室、无菌室、恒温培养室和普通实验室六部分组成。这些房间的共同特点是地板和墙壁的质地光滑坚硬，仪器和设备的陈设简洁，便于打扫卫生。 二、微生物实验室基本要求（一）准备室 准备室用于配制培养基和样品处理等。室内设有试剂柜、存放器具或材料的专柜、实验台、电炉、冰箱和上下水道、电源等。（二）洗涤室 洗涤室用于洗刷器皿等。由于使用过的器皿已被微生物污染，有时还会存在病原微生物。因此，在条件允许的情况下，最好设置洗涤室。室内应备有加热器、蒸锅，洗刷器皿用的盆、桶等，还应有各种瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等。 （三）灭菌室 灭菌室主要用于培养基的灭菌和各种器具的灭菌，室内应备有高压蒸汽灭菌器、烘箱等灭菌设备及设施。（四）无菌室 无菌室也称接种室，是系统接种、纯化菌种等无菌操作的专用实验室。在微生物工作中，菌种的接种移植是一项主要操作，这项操作的特点就是要保证菌种纯种，防止杂菌的污染。在一般环境的空气中，
由于存在许多尘埃和杂菌，很易造成污染，对接种工作干扰很大。1. 无菌室的设置 无菌室应根据既经济又科学的原则来设置。其基本要求有以下几点： （1）无菌室应有内、外两间，内间是无菌室，外间是缓冲室。房间容积不宜过大，以便于空气灭菌。最小内间面积2×2.5＝5m2，外间面积1×2＝2m2，高以2.5m以下为宜，都应有天花板。 （2）内间应当设拉门，以减少空气的波动，门应设在离工作台最远的位置上；外间的门最好也用拉门，要设在距内间最远的位置上。（3）在分隔内间与外间的墙壁或“隔扇”上，应开一个小窗，作接种过程中必要的内外传递物品的通道，以减少人员进出内间的次数，降低污染程度。小窗宽60cm、高40cm、厚30cm，内外都挂对拉的窗扇。（4）无菌室容积小而严密，使用一段时间后，室内温度很高，故应设置通气窗。通气窗应设在内室进门处的顶棚上（即离工作台最远的位置），最好为双层结构，外层为百叶窗，内层可用抽板式窗扇。通气窗可在内室使用后、灭菌前开启，以流通空气。有条件可安装恒温恒湿机。 2. 无菌室内设备和用具 （1）无菌室内的工作台，不论是什么材质、用途的，都要求表面光滑和台面水平。 （2）在内室和外室各安装一个紫外灯（多为30W）。内室的紫外线灯应安装在经常工作的座位正上方，离地面2m，外室的紫外线灯可
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
病原微生物快速检测箱 内置 单元 配置物品数量主要技术规格配置依据 快速检测试剂单元炭疽抗体快速检测试剂1包注册证书，10人份卫生装备参考目录炭疽抗原快速检测试剂1包注册证书，10人份卫生装备参考目录鼠疫抗体快速检测试剂1包注册证书，10人份卫生装备参考目录鼠疫抗原快速检测试剂1包注册证书，10人份卫生装备参考目录土拉热抗体快速检测试剂1包注册证书，10人份卫生装备参考目录土拉热抗原快速检测试剂1包注册证书，10人份卫生装备参考目录布鲁氏菌抗体快速检测试剂1包注册证书，10人份卫生装备参考目录布鲁氏菌抗原快速检测试剂1包注册证书，10人份卫生装备参考目录鼻疽抗体快速检测试剂1包注册证书，10人份卫生装备参考目录鼻疽抗原快速检测试剂1包注册证书，10人份卫生装备参考目录类鼻疽抗体快速检测试剂1包注册证书，10人份卫生装备参考目录类鼻疽抗原快速检测试剂1包注册证书，10人份卫生装备参考目录A型肉毒毒素快速检测试剂1包注册证书，10人份卫生装备参考目录B型金球肠毒素快检试剂1包注册证书，10人份卫生装备参考目录 现场采样设备单元一次性注射器10支5ml 卫生装备参考目录采血管10支5ml非抗凝卫生装备参考目录一次性采血针10支7# 卫生装备参考目录脑脊液管50个2ml 卫生装备参考目录碘药水棒1盒0.5%有效碘卫生装备参考目录医用棉签1包略卫生装备参考目录酒精棉球1盒医用，独立包装卫生装备参考目录止血带1根医用卫生装备参考目录医用乳胶手套2副医用，一次性，独立包装卫生装备参考目录医用防护口罩4个N95口罩卫生装备参考目录 现场采样辅助用品单元医用垃圾袋2个一次性，防护生物污染卫生装备参考目录剪刀1把12.5cm直尖卫生装备参考目录敷料镊1个12.5cm 卫生装备参考目录记号笔1支略卫生装备参考目录签字笔1支略卫生装备参考目录
显色培养基在几种食源性致病菌快速检测中的应用 显色培养基是一种鉴定微生物的快速检测技术，它的原理是通过在培养基中加入微生物自身代谢生产的酶，根据相应显色底物反应的颜色对菌种进行判断与鉴定。显色培养基较传统培养基具有灵敏度高、特异性大的优点，是一种新型的分离培养。大肠杆菌显色培养基、沙门氏菌培养基、金黄色葡萄球菌显色培养基、弧菌显色培养基、李斯特菌显色培养基等这几种食源性致病菌已经有效、广泛应用于食品、环境卫生、医药等领域，取得了一定的成效。但显色培养基尚还存在一些假阳（阴）等问题，这就影响了检测的结果，因此还需要进一步的研究。 标签：显色培养基；食源性致病菌；快速检测；应用 随着人们生活水平逐渐的提高和近年来一系列食品安全问题的出现，食品的安全问题越来越受到人们的重视。食品安全问题与微生物密切相关，微生物可造成食品环境的污染，因此，微生物的检测技术已经成为检测食品安全问题的重要工具。微生物传统的检测方法耗时长，操作步骤繁琐，已经不能满足当今食品、环境卫生、医药等领域检测的需要。研究各种新型微生物的检测技术，提高检测的效率是有效预防和控制各种微生物感染的有效措施[1]。本文就显色培养基在大肠杆菌显色培养基、沙门氏菌培养基、金黄色葡萄球菌显色培养基、弧菌显色培养基、李斯特菌显色培养基等食源性致病菌快速检测中的应用进行研究总结。显色培养基的原理是通过在培养基上加入微生物自身代谢产生的酶的底物，底物是由发色基团和微生物可代谢物质组成，为无色，但在特异性酶作用下游离出发色基团并显示一定颜色，直接观察菌落颜色，对菌种做出鉴定，减少了对菌株进行纯培养和进一步生化鉴定的步骤[2]。 1 几种食源性致病菌应用显色培养基快速检测的近况 1.1 显色培养基在大肠杆菌应用的研究研究表明，绝大多数的大肠杆菌具有β-D-葡萄糖苷酸酶（β-D-Gud），利用β-葡萄糖醛酸酶分解底物，使色源游离出来显色而区分大肠杆菌和其它的细菌。沙门菌、志贺氏菌和耶尔森氏菌不能产生β-D-Gud，因此可以利用β-D-Gud底物有效检测大肠杆菌。底物被β-D-Gud 水解后产生显色物质使菌落呈现特殊的蓝色或黄色。显色酶的底物通常是苯酚的衍生物，如有o （p）-硝基酚、p-硝基苯酚、羟基吲哚、5-溴- 4-氯- 3-吲哚、5-溴-6-氯-3-吲哚、6-氯-3-吲哚、N-甲基吲哚、5-碘-3-吲哚等的化合物[3]。 1.2 显色培养基在沙门氏菌应用的研究沙门氏菌是一类重要的食源性致病菌，它能够产生辛酯酶，除沙雷氏菌属外，其它各属细菌不具备这一功能，因此可以鉴别沙门氏菌属和其它肠菌科细菌。根据这一原理，以丙烯乙二醇和5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D半乳糖吡喃糖苷酸（X-GAL）为底物来检测沙门氏菌，沙门氏菌能水解乙二醇产酸，但不能水解X-GAL，在培养基上产生特殊的红色菌落。这种显色方法具有敏感性高、特异性高的特点，操作步骤较为简单、检测效率高[4]。 1.3 显色培养基在金黄色葡萄球菌应用的研究金黄色葡萄球菌是食源性致
食品检测实验室仪器设 备的配置 -CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
食品检测实验室仪器设备的配置 近年来食品安全及品质问题越来越受到人们的关注。这里说的食品是广泛意义上的食品，包括初级农产品，如：粮谷、油料籽、蔬菜、水产品、畜禽产品、水果等，也包括加工后的食品，如：罐头、火腿肠、食用油、方便面、酱菜、调味品等。开展食品检测的实验室也越来越多。在这些实验室中由于性质不同，检测的项目不同，而对实验室筹建和发展过程中对仪器的购置和选型有着不同的要求。根据这些年工作经验和对各种实验室检查的体会，对食品检测实验室仪器设备的配置提出个人的一点粗浅建议，供有关人员参考。 一、食品企业及商业第三方实验室 1. 企业实验室 企业实验室可根据生产的产品品种、检测项目的多少和生产规模的大小设置，实验室仪器设备的配置也可繁、可简。对于这样的实验室，仪器设备的配置能满足企业产品品质检测就行了。 食品检验可分为两大项，一是检测产品的品质项目；二是检测产品的卫生项目，这一类项目的检测相对难度大、投资高。 （1）品质项目包括：水分、含盐量、含糖量、蛋白含量、脂肪含量、纤维含量、维生素含量、酸度等。对于这些项目的检测，如果经费有限，都可以采用化学法分析，只需配置最简单的烘箱、水浴、电炉、搅拌器、粉碎机、pH计等设备即可。如果经费充足或检验批次较多，对应的检测项目都有对应的专用仪器可供选购。此外，也有一些通用的仪器可供选购，如：紫外/可见分光光度计、近红外分析仪、自动滴定仪等。检测维生素A、E等有时还需配置荧光光度计。检测营养元素，如钙、锌、铁等，可购置原子吸收仪-火焰检测器。 （2）卫生项目包括：微生物、添加剂、有害元素、农药残留、兽药残留、毒素等。对于一般食品企业，微生物检测实验室应该建。 a）微生物 建微生物实验室要按照生物实验室规范标准要求进行布局。必要的设备有洁净台、培养箱、高压灭菌锅、电炉等，其它设备则根据具体检测项目配置。经费少可以买国产的，经费多可以考虑买进口的，两者的价钱相差很多。 b）添加剂和有害元素
(一)、概述 食用被微生物污染的食品而导致的疾病，称作食源性疾病。导致这类疾病的微生物叫食源性致病菌。随着人们居住和卫生条件的不断改善，以及抗生素的滥用，人类对病菌的抵抗能力却在不断下降，食源性疾病一直呈上升的趋势。因此，对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性，常规的检验大多依靠培养目标微生物的方法来确定食品是否受到此微生物的污染，这些方法需要一定的培养时间，少则2～3天，多至数周，才能确定。而现行有效的一些快速检测方法不仅可以大大缩短检测时间提高微生物检出率并可用于微生物计数、早期诊断、鉴定等方面，以做到快速、简便、准确。快速方法包括了微生物学、分子化学、生物化学、生物物理学、免疫学和血清学等领域。 （二）、常见、常用的快速、简便的检测微生物数量的方法如下： 1、活细胞计数的改进方法 （1）、旋转平皿计数方法 （2）、疏水性栅格滤膜法（HGMF）或等格法（isogrid method） （3）、血膜系统（Pertrifilm） （4）、酶底物技术（ColiComplete） （5）、直接外荧光滤过技术（DEFT） （6）、“即用胶”系统（SimPlate） 2、用于估计微生物数量的新方法 （1）、阻抗法 （2）、A TP生物发光技术 3、其他方法 （1）、微量量热法 （2）、接触酶测定仪 （3）、放射测定法 （三）、食品中沙门氏菌的快速筛检方法 1、沙门氏菌显色培养基法 2、免疫学方法 3、分子生物学方法 4、自动传导法 （四）、大肠杆菌O157：H7快速检测方法 大肠杆菌O157：H7肠出血性大肠杆菌的主要血清型，自1982年在美国被分离并命名以来，陆续发现本菌与轻度腹泻、溶血性尿毒综合症、出血性肠炎、婴儿猝死综合症等多种人类病症密切相关，是食源性疾病的一种重要致病菌。E.coli O157：H7属于肠杆菌科埃希氏菌属，为革兰氏阴性杆菌，有鞭毛。近年来作为食品卫生及流行病学的研究热点，E.coli O157：H7的分离和鉴定方法已取得了较大进展。利用其生化特征、免疫原性建立的方法以及现代分子生物学技术的应用，可以从多方面对E.coli O157：H7进行检测。 1、E.coli O157：H7鉴别培养基及显色培养基 2、免疫学检测方法 3、分子生物学方法 （五）、金黄色葡萄球菌的快速检测方法 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈普通串状排列无芽孢，无鞭毛，不能运动。该菌在自然界中分布广泛，如空气、水、土壤、饲料和一些物品上，是最常见的化脓性球菌之一，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌食物中毒是其肠毒引起的，目前已确认的肠毒素至少有A,B,C1,C2,C3,D,E和F8个型。由金黄色葡萄球菌肠毒素引发的中毒爆发事件，近年来
牛奶中三种常见食源性致病菌快速检测方法的建立食源性疾病是全球最重要的公共卫生问题之一,导致食源性疾病的有病原微生物、寄生虫及其代谢产物、天然毒素以及化学性有毒有害物质等等。微生物引起的食源性疾病是全球食品安全面临的最重要挑战之一。 在发达国家70%～80%的细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的,在我国甚至 达到90%;引起沙门氏菌中毒的食品中,蛋类、奶类等动物性产品约占90%,沙门氏菌生存能力较强,可在乳制品中生存几个月。单增李斯特菌广泛存在于自然界中,且在冷藏温度4℃下依然能够生长,引起单增李斯特菌食物中毒的食品主要有: 奶及奶制品、肉制品、水产品、蔬菜及水果,其中以乳制品最为常见,单增李斯特菌能够给高风险人群带来严重的感染性疾病。 志贺氏菌又称痢疾杆菌,是引起人类细菌性痢疾中最为常见的食源性致病菌,该菌也是食品卫生相关法规及标准中要求必须检测的项目之一。本文以牛奶中常见的食源性致病菌单增李斯特菌、沙门氏菌和志贺氏菌为目标菌种,利用环介导等温扩增技术和高分辨率熔解曲线技术建立了多重LAMP检测体系和多重 HAND-HRM检测体系,结果如下:1.针对单增李斯特菌溶血素蛋白(hly)基因、沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因和志贺氏菌侵袭性质粒抗原H(ipaH)序列的高度保守序列设计引物,通过引物筛选分别建立了三种食源性致病菌的LAMP反应体系。 进一步经过引物筛选,及对影响反应效率和特异性的镁离子浓度、甜菜碱浓度、引物浓度进行优化,建立了多重LAMP反应体系。对多重LAMP反应体系进行特异性和灵敏度检测。 在特异性检测中含有目标菌的模板出现扩增,空白对照和非目标菌均未发生特异性扩增,提示该多重LAMP反应体系特异性强。在灵敏度检测中单增李斯特菌
食品中常规致病菌快速检测（恒温扩增芯片法） 1范围 本标准规定了食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌和侵袭性大肠埃希氏菌的快速检测方法。 本标准适用于食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌和侵袭性大肠埃希氏菌的快速检测。 2术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 微流控芯片microfluidic chip 利用微加工技术，在硅、石英玻璃或高分子材料等基质上加工出各种微细结构，如管道、反应池、微泵、微阀等功能单元，进行样品的处理和分子的微系统。 3设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1冰箱：2℃~5℃、-20℃±5℃。 3.2恒温培养箱：36℃±1℃。 3.3均质器。 3.4漩涡震荡仪。 3.5电子天平：感量0.1g。 3.6水浴锅：能升温至95℃。 3.7高速离心机：12000rpm/分钟。 3.8瞬时离心机。 3.9生物安全柜。 3.10微型分光光度计。 3.11恒温扩增仪。 3.12微流控芯片。 3.13低速离心机。 3.14微量移液器。 3.15无菌离心管：1.5ml、200ul。 3.16无菌吸管：50ml。 3.17锥形瓶：容量1000ml、500ml。 3.18量筒：容量500ml。 3.19擦镜纸。
4 培养基和试剂 4.1食源性致病菌加强型培养基：配置方法见附录A 中A.1。4.2适用型核酸提取试剂盒。 4.3生理盐水：配置方法见附录A 中A.2。 4.4 适用型核酸检测试剂盒（生物芯片法）：碟式芯片结构示意图，见图 1。 图1 碟式芯片结构示意图 5 检测程序 食品中常规致病菌的快速检测程序，见图2。 样本前处理 25g （mL ）样品+225mL 食源性共増菌培养基36℃±1℃，16h ～20h 取100ul 共増菌培养液收集菌体，提取核酸浓度范围50pg/ul~50ng/ul 配置反应体系，上芯片上机 芯片离心 样本
附件１: 标准快速检测室建设方案一、区域功能划分 表1 区域功能划分表 序号区域分类区域名称功能 1 理化分析样品制备区样品制备 2 样品前处理区实施农残、药残、添加剂等项目检测过程中得提取、净化等步骤 3 样品测试区实施农残、药残、添加剂等项目检测过程中得测试步骤 区域设计示例: 装修基本要求：样品室：地面平整、防滑,墙面为乳胶漆，有防鼠设施与空调。 理化实验室:地面平整、防滑防腐,墙面为乳胶漆，有空调。二、快速检测实验室家具配置 表2 快速检测实验室家具配置表 序号设备名称用途 １实验边台操作台面 ２中央台操作台面 3 试剂柜存放固体试剂 ４样品柜存放样品 5 器皿柜（架）存放玻璃器皿 6 冰箱(带冷冻) 存放样品与试剂 ７通风系统实验室通风 ８台式冲眼发生化学伤害时急救 9 不锈钢台微生物检验 10 吧台椅可升降(实验室用) 11 办公桌椅办公 12 文件柜存放文件 三、设备选型及配置
四、检测项目
附件２: 简易快速检测室检测建设方案一、区域功能划分 二、快速检测实验室家具配置 三、设备选型及配置
四、检测项目 备注:以上快速检测项目供参考，各地可根据实际情况确定检测项目。 附件3－1: 食品安全快速检测工作流程(参考）
附件 快速检测室管理规定(参考) 一、工作人员进入检测室应穿工作服(白色长褂),戴口罩。实验时要认真负责，严格遵守操作规程,实验中不得擅离工作岗位。 二、不得在检测室处理与检测工作无关得业务，不准放置与检测无关得物品,保持室内清洁卫生。 三、检测室内得仪器设备、试剂、用具等要建帐登记，专人保管,实验用器皿要分类存放,并做好消毒杀菌、无害化处理工作。 四、检测试剂要定位存放，标记清楚,摆放整齐,易燃、易爆、有毒物品要按照国家有关规定保管执行,受污染与过期失效试剂不得使用。 五、不准由下水道排放引起堵塞得杂物以及能引起污染、腐蚀得废试剂。 六、抽检样品必须就就是两人以上，按程序抽样,按要求贮存,检测人员抽取样品后,应及时检测与公示。 七、检测工作结束后,工作人员要认真做好记录。
病原微生物检测新方法 检测高致病性病原微生物样本时存在前处理困难，步骤多、时间长、重复性与可扩展性差、需要高温灭活等问题，所以在临床实验室难以实现标准化。自动聚焦声学技术是在传统超声波处理基础上的技术革新，聚焦声波能够以极低的能量输入获得良好的样本处理结果，避免传统超声能量过剩可能引起的样本处理过度及热损伤。 AFA技术在DNA剪切中的准确稳定的表现使其在NGS领域备受推崇。其实该技术在微量珍贵以及难处理的医学样本制备中也有不俗的表现，可有效提高生物大分子得率，获得足够且高质量的核酸样本用于下游分析。这是现有条件下提高检测灵敏度的有效手段，可减低可疑或者假阴性结果。 有数据表明：对于珍贵/微量及难处理的样本，基于AFA聚焦超声技术的生物大分子制备方案，其优势不仅仅表现在得率，纯度，完整性等表面价值，更重要的是提升了下游数据价值：1.qPCR 扩增效率提高；2医学样本如痰液中病毒核酸有效释放；3宏基因组样本有效破碎以便下游检出更多革兰氏阳性菌；4
文库复杂度提升，基因密集区以及GC富含区测序深度提升；5融合基因检出提升等。 呼吸道合胞病毒（Human Respiratory Syncytial Virus, RSV）是一种RNA病毒，可导致发热、鼻炎、咽炎及上呼吸道感染等症状。在老年人患者中，病毒载量较低，为了保证检测的准确性，需要灵敏度更高的检测方法如RT-PCR法。 在呼吸道合胞病毒的鉴定案例中，比较了聚焦超声技术(AFA)处理痰液结合MNAzyme探针法与Glass beads研磨方法处理痰液结合探针法对RSV病毒提取及扩增效率的影响。 结果显示，与Glass beads方法相比，经Covaris AFA超声法处理后提取的核酸样本，检测到的Ct值明显减小(变化范围1.0 - 4.0 log)，即经Covaris AFA 超声法处理的样本提取的病毒RNA得率更高。尤其是在7号样品中，使用Glass beads方法处理的样本，检测RSV-B呈阴性，而Covaris方法处理的样本检测结果为阳性。 在这个案例中，Covaris AFA超声法处理痰液的时间仅为30秒。这是因为聚焦超声技术的声波频率（500kHz）远远高于普通水浴超声，集中的能量可以
食源性致病菌快速检测方法研究报告 发表时间：2011-05-13T14:13:40.207Z 来源：《中外健康文摘》2011年第5期作者：高友中 [导读] 目的应用酶联免疫吸附实验（ELISA）快速检测奶类及肉类制品中沙门菌。 高友中（湖南省岳阳县疾病预防控制中心 414100） 【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2011)5-0106-02 【摘要】目的应用酶联免疫吸附实验（ELISA）快速检测奶类及肉类制品中沙门菌。方法样品经增菌后，用ELISA法及国标法对样品中的沙门菌进行初步检测，并比较ELISA法检测结果与国标法灵敏性、特异性、符合率。结果检测200份奶类制品和肉制品，经ELISA法检测阳性率为8.3%，国标法阳性率为6.7%。ELISA法敏感性、特异性分别为100%、97%，与国标法符合率达99.3%。结论 ELISA法可快速、方便的对食品中沙门菌的污染情况进行初步检测，灵敏度高、特异性好，与国标法符合率高。适用于食品中沙门菌的初步检测。 【关键词】奶制品肉制品沙门菌 ELISA 沙门菌为常见的引起食源性疾病爆发的病原菌，在我国微生物性食物中毒中一直位居首位，而受沙门菌污染的奶、肉制品为造成人类感染的主要来源，因此沙门菌一直为医疗卫生、食品卫生及商检部门重点检验对象之一[1]。本研究采用ELISA法检测奶、肉制品中沙门菌，并与国标法进行比较研究，现报道如下： 1 材料与方法 1.1实验材料 奶、肉制品分别来自本市8家不同超市，包括70份奶及奶制品样本，60份肉及肉制品样本。取样均采取随机抽样的方法进行。每份样品250ml或250g，经无菌包装后置冷链保存送实验室检测。 缓冲蛋白胨水，氯化镁孔雀绿增菌液，四硫酸钠煌绿增菌液，亚硒酸盐胱氨酸增菌液，亚硫酸铋琼脂，DHL琼脂，HE琼脂，WS琼脂，SS琼脂，三糖铁琼脂，蛋白陈水、靛基质试剂，尿素琼脂（pH7.2)，氰化钾（KCN）培养基，氨基酸脱梭酶试验培养基，糖发酵管，ONPG培养基，半固体琼脂，丙二酸钠培养基，沙门氏菌因子血清。均按国标相关规定进行。 ELISA相关试剂均购自试剂公司。 1.2实验方法 样品按国标法相关规定预先增菌。样品处理后于36°C培养4h，转种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液中，42°C18-24h，另取10ml转种于亚硒酸盐胱氨酸增菌液中，36°C18-24h。 ELISA法简要步骤如下：特异性抗沙门菌单克隆抗体包被，加入待见样品检测。显色于酶标仪上读取OD值。 国标法简要步骤如下：经增菌后，划线接种于亚硫酸铋琼脂平板和EHL琼脂平板。36°C培养18-24h，观察菌落生长情况。挑选可疑菌落接种于三糖铁琼脂，鉴别反应结果。如出现异常结果，按国标相关规定选择补做甘露醇和山梨醇试验，ONPG等。 1.3数据分析 参考田素娟[1]等的方法进行。即利用检验通用的计算方法，并国标法比较实验的敏感性、特异性、符合率。 2 结果 2.1ELISA及国标法检测结果 用ELISA法同步检测份奶、肉制品的沙门菌污染情况，采用国标法进一步验证，结果见表1。 表1沙门菌污染情况检测 2.2ELISA法与国标法敏感性、特异性、符合率计算结果 表2ELISA法与国标法比较 3 讨论 3.1常规检测沙门菌方法 目前，沙门菌常用检测方法有：（1）酶快速反应检测技术。包括快速酶促反应显色培养基及自动化微生物分析仪两种方法。VITEK AMS自动微生物检测系统对细菌鉴定是基于细菌的微量生化反应，可鉴定405种细菌。（2）以免疫学为基础的检测技术。包括酶联免疫吸附实验（ELISA）；免疫磁分离技术，如王海明[2]等报道的使用抗沙门氏菌免疫磁珠经增菌后于VITEK全自动生化鉴定仪和荧光PCR分子检测确认；免疫胶体金技术等。（3）以核酸为基础的检测技术，如杨俊超[3]等报道的使用实时荧光定量PCR与常规PCR比较研究，其敏感性、特异性均较好；依赖PCR的DNA指纹图谱技术；随机引物扩增DNA多态性（RAPD）；基因内重复性一致序列（ERIC）的扩增；多重PCR检测技术；NASBA；基因芯片技术等。 3.2本研究采用检测方法 本研究采用ELISA法快速检测奶及奶制品、肉及肉制品中沙门菌的污染情况。其敏感性、特异性较高，且与国标法符合率较高。一般24h 之内可以出检测结果。其不足之处在于：（1）不能定量检测沙门菌的含量，只能做定性分析，即是否存在沙门菌污染，但不能测得污染量的大小。后续研究考虑通过设置标准沙门菌对照（蛋白含量已知）的情况下，设立不同稀释度，然后比较样品各组OD值，用统计软件作出标准曲线，进而推算出沙门菌含量。（2）检测结果不太稳定，有可能出现假阳性结果。ELISA实验普遍存在抗体效价下降很快的通病，如
病原微生物的检测方法研究进展 摘要：本文章主要对病原微生物的检测方法研究进展进行综述，具体介绍食品、环境方面的病原微生物的检测方法研究进展。以及本人对病原微生物检测方法发展的一些看法及体会。 关键词：病原微生物检测方法PCR技术食品检测 Abstract: This article mainly summarized research progress on detection methods of pathogenic microorganism，Specific introduction food, environment research progress of methods used for the detection of pathogenic microorganisms. And I have some views on the development of pathogenic microorganism detection method and experience Key words: Pathogenic microorganisms Detection method PCR technology Food testing 病原微生物是指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，或称病原体。 病原体中，以细菌和病毒的危害性最大。病原微生物指朊毒体、寄生虫（原虫、蠕虫、医学昆虫）、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒。本文主要介绍的是在食品、环境、医药方面病原微生物检测方法的应用及研究，目的在于了解病原微生物的检测方法及其研究进展，增加生物学科普知识。 1病原微生物概述 1.1 病原微生物概念 病原微生物是指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，或称病原体。 病原体中，以细菌和病毒的危害性最大。病原微生物指朊毒体、寄生虫（原虫、蠕虫、医学昆虫）、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/ec6867446.html, PCR技术在快速检测食源性致病菌中的作用 作者：庄璐 来源：《现代食品·上》2017年第05期 摘要：现阶段，我国正以飞快的速度发展，食品微生物检测也由传统的培养方法向分子 水平过渡。通过对聚合酶链式反应（PCR）技术的研究分析可知，可以利用这种先进的快速检测技术来检验食品中的食源性致病菌，本文归纳总结了几种不同的PCR技术，旨在提供一些关于食品微生物的快速监测技术。 关键词：PCR技术；食源性致病菌；检测；应用 Abstract：China is developing at a fast pace and the detection of food microorganisms is also moving from the traditional cultivation method to the molecular level. Based on the polymerase chain reaction （PCR） for certain research analysis， can be verified in food borne pathogens using rapid detection technology which is advanced， this paper summarizes several different PCR technology，aims to provide some food on microbial monitoring technology. Key words：PCR technology； Foodborne pathogenic bacteria； Detection； Application 中图分类号：R155.5 改革开放以来，我国现代科学技术以惊人的速度发展，人们的生活水平也在逐渐提高，最直接的结果就是人们越来越重视食品，有着越来越高的要求，但近年来，食品安全问题一直威胁着人们的生命健康，这一问题已经受到了人类的高度重视。2007年，在某些速冻食品中检 测出致病菌；在我国经常提到的地沟油事件层出不穷；让人们谈虎色变的三鹿奶粉事件等，每一件事情都在提醒着人们食品安全问题的重要性和严重性。其中，微生物检测是衡量食品卫生质量的重要指标之一，因此，研究食品微生物检测的快速检测技术具有十分重要的意义。 1 传统的食源性致病菌检测方法 1.1 增菌 致病菌在食品中有着较低的污染水平，所以要以增菌或增菌的步骤为前提来根据国家标准检测食品致病菌，前增菌的实质就是把处于濒死状态的致病菌放在无选择性的培养基中，使其恢复活力，而增菌与之不同，增菌是利用选择性培养基，目的是让微生物大量繁殖，这样就会抑制其他细菌，从而为下一步的分离培养奠定基础。 1.2 分离培养
食品病原微生物快速检测技术及研究进展 王 辉，张 伟，王 燕，顾 希 （山东东营出入境检验检疫局， 山东东营 257091） 摘 要：食品病原微生物传统检验方法费时、敏感度低、特异性差；随社会和食品工业快速发展， 研究和建立食品病原微生物快速检测方法越来越受到世界各国重视。该文介绍免疫学技术、分子生物学技术、代谢技术、仪器分析技术、生物传感器技术等检测微生物基本原理，及这些技术在食品病原微生物检测中研究进展。关键词：病原微生物；食品检测；食品安全 Research progress on rapid detection technology of pathogenic microorganism in foods WANG Hui ，ZHANG Wei ，WANG Yan ，GU Xi （Dongying Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau ， Dongying 257091，Shandong ，China ）Abstract ：Co nventi o nal m et ho d are ti m e –co n sum ing ，l o w s en s itivity and h yp os en s itivity in f oo d pat ho geni c m i c r oo rgani sm dete c ti o n ，wit h t h e rapid devel o p m ent o f soc iety and f oo d pr o d uc ti o n in t h e w o rld ，s t u dy and t h e e s tabli shm ent o f f oo d pat ho geni c m i c r oo rgani sm rapid dete c ti o n te ch n o l o gy i s in c rea s ingly paid attenti o n t o by vari ous cou ntrie s. In t h i s arti c le ，t h e ba s i c prin c iple o f i mmu n o l o gy te ch n o l o gy ，mo le cu lar m i o l o gy te ch n o l o gy ，m etab o l o gy te ch n o l o gy ，in s tr um ental analy s i s te ch n o l o gy ，bi os en so rte te ch n o l o gy were intr o d uc ed ，and t h e pr o gre ss o f t h e s e dete c ti o n te ch n o l o gie s o n f oo d pat ho geni c m i c r oo rgani sm were reviewed .Key words ：pat ho geni c m i c r oo rgani sm ；f oo d dete c ti o n ；f oo d s afety 中图分类号：TS207.4 文献标识码：A 文章编号：1008―9578（2012）04―0001―05收稿日期：2012–03–06作者简介：王辉（1982~ ），男，工程师，硕士，研究方向：食品微生物快速检测。 随着世界经济全球化、贸易自由化和食品工业化迅速发展，食品安全已成为全球关注热点问题，而食品中病原微生物是影响食品安全最主要因素。食品病原微生物传统检验方法步骤非常繁琐，需耗费大量人力、物力，且检测周期长、灵敏度较低，难以满足目前国内外对食品安全检测要求。因此，研究和建立灵敏度更高、特异性更强、简便快捷食品病原微生物快速检测技术迫在眉睫。本文对目前国内外改进和开发一些病原微生物快速检测技术及其在食品方面应用进行综述。1 免疫学技术 免疫学检测技术是应用免疫学理论而设计一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌细胞因子的实验方法，其基本原理是利用抗原、抗体间能发生特异性免疫反应以检测病原。1.1 免疫荧光技术（IF T ） 免疫荧光技术是将不影响抗原、抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应抗原（或抗体）结合后，形成免疫复合物在一定波长光激发下可产生荧光，借助荧光显微镜可检测或定位被检抗原。目前免疫荧光技术可用于沙门氏菌、葡萄球菌毒素、E.Coli O157和单核细胞增生李斯特氏菌等快速检测。张晓 华等〔1〕利用副溶血弧菌免疫家兔制备多克隆血清，建立中国对虾病原菌―副溶血弧菌间接荧光抗体检测技术，不仅可用于诊断发病感染对虾，也可用于检测带菌状态或未发病感染对虾。1.2 酶免疫技术 酶免疫技术是利用抗原、抗体反应高度特异性和酶促反应高度敏感性，通过肉眼或显微镜观察及分光光度计测定，达到在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体部位，及对其进行定量目的。根据抗原、抗体反应是否需要分离结合和游离酶标记物而分为均相和非均相两种类型。非均相法较常用，包括液相与固相两种免疫测定法。非均相酶固相免疫测定法即ELISA 在目前应用最为广泛。Cryan 等〔2〕在研究大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli.）内毒素时，将ELISA 法与DNA 探针技术等进行比较，发现ELISA 技术更灵敏、快速。此外，ELISA 法还可用于食品介导病毒检测。葛翠翠等〔3〕使用双抗夹心ELISA 检测食品中大肠杆菌O157∶H7，结果表明，该法稳定性、重复性良好，对纯培养菌液检出限为105 cfu/mL，具有良好敏感性及特异性。杨静〔4〕等用沙门氏菌特异性单克隆抗体CB8和de7建立直接检测沙门氏菌方法，即用被检样品直接包被ELISA 板固定加酶标抗体作用一段
微生物检测手段及注意事项
微生物检测手段及注意事项 微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文对生长量测定法、微生物计数法、生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常用的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其他生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，通常情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长通常指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和他们的生长抑制紧密相关。所以有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而
测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，可以从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 1. 微生物计量法 1.1 体积测量法 又称测菌丝浓度法，通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10 mL）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5 min）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法 可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10~20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1~5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40 ℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（Activity Dry Yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。